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·論著·

豬戊型肝炎病毒SYBR GreenⅡ熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應用

李幽幽1，龔雙燕1，李小璟1，毛汐語1，鄧益超1，朱玲1,2，徐志文1,2

目的建立一種快速檢測豬戊型肝炎病毒(HEV)的方法。方法針對HEVORF2基因保守序列設計1對引物，基于SYBR Green Ⅱ染料，建立了檢測HEV的實時熒光定量RT-PCR方法。結果該方法只能對豬戊型肝炎病毒檢測到熒光，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬嵴病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒均不能檢測到熒光信號，特異性好；檢測HEV時，在4.10×102～4.10×108拷貝/μL內(nèi)具有良好的線性關系，靈敏度可以達到1.00×102拷貝/μL,擴增相關系數(shù)為0.996，擴增產(chǎn)物的熔解溫度為84.0 ℃±0.1 ℃，該檢測方法組內(nèi)變異系數(shù)為0.83%～0.94%，組間變異系數(shù)為0.83%～0.94%，重復性較好。利用該方法對臨床61份來自四川各地的豬腸內(nèi)容物進行檢測，檢出9份陽性，且與常規(guī)PCR檢測方法的陽性符合率為100%。結論建立的針對HEV的熒光定量RT-PCR有效可行，對HEV的臨床檢測和進一步研究奠定了基礎。

豬戊型肝炎病毒；SYBR GreenⅡ；熒光定量RT-PCR

HEV屬于肝炎病毒科(HepeviridaeFamily)肝炎病毒屬(Hepevirus)，是單股正鏈無囊膜的RNA病毒，呈球形，直徑32～34 nm，核衣殼呈二十面體立體對稱?；蚪M長約7.2 kb，由3個開放式閱讀框架組成。HEV分為4個主要基因型[1]，HEV-1主要分布在亞洲和非洲國家；HEV-2見于墨西哥和尼日利亞；HEV-3分布于美國和歐洲國家[2]，但近年來發(fā)現(xiàn)也存在與日本、韓國、中國大陸和中國臺灣；HEV-4主要分布于中國、日本和越南。我國存在的主要是1型和4型[3-5]。

該病毒的主要傳播途徑是糞口傳播，即通過飲用被污染的水和食用被污染的食物而感染[6-8]。食用未煮熟的感染HEV的動物組織或內(nèi)臟也可能導致食源性感染[9-10]，除此之外，母嬰傳播[11-12]、輸血傳播[13-15]也是重要的傳播途徑。孕婦感染HEV可導致流產(chǎn)或死亡，病死率高達20%-30%。HEV還分布于多種動物中，并可在人與豬之間相互傳播，是人類健康和養(yǎng)豬業(yè)的重要病原[16-17]。

目前，國內(nèi)外對HEV的檢測方法各異，例如ELISA、PCR等常規(guī)檢測方法，但是對于HEV含量低的樣品以及處理過程中易產(chǎn)生抑制物等因素，均限制了HEV的早期臨床診斷。因此，本研究基于SYBR Green Ⅱ染料，建立用于HEV檢測的熒光定量RT-PCR方法，以期達到靈敏性高、可定量、操作便利和成本相對較低等特點的檢測目的。

1 材料與方法

1.1病毒 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬嵴病毒(PKoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(ProVA)、豬戊型肝炎病毒(HEV)陽性病料均由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術中心保存。

1.2主要試劑 DL2000DNA Marker，SYBR Green Premix E×TaqⅡ，2×TaqPLR Master Mix均購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3引物的設計與合成 將10株來自不同地區(qū)豬戊型肝炎病毒代表株的全基因序列利用軟件進行同源性分析，選出高度保守的核酸區(qū)域為ORF2基因，針對保守區(qū)設計一對引物分別是HEV-F: 5′-ATTTCGTCGGCTGGAGGT-3′, HEV-R : 5′-ACGGGACTCACCAAGATCAATA-3′。預期擴增目的片段大小為150 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4HEV重組質粒標準品的制備 使用膠回收試劑盒對得到的PCR產(chǎn)物進行回收純化，將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector(Simple)連接，將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞。用質粒DNA提取試劑盒提取質粒。將鑒定為陽性的重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。在NCBI上對測序結果進行比對，分析結果表明該陽性重組質粒與試驗預期相符，可作為HEV熒光定量RT-PCR的陽性標準品。將獲取的陽性標準品用超微量紫外可見分光光度計測定濃度，經(jīng)計算其DNA濃度為4.10×1010拷貝/μL，置于-20 ℃保存。

