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輸血傳播病毒PCR-DHPLC檢測技術(shù)的建立及初步應(yīng)用

楊春華,廖蕓,羅秋紅,孫思揚(yáng),夏彪，祝建新

目的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)檢測輸血傳播病毒。方法根據(jù)輸血傳播病毒的核酸序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC檢測分析,以驗(yàn)證方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性，同時進(jìn)行臨床檢測的初步應(yīng)用。結(jié)果以乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn)，無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性；重復(fù)性良好；靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/反應(yīng)。分別應(yīng)用實(shí)時熒光PCR法、普通PCR法及本文所建立的PCR-DHPLC法同時檢測32份血清樣本，發(fā)現(xiàn)有17份樣本實(shí)時熒光PCR陽性，17份樣本PCR-DHPLC陽性，15份普通PCR陽性。結(jié)論本文建立的PCR-DHPLC法具有特異、敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于輸血傳播病毒感染的分子流行病學(xué)調(diào)查。

輸血傳播病毒；PCR-DHPLC；實(shí)時熒光PCR

Torque Teno virus首次發(fā)現(xiàn)于1997年，其存在于輸血后感染肝炎(非甲-戊型)的病人血清中，因此該病毒被命名為輸血傳播病毒，曾一度被認(rèn)為這是一種新型肝炎病毒，對人引起不同程度的肝損傷[1]。之后，各國科研人員陸續(xù)于在不同的哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病毒[2]，證實(shí)其是一種人獸共患病。輸血傳播病毒可通過多種途徑傳播，在人群中感染率較高，各國學(xué)者經(jīng)過大量研究證明，輸血傳播病毒像戊型肝炎病毒一樣呈全球流行分布[3]。該病毒確切的致病機(jī)理尚不明確，不過大部分研究認(rèn)為其可能與肝臟疾病、肺部疾病及血液疾病相關(guān)[4]。

輸血傳播病毒是指環(huán)病毒科(Anelloviridae)的成員，無囊膜，是一種單股負(fù)鏈環(huán)狀小DNA病毒，病毒粒子為二十面體，直徑30～32 nm[1]。在氯化銫(CsCl)溶液、糞便、膽汁中的浮密度約為1.31～1.35 g/cm3，在蔗糖中的浮密度稍低，為1.26 g/mL[1-3]?；蚪M大小為2.8 kb～3.9 kb，基因組長度因病毒感染宿主不同而略有差異[5]。輸血傳播病毒變異率極高，無論是在核苷酸水平還是氨基酸水平，各毒株序列之間都有著廣泛的多樣性[6]，但其非編碼區(qū)的核酸序列卻相對保守，這些特點(diǎn)給研究人員提供了檢測該病毒并進(jìn)行分型的可能性。

當(dāng)前，對于病毒的檢測應(yīng)用較為廣泛的有基于血清的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)，基于核酸的PCR類方法。有研究人員根據(jù)輸血病毒核酸片段進(jìn)行克隆并原核表達(dá)蛋白建立ELISA方法，眾所周知，ELISA簡單、成本低，適合大規(guī)模樣本檢測，但靈敏度稍差。近年來應(yīng)用越來越普遍的PCR類方法逐漸成為了病毒檢測的主流技術(shù)。PCR方法因其具有快速、敏感、方便等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展較快，在各個領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，但普通PCR存在著容易出現(xiàn)假陽性且極易產(chǎn)生交叉污染等弊端[7-8]。為解決這些弊端，研究人員建立了多重PCR技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR (Real time PCR)，多重PCR技術(shù)是在同一反應(yīng)體系中加入多對引物擴(kuò)增多個基因片段，通過與標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的對比對目的基因進(jìn)行分型，從而達(dá)到檢測的目的[7]，但產(chǎn)物分析工作量大、耗時、耗力；在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，在普通PCR反應(yīng)體系中引入一條帶熒光標(biāo)記的核酸探針，規(guī)避了PCR反應(yīng)假陽性高的弊端，在實(shí)際工作中越來越廣泛，但仍有一定的局限性，比如帶熒光標(biāo)記的探針成本高、保存時間有限等[8]。PCR結(jié)合變性高效液相色譜法是將PCR方法與變性高效液相色譜技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的新型PCR類檢測技術(shù)，其流程是將樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，應(yīng)用變性高效液相色譜進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，該方法能夠識別具有個別核苷酸差別的核酸序列，從而快速識別病原。本研究通過對輸血傳播病毒核酸序列的精確分析，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，分析方法的特異性、靈敏度，并與其他常規(guī)檢測方法進(jìn)行比對，建立了輸血傳播病毒的PCR-DHPLC檢測新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1樣品 本實(shí)驗(yàn)室留存血清樣本32份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1主要儀器 全自動核酸抽提純化儀(Mag NA LC2.0，瑞士Roche公司)，基因擴(kuò)增儀(Veriti，美國ABI公司)，實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀(C1000TM，美國BioRad公司)，變性高效液相色譜(簡稱DHPLC，美國Transgenomic公司)，低溫高速離心機(jī)。

