姜欣　舒俊俊　舒如明

[摘要]目的 探討限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）檢測(cè)亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，為子癇前期的防治提供依據(jù)。方法 選取2016年5月～2017年6月我院收治的子癇前期患者100例（病例組）、健康孕婦500例（對(duì)照組）作為研究對(duì)象，進(jìn)行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性分析、基因多態(tài)性檢測(cè)，并進(jìn)行血液生化指標(biāo)分析，調(diào)查基本資料，進(jìn)行因素分析。結(jié)果 病例組患者所有測(cè)序都獲得成功，對(duì)照組測(cè)序成功498例。兩組患者的基因型頻率、等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者的初中及以下文化水平、有計(jì)劃妊娠、有計(jì)劃控制飲食與補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增補(bǔ)葉酸、補(bǔ)充過(guò)維生素D、營(yíng)養(yǎng)不良等因素的例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。病例組患者的APPT低于對(duì)照組，Hcy高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多因素分析采用Logistic回歸分析，結(jié)果提示，等位基因TT、增補(bǔ)葉酸、孕期有計(jì)劃的運(yùn)動(dòng)成為獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），TT型與Hcy、APPT存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與子癲前期有關(guān)且存在獨(dú)立作用，可能與其可提高Hcy有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]子癇前期；GC基因；基因多態(tài)性；發(fā)病機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R714.245 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）11（b）-0086-04

[Abstract]Objective To investigate the restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction （cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP） in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia，provide the basis for the prevention and treatment of preeclampsia.Methods 100 preeclampsia （the case group） and 500 healthy pregnant women （the control group） from May 2016 to June 2017 treated in our hospital were selected as subjects to conduct polymorphism analysis of methylenetetrahydrofolate reductase gene and detect of gene polymorphism.Blood biochemical indexes were analyzed，basic data was investigated and factors were analyzed.Results All cases were successfully sequenced in the case group，and 498 cases were successfully sequenced in the control group.The genotype frequency and allele frequency of the case group were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.The the number of junior high school degree and below level，planned pregnancy，planned to control diet and nutritional supplements，folic acid，vitamin D supplements，the proportion of malnutrition were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.APPT in the case group was lower than that in control group，and Hcy was higher than that in control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.Logistic regression analysis was used for multivariate analysis.The results showed that allele TT，folic acid supplementation and planned exercise during pregnancy were independent risk factors （P<0.05）.There was significant correlation between TT type and Hcy and APPT （P<0.05）.Conclusion Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms are associated with preeclampsia and have independent effects，which may be related to the elevation of Hcy.endprint

[Key words]Preeclampsia；GC gene；Gene polymorphism；Pathogenesis

子癇前期是人類(lèi)妊娠期特有疾病，發(fā)生率為7%～12%，我國(guó)平均為9.4%，嚴(yán)重威脅母嬰健康，是導(dǎo)致怒因死亡的主要原因之一[1]。子癇前期的病因尚未被闡明，可能與遺傳、免疫失衡、血管內(nèi)皮損失、纖溶系統(tǒng)失衡、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等因素有關(guān)。葉酸與鈣磷代謝、骨礦物化、免疫功能等因素關(guān)系密切，有報(bào)道顯示其與子癇前期關(guān)系密切，葉酸缺乏孕婦更容易出現(xiàn)子癇前期[2-3]。故，有理由認(rèn)為葉酸代謝相關(guān)通路的基因及其多態(tài)性可能會(huì)影響子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。本研究選取我院收治的子癇前期100例、健康孕婦500例作為研究對(duì)象，進(jìn)行亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性分析和基因多態(tài)性監(jiān)測(cè)，分析基因多態(tài)性是否起到獨(dú)立作用，嘗試分析基因多態(tài)性與維生素D、子癇前期之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年5月～2017年6月我院收治的子癇前期患者100例、健康孕婦500例作為研究對(duì)象。子癇前期患者100例納入病例組，年齡（29.4±2.5）歲，孕次（1.9±0.7）次，采血周（14.4±1.2）周。健康孕婦500例納入對(duì)照組，年齡（29.0±3.2）歲，孕次（1.8±0.5）次，采血周（14.2±1.5）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床確診；②年齡18～45歲；③妊娠8～12周確認(rèn)并建立圍生期保健卡對(duì)象；④成功分娩；⑤無(wú)認(rèn)知精神障礙，否熱重大疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①軀體疾病或其他急慢性疾??；②懷孕前恐懼癥、強(qiáng)迫癥等精神心理疾??；③無(wú)法閱讀問(wèn)卷的內(nèi)容，無(wú)法配合調(diào)查。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核及同意，患者均知曉本研究情況并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1血樣采集與其他指標(biāo)分析 采血前夜22：00禁食，次日晨起8：00采血，采用真空采血法，采集肘部靜脈血5 ml，平均分為3份。1份不進(jìn)行抗凝，先進(jìn)行血脂監(jiān)檢測(cè)，檢測(cè)患者總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）等指標(biāo)。同時(shí)采用問(wèn)卷調(diào)查方法，在產(chǎn)后調(diào)查孕婦的孕期保健情況，包括增補(bǔ)葉酸情況、維生素D補(bǔ)充情況、接觸毒害物質(zhì)情況等。