使用膠回收試劑盒對得到的PCR產(chǎn)物進行回收純化，將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector(Simple)連接，將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞。用質粒DNA提取試劑盒提取質粒。將鑒定為陽性的重組質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。在NCBI上對測序結果進行比對，分析結果表明該陽性重組質粒與試驗預期相符，可作為HEV熒光定量RT-PCR的陽性標準品。將獲取的陽性標準品用超微量紫外可見分光光度計測定濃度，經(jīng)計算其DNA濃度為4.10×1010拷貝/μL，置于-20 ℃保存。

1.5標準曲線實驗 分別使用兩步法和三步法對該方法的循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化。對退火溫度在53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃進行優(yōu)化。

用雙蒸水將陽性標準品進行10倍倍比稀釋，取7個濃度梯度的陽性標準品作為模板(4.10×102-4.10×108拷貝/μL)，按照優(yōu)化的反應條件進行擴增，觀察擴增曲線，標準曲線由熒光定量PCR儀自動生成。

1.6敏感性試驗 用雙蒸水將陽性標準品進行10倍倍比稀釋，采用濃度為4.10×102～4.10×108拷貝/μL的陽性標準品作為模板，分別用建立的熒光定量RT-PCR與常規(guī)RT-PCR對標準品進行檢測，對比兩種檢測方法的敏感性。常規(guī)RT-PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 40 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.7重復性試驗 將陽性標準品稀釋成3個稀釋度(4.10×103、4.10×105、4.10×107拷貝/μL)，用所建立的熒光定量RT-PCR對樣品分別進行3次重復檢測，進行組內(nèi)重復性試驗；對獲得的陽性標準品做組間的重復性試驗，在相同反應條件下，利用該方法每間隔1周對其進行3次獨立的檢測，檢驗該方法的重復性。

1.8特異性試驗 用已建立的熒光定量RT-PCR同時對PRRSV，CSFV，TGEV，PKoV，PEDV、ProVA和HEV進行檢測，驗證其特異性。

1.9熒光定量RT-PCR對臨床樣品的檢測 將采自四川省成都、綿陽、眉山、遂寧、樂山、雅安等規(guī)?；i場的61份豬糞便用PBS稀釋至2g/mL的濃度，離心后取上清用Trizol法提取樣品總RNA，按照已優(yōu)化的體系和條件，用已建立的熒光定量RT-PCR和常規(guī)PCR對樣品進行檢測。

2 結 果

2.1優(yōu)化的檢測條件 經(jīng)過對兩步法、三步法的循環(huán)數(shù)和退火溫度的優(yōu)化后，最佳反應體系為25 μL：SYBR Primix E×TaqTM12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.2 μL，模板2 μL，水補足至25 μL。經(jīng)驗證該反應最佳條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，53 ℃ 30s，72 ℃ 30 s；進行39個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 5 s，60 ℃以每秒升高0.5 ℃的速度，直至升溫到95 ℃。

2.2標準曲線分析 用建立的熒光定量RT-PCR檢測各濃度梯度的HEV陽性標準品時，所得到的標準曲線顯示，在4.10×102～4.10×108拷貝/μL之間有良好的線性關系，標準曲線的斜率是-3.497，y軸截距是38.649，其相關系數(shù)為0. 996，符合試驗預期(圖1)。

圖1 HEV實時熒光定量RT-PCR的標準曲線Fig.1 The standard curve of real-time RT-PCR for detection of HEV

2.3熔解曲線分析 對熔解曲線進行分析，結果顯示在熔解溫度Tm= 84.0 ℃±0.1 ℃處呈現(xiàn)特異性峰值，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物(圖2)。

圖2 HEV實時熒光定量RT-PCR的溶解曲線Fig.2 The melting curve of real-time RT-PCR for detection of HEV

2.4敏感性試驗 對常規(guī)PCR與已建立的熒光定量RT-PCR進行敏感性比較，結果顯示常規(guī)RT-PCR可檢測的最低病毒濃度為4.10×104拷貝/μL (圖3)；而熒光定量RT-PCR可檢測到的最低病毒濃度為4.10×102拷貝/μL，靈敏度可以達到4.10×102拷貝/μL(圖4)。結果證明，熒光定量RT-PCR的敏感性比常規(guī)RT-PCR提高了100倍。