1.2.2主要試劑 三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司，乙腈(色譜純)購自Thermo Fisher公司；高保真KOD-plus-DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs(東洋紡生物科技有限公司，上海)；病毒總核酸提取試劑(Mag NA Pure LC總核酸分離試劑盒)；DNA純化回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。其它常規(guī)試劑均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.3引物的設(shè)計(jì)與合成 運(yùn)用Primer 5.0軟件(加拿大Premier公司)分析輸血傳播病毒的核酸序列，并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物為5′-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3′，下游引物為5′-TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3′，預(yù)期片段大小為90 bp。

上述引物以及文中用于克隆及方法驗(yàn)證的引物均由生工(上海)有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1病毒核酸的提取及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 取經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證的本實(shí)驗(yàn)室留存的陽性血清樣本，用核酸抽提純化系統(tǒng)提取總核酸，用50 μL無RNase水溶解，保存于-20 ℃冰箱備用。以提取的總核酸為模板，用引物對5′-ACCCAAATTGGAGATCAAGGTAT-3′和5′-TATCCGGTTTGCCTCGACTCTT-3′[10]進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，目的片段1 563 bp，用引物對5′-CCACCAAATACCTACACGCAGTC-3′和5′-CCTTAGGGTTCCACG-CGCTAATG-3′[10]進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，目的片段1 397 bp，將兩輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR、酶切鑒定，經(jīng)鑒定正確后送寶生物公司測序。

1.3.2檢測用引物篩選與反應(yīng)體系優(yōu)化 從GenBank下載所有靶基因的序列，用Primer 5.0進(jìn)行序列比對，基于TTV非編碼區(qū)核酸序列保守的特點(diǎn)，在非編碼區(qū)截取最一致的序列設(shè)計(jì)PCR-DHPLC檢測用引物對N1和N2。調(diào)整引物濃度、引物用量、Taq酶、Mg2+濃度和退火溫度等，摸索出PCR最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。

PCR反應(yīng)體系(25 μL): 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 5 μL、DNTPs(10 mmol/L)2 μL、高保真KOD-plus-DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、10倍PCR緩沖液2 μL、加水25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 7 min；94 ℃ 30 s，53.5 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.3DHPLC分析條件 上樣量：PCR產(chǎn)物3 μL；DHPLC緩沖液：緩沖液A為0.1% mmol/L TEAA；緩沖液B為0.1% mmol/L TEAA；流動相：緩沖溶液A濃度為 52.2%，緩沖溶液B濃度為 47.8%；流速：0.65 mL/min；色譜柱：C18 DNA色譜柱(4.6 mm×50 mm，粒度3 μm)；柱溫：52 ℃；檢測器：熒光檢測器(光源：150W Xenon 燈；激發(fā)譜帶寬：15 nm；發(fā)射譜帶寬：15.7 nm；檢測靈敏度：波長350 nm積分3 s)。

1.3.4特異性試驗(yàn) 取本實(shí)驗(yàn)室留存的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)陽性血清，用核酸抽提純化系統(tǒng)提取總核酸，用50 μL無RNase水溶解，與1.3.1中制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行PCR-DHPLC檢測，以PBS為陰性對照，進(jìn)行PCR-DHPLC檢測的特異性分析。

1.3.5重現(xiàn)性試驗(yàn) 取一個經(jīng)PCR、實(shí)時熒光PCR、PCR-DHPLC分析均為陽性的血清樣品，將該樣品分成6份，分別提取病毒總核酸，按照1.3.2擴(kuò)增條件和1.3.3分析條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄出峰時間及峰值，驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性。

1.3.6靈敏度試驗(yàn) 將1.3.1中制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照1.3.2擴(kuò)增條件和1.3.3分析條件進(jìn)行試驗(yàn)，確定能夠檢測出的模板最低拷貝數(shù)。

1.3.7驗(yàn)證試驗(yàn)與應(yīng)用 從本實(shí)驗(yàn)室留存的血清樣本32個，用自動核酸提取儀器提取總核酸，應(yīng)用Real-time PCR法[11]、普通PCR法[12]及本研究建立的PCR-DHPLC法同時檢測，對比檢測結(jié)果，分析方法之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1特異性試驗(yàn) 取乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)核酸與1.3.1中制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DHPLC過柱分析，檢測結(jié)果證明僅TTV結(jié)果為陽性，DHPLC分析中出現(xiàn)擴(kuò)增吸收峰；HBV、HCV和HEV未在相應(yīng)的位置出現(xiàn)擴(kuò)增吸收峰，結(jié)果均為陰性，見圖1。結(jié)果表明：本試驗(yàn)設(shè)計(jì)PCR-DHPLC檢測引物可以特異性檢測TTV，與乙HBV、HCV、HEV無交叉反應(yīng)。