1.2.2基因多態(tài)性分析 ①提取DNA：采用天根公司提供的DNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，監(jiān)測(cè)DNA純度，取1 μl DNA樣本，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA OD260 nm/280 nm值，在標(biāo)準(zhǔn)范圍1.7～2.0內(nèi)為合格的樣本，可進(jìn)行PCR檢查，否則需要重新提取。②PCR-RFLP檢測(cè)：通過(guò)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)確定MTHFR多態(tài)位點(diǎn)相關(guān)信息，選擇內(nèi)切酶在線(xiàn)分析軟件，選擇對(duì)應(yīng)限制內(nèi)切酶，進(jìn)行PCR-RFLP檢測(cè)，MTHFR（rs4846049），引物序列F：5′-CCCCTTCAGTCACAAGTAGGTGG-3′，R：5′-CCTCC AGAGCCAGCCTGAGAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度177 bp。③提取凝膠中的目的DNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。PCR擴(kuò)增條件：首先配置Superminx，混勻到反應(yīng)管中，每管24 μl，加入DNA模版液1 μl。PCR反應(yīng)體系總量50 μl，內(nèi)含10×PCR緩沖液2.5 μl，10 mM dNTP混合液0.5 μl，50 mM MgCl2 0.8 μl，PrimerF（5 uM）1 μl，PrimerR（5 uM）=1 μl，DNA模板液1 μl，PlatinumR.Taq DNA聚合酶0.2 μl，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃終末延伸5 min，4℃保存。④PCR產(chǎn)物鑒定以及測(cè)序，2%瓊脂凝膠鑒定，采用DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3觀察指標(biāo)

比較兩組GC通路上不同位點(diǎn)的多態(tài)性結(jié)果。分析多因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義位點(diǎn)多態(tài)性是否起到獨(dú)立作用，起到獨(dú)立作用的位點(diǎn)多態(tài)性在糾正年齡等因素后，是否與維生素D等指標(biāo)存在相關(guān)性[6]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者基因型頻率、等位基因頻率的比較

病例組所有測(cè)序都獲得成功，溶解濃度0.10～0.25 μg/μl，DNA分子量>50 kb，對(duì)照組測(cè)序成功498例。兩組的基因型頻率、等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 Logistic回歸多因素分析

2.2.1兩組單因素分析

兩組的初中及以下文化水平、有計(jì)劃妊娠、有計(jì)劃控制飲食與補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、增補(bǔ)葉酸、補(bǔ)充過(guò)維生素D、營(yíng)養(yǎng)不良等因素的例數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.2.2兩組患者各因素的比較

病例組APPT低于對(duì)照組、Hcy高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

將以上因素作為自變量，是賦值為2，否賦值為1，基因型頻率賦值方法CC=1，CT=2，TT=3，APPT、葉酸則采用原值賦值，以是否為子癇前期作為因變量，是賦值為2，否賦值為1，采用Logistic回歸進(jìn)行多因素分析。結(jié)果提示，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]、增補(bǔ)葉酸[OR=0.67，95%CI（0.42～1.10）]，孕期有計(jì)劃的運(yùn)動(dòng)[OR=0.47，95%CI（0.48～1.37）]成為獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。endprint

2.3 TT型與Hcy、APPT的相關(guān)性分析

經(jīng)分析，TT型與Hcy、APPT存在顯著相關(guān)性（P<0.05）（表4）。

3討論

本研究結(jié)果提示，子癇前期是多因素共同作用的結(jié)果，與基因多態(tài)性、孕期保健情況等因素有關(guān)[7]。亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病存在顯著相關(guān)性，且起到了獨(dú)立的作用，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]成為獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。TT型與Hcy、APPT存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。提示，亞甲基四氫葉酸還原酶基因TT型可能對(duì)子癇前期起到促進(jìn)作用，且可能與其能夠抬高HCY、誘導(dǎo)凝血功能紊亂有關(guān)[8-10]。有報(bào)道顯示，亞甲基四氫葉酸還原酶變異型會(huì)導(dǎo)致相關(guān)通路的阻塞，使血液中的同型半胱氨酸的濃度增加，從而引起血管壁損傷，誘發(fā)溶血[11]。同時(shí)還可能導(dǎo)致葉酸缺乏，引起一系列不良反應(yīng)[12]。Meta分析也證實(shí)MTHFRC677T基因多態(tài)性與妊高癥、復(fù)發(fā)性自然流程有關(guān)，提示改基因多態(tài)性可能導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局發(fā)生[13-15]。

綜上所述，亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與子癲前期有關(guān)且存在獨(dú)立作用，可能與其可提高Hcy有關(guān)。

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（收稿日期：2017-08-28 本文編輯：孟慶卿）endprint