M:DL2000DNA Marker;1-7:The plasmid concentrations are from 4.10×108～4.10×102 copies/μL,respectively;8:Negative control圖3 HEV常規(guī)PCR的敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of conventional PCR for detection of HEV

1-7:The plasmid concentrations are from 4.10×108～4.10×102 copies/μL,respectively;8:Negative control圖4 實時熒光定量RT-PCR的敏感性試驗Fig.4 The sensitivity test of real-time RT-PCR

2.5重復性試驗 用已建立的實時熒光定量RT-PCR對3個不同稀釋濃度的陽性標準品進行重復性檢測，在相同反應條件下分別進行3次試驗，檢驗該方法的重復性，并計算變異系數(shù)(表1)。結果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)小于1.0%，組間變異系數(shù)小于1.0%，表明所建立的熒光定量RT-PCR具有較好的重復性。

表1 SYBR Green Ⅱ熒光定量RT-PCR的組內(nèi)、組間重復性試驗結果
Tab.1 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the SYBR Green Ⅱ real-time PCR

樣品濃度(拷貝/μL)Concentrationofstandardplasmid(copies/μL)n組內(nèi)變異實驗Intra?assayvariability組間變異實驗Inter?assayvariabilityCt值平均值AverageofCt變異系數(shù)CV(%)Ct值平均值AverageofCt變異系數(shù)CV(%)103314．26±0．020．8314．09±0．080．83105320．30±0．040．9221．40±0．410．92107328．50±0．130．9428．44±0．370．94

2.6特異性試驗 按照已建立的實時熒光定量RT-PCR方法對PRRSV，CSFV，TGEV，PKoV，PEDV、ProVA和HEV反轉錄后所獲得的cDNA進行檢測，結果顯示只有HEV陽性樣本能夠擴增出曲線(圖5)，證明所建立的方法具有很強的特異性。

1:Amplification curve of HEV2-7:Amplification curve ofPRRSV,CSFV,TGEV,PKoV,PEDV and ProVA圖5 HEV實時熒光定量RT-PCR的特異性試驗Fig.5 Specificity test of real-time RT-PCR for detection of HEV

2.7熒光定量RT-PCR對臨床樣品的檢測 按照已建立的熒光定量RT-PCR對臨床采集的61份疑似HEV發(fā)病豬的腸內(nèi)容物進行檢測，同時用常規(guī)RT-PCR進行檢測，對兩種檢測方法的結果進行比較。熒光定量RT-PCR檢測結果顯示，61份樣本中有9份為HEV陽性(Ct值為11.26-28.82)。常規(guī)RT-PCR只檢測到了6份HEV陽性樣本。兩種檢測方法所檢出的陽性病料符合率為100%(表2)。

表2 豬腸內(nèi)容物樣品檢測結果
Tab.2 Intestinal contents sample testing results

樣品Sample檢測方法TestmethodHEV陽性樣品編號HEVpositivesamplenumber61份豬腸內(nèi)容物61samplesofin?testinalcontents常規(guī)RT?PCRConventionalRT?PCR18，19，25，29，33，39熒光定量RT?PCRReal?timeRT?PCR9，18，19，25，28，29，33，39，55

3 討 論

光定量PCR主要有兩大類，分別為探針類和染料類。熒光定量PCR和常規(guī)PCR比較，熒光定量PCR更為快速，并有較高的敏感性和特異性，除此之外，還能夠顯著減少試驗過程當中的污染。近年來，也有多個關于利用探針法檢測HEV的報道[18-19]，探針法的優(yōu)點是可以通過探針提高反應收集熒光信號的特異性，只有與探針相結合的區(qū)域發(fā)生擴增才能夠被接收到熒光信號，能夠提前對反應條件進行優(yōu)化；缺點是合成探針成本高。而這種染料法比探針法更經(jīng)濟。它不僅可以完成溶解曲線，而且可以分析所有產(chǎn)物的Tm值,缺點是與探針法相比特異性略差，但本研究中的溶解曲線呈現(xiàn)的是單一特異性峰，并且在特異性試驗中顯示只特異性擴增HEV,說明本研究中建立的SYBR Green Ⅱ染料法的特異性很高，我們選擇SYBR Green Ⅱ染料法建立針對HEV的熒光定量檢測方法，能夠滿足臨床診斷的需求。