1. TTV 2-4. 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒1: TTV; 2-4: HBV, HCV, HEV圖1 PCR-DHPLC檢測TTV的特異性Fig.1 Specialty detection of PCR-DHPLC for TTV

2.2重現(xiàn)性試驗(yàn) 取一個經(jīng)PCR、實(shí)時熒光PCR、PCR-DHPLC檢測均為陽性的血清樣品，分成6份，分別作為模板進(jìn)行PCR-DHPLC，分析方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見圖2，在重復(fù)樣品之間出峰時間和峰型基本重疊，陰性對照(PBS溶液)的檢測結(jié)果為陰性。

1-6. TTV 7. PBS1-6: TTV; 7: PBS圖2 PCR-DHPLC檢測 TTV的重現(xiàn)性Fig.2 Repeatability detection of PCR-DHPLC for TTV

2.3靈敏度試驗(yàn) 將1.3.1中制備的質(zhì)粒模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋后濃度分別為1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101和1拷貝/μL，以此模板進(jìn)行PCR-DHPLC。結(jié)果見表1，由表中可以看出，PCR-DHPLC檢測輸血傳播病毒的靈敏度可達(dá)到10個拷貝/μL。

表2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR-DHPLC檢測結(jié)果
Tab.2 Test results of plasmid standards by PCR-DHPLC

稀釋梯度aDilutiongradienta檢測結(jié)果Testresults第1梯度(1×107拷貝/μL)+第2梯度(1×106拷貝/μL)+第3梯度(1×105拷貝/μL)+第4梯度(1×104拷貝/μL)+第5梯度(1×103拷貝/μL)+第6梯度(1×102拷貝/μL)+第7梯度(1×101拷貝/μL)+第8梯度(1拷貝/μL)-

a：各個相鄰梯度之間的稀釋倍數(shù)為10。

Note:a,The dilution ratio between each successive gradient is 10

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)與應(yīng)用 將32份血清樣本提取總核酸，用引物對5′-CGAATGGYWGAGTTTWYGCCGC-3′和5′-GCCCGAATTGCCCCTWGACTKCG-3′及探針FAM-CTCCGGCACCCGCCCAG-VIC進(jìn)行實(shí)時熒光PCR[11]檢測、用引物對5′-GTAAGTGCACTTCCGAATGGCTGAG-3′和5′-AGCCCGAATTGCCCCTTGAC-3′以及5′-AGTTTTCCACGCCCGTCCGCAGC-3′和 5′-GCCAGTCCC-GAGCCCGAATTGCC-3′進(jìn)行常規(guī)PCR[12]檢測，同時用本試驗(yàn)所建立的PCR-DHPLC法進(jìn)行檢測，試驗(yàn)設(shè)立陽性對照(以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品)和陰性對照各2份 (以PBS溶液)，樣品編號分別為P1、P2和N1、N2。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，常規(guī)PCR有15份樣本為TTV核酸陽性；實(shí)時熒光PCR有17份樣本TTV核酸陽性，PCR-DHPLC法檢測結(jié)果與實(shí)時熒光PCR法結(jié)果一致。

表3 PCR-DHPLC方法與常規(guī)PCR、Real-time PCR方法比較
Tab.3 Comparison of the detected results of normal PCR, real-time PCR and PCR-DHPLC

樣品Sample常規(guī)PCRNormalPCRReal?timePCRPCR?DHPLC樣品Sample常規(guī)PCRNormalPCRReal?timePCRPCR?DHPLCP1+++N1---P2+++N2---1---17---2+++18+++3+++19+++4+++20+++5---21---6---22+++7-++23---8+++24---9---25---10---26---11---27-++12+++28+++13---29---14+++30+++15+++31---16+++32+++

注:“+”代表結(jié)果陽性，“-”代表結(jié)果陰性。

Note: “+” represents positive results, “-” represents negative results

3 討 論

當(dāng)前對于輸血傳播病毒的檢測主要是基于血清學(xué)診斷方法和PCR技術(shù)。血清學(xué)診斷方法指利用抗原或抗體來進(jìn)行檢測的體外免疫反應(yīng)。Catherine將TTV核酸序列的ORF1 C-末端序列進(jìn)行原核表達(dá)構(gòu)建重組蛋白，通過Western和ELISA來檢測人血清中的TTV抗體[13]。隨后，有學(xué)者將輸血傳播病毒核酸序列ORF2的部分區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá)構(gòu)建重組蛋白，并以此作為抗原，建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測方法[7]，方法簡便，但TTV的基因群和基因型眾多，各型之間交叉反應(yīng)嚴(yán)重，使得ELISA未能在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中大范圍應(yīng)用。

PCR是分子生物學(xué)中的一種常見技術(shù)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用很廣，尤其是在感染性疾病中病原的檢驗(yàn)。變性高效液相色譜(DHPLC)是將單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的雜合雙鏈檢測技術(shù)，利用離子對反相液相色譜進(jìn)行核酸片段的分離及分析，可檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。在傳染病病原的檢驗(yàn)中，利用DHPLC技術(shù)的這一特點(diǎn), 與PCR技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，達(dá)到快速檢測的目的，PCR-DHPLC可同時檢測上百個樣品，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，是一種對致病微生物檢測的有效方法，并且已經(jīng)在快速檢驗(yàn)中應(yīng)用。目前, 國內(nèi)已建立了多種病原微生物的PCR-DHPLC檢測技術(shù)，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒[17]、克雷伯氏菌[18]、阪崎腸桿菌等[19]。本研究應(yīng)用PCR-DHPLC技術(shù)檢測TTV，要同時考慮PCR和DHPLC兩者對檢測效果的影響。而其中應(yīng)用PCR檢測TTV成功的關(guān)鍵因素是引物的設(shè)計(jì)和樣品的處理。本研究在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時考慮到TTV具有高度基因變異性的特點(diǎn)[14]，未選擇以前研究人員經(jīng)常選用的ORF1的N22區(qū)，而是選擇ORF2上游核酸序列保守區(qū)，該區(qū)域可以檢測TTV的不同基因群和基因型[15-16]。同時考慮到血清樣本中含有大量的雜蛋白和其他物種DNA，采用基于磁珠吸附原理的自動核酸提取設(shè)備提取核酸，從試驗(yàn)結(jié)果來看，有效保證了樣品核酸的純度。DHPLC對檢測的影響因素主要是過柱條件的摸索，本研究通過大量的試驗(yàn)最后獲得了最佳條件。

本研究針對輸血傳播病毒建立了特異、靈敏、高通量的PCR-DHPLC檢測方法，為該病毒的快速診斷奠定基礎(chǔ)。將該方法初步用于臨床樣本的檢測中，其靈敏度與Real-time PCR相當(dāng)，低達(dá)10個拷貝/μL，而且能夠檢測出常規(guī)PCR檢測不出的樣本。同時，PCR-DHPLC法可以自動取樣，檢測每個樣品只需要8 min左右。DHPLC與其他檢測DNA突變方法最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。利用本研究建立的PCR-DHPLC檢測方法，可用于輸血傳播病毒的流行病學(xué)調(diào)查，同時也為該病毒在人體內(nèi)的感染及分布等相關(guān)研究提供了新的技術(shù)手段。

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DevelopmentandpreliminaryapplicationofPCR-DHPLCassaysfordetectionoftheTorqueTenovirus

YANG Chun-hua，LIAO Yun，LUO Qiu-hong，SUN Si-yang，XIA Biao，ZHU Jian-xin

(JiangxiEntry-ExitInspectionamp;QuarantineBureau，Nanchang330002，China)

In order to identify the Torque Teno virus (TT virus), a PCR-DHPLC assay was performed in this study. Primers specific were selected according to the characteristics of TT virus nucleic acid sequence to conduct PCR, and PCR products assayed by DHPLC. We analyzed the sensitivity, specificity, repeatability of PCR-DHPLC and applied it preliminarily on clinical detection. The specific testing was performed with TTV, HBV, HCV and HEV, no cross reaction were found, and the PCR-DHPLC assays we developed had good specification and nice repeatability. Sensitivity analysis showed that the developed PCR-DHPLC assays could detect 1.0×101copy/μL. Then we detected 32 serum samples by this method, real-time PCR and normal PCR at same time. The results showed that 17 TTV positives results could be observed by PCR-DHPLC for 32 samples, it is consistent with real-time PCR test results and 15 positive by normal RT-PCR. PCR-DHPLC assays showed nice specification, sensitivity, repeatability, and could be used in epidemiological investigation.

Torque Teno virus; DHPLC; real-time PCR

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.006

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.20151BBF60048)資助

中華人民共和國江西出入境檢驗(yàn)檢疫局，南昌 330038

Email: ellenyung@foxmail.com

R373.2

A

1002-2694(2017)11-0979-05

Supported by the Jiangxi Science and Technology Project(No.20151BBF60048)

2017-05-12編輯王曉歡