HEV是一種人獸共患病病原，該病的流行主要發(fā)生在亞洲，非洲及墨西哥等發(fā)展中國家。豬感染HEV的情況在世界上所有的豬場都普遍存在。研究表明，豬是HEV的主要貯存宿主，感染的豬一般有短暫的病毒血癥，持續(xù)1-2周。我國豬場中HEV的感染情況也很普遍，有研究者對我國20個省、直轄市和民族自治區(qū)的120個規(guī)?；i場的8626頭保育豬的血清進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)抗HEV抗體陽性率高達83.4%，被調(diào)查的每個豬場中均出現(xiàn)了HEV感染的情況，說明HEV感染在我國豬場是極為嚴重的[20]。豬自然感染HEV一般不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，所以建立一種靈敏度高、操作方便并且成本低的檢測方法迫在眉睫。目前，已建立的檢測方法以巢式RT-PCR最為常用。但是，巢式RT-PCR操作步驟繁瑣，導致檢測時間增長，不能及時得出檢測結果。所以，本研究建立了靈敏度高、程序簡單并且成本低的HEV SYBR GreenⅡ熒光定量RT-PCR。

近年來，關于HEV熒光定量的方法的應用的研究主要針對浙江，吉林，河北和北京等地。2016年劉敏等人對中國15個省市自治區(qū)和直轄市的HEV分布情況進行調(diào)查分析，但是有些地區(qū)的HEV分布情況還沒有被調(diào)查，其中包括西南地區(qū)，如四川、云南、貴州、西藏和重慶等地[21]。至今對于四川地區(qū)的豬源HEV的發(fā)病情況還沒有相關報道，本研究中針對HEV的ORF區(qū)域設計引物，利用建立的熒光定量方法對四川省的HEV發(fā)病率情況進行初步分析，為該地區(qū)HEV的預防工作提供了數(shù)據(jù)支持。本試驗對采自四川省成都、綿陽、眉山、遂寧、樂山、雅安地區(qū)規(guī)模化豬場的61份豬腸內(nèi)容物進行檢測，其中9份樣品呈陽性，陽性率為14.75%；常規(guī)RT-PCR檢測結果中，有6份呈陽性，陽性率為9.8%，與熒光定量RT-PCR檢測的陽性結果符合率為100%，結果顯示本研究中建立的熒光定量RT-PCR對樣品的檢出率高于常規(guī)PCR。本研究建立了SYBR GreenⅡ熒光定量RT-PCR對HEV的檢測方法，該方法具有靈敏性高、特異性強、可定量等優(yōu)點，為HEV的臨床診斷起到了很好的指示作用，為我國相關研究者對HEV的進一步研究奠定基礎。

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DevelopmentandapplicationofaSYBRGreenⅡreal-timeRT-PCRfordetectionofswinehepatitisEvirus

LI You-you1, GONG Shuang-yan1, LI Xiao-jing1, MAO Xi-yu1, DENG Yi-chao1, ZHU Ling1,2, XU Zhi-wen1,2

(1.AnimalMedicalCollege,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611134,China;2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611134,China)

In order to establish a real-time RT-PCR based on SYBR Green Ⅱ for detection of hepatitis E virus (HEV), a pair of special primers was designed according to the conserved sequences of ORF2 in GenBank. Result showed that the standard curve of established SYBR Green Ⅱreal-time RT-PCR had a wide dynamic range from 4.10×102-4.10×108copies/μL with a linear correlation(r2) of 0.996. The sensitivity could reach 1.00×102copies/μL. The melting curve analysis using SYBR Green Ⅱ dye showed one specific peak with a melting temperature(Tm) of 84.0 ℃±0.1 ℃. No amplification was detected from the RNA samples of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, classial swine fever virus, transmissible gastroenteritis virus, porcine bocavirus, porcine epidemic dearrhoea virus porcine kobuvirus and porcine rotavirus by this PCR, respectively. Excellent reproducibility was obtained for detecting constructed positive plasmid DNA with intra-assay of 0.83%-0.94% and inter-assay of 0.83%-0.94%. Further detection of 61 specimens showed that 9 of them were HEV positive, and the results of the quantitative RT-PCR were the same as that of the conventional RT-PCR. In conclusion, the real-time quantitative RT-PCR for HEV is feasible, the real-time RT-PCR established in this study will be useful for earlier rapid laboratory diagnosis and pathogenesis of HEV.

hepatitis E virus; SYBR Green Ⅱ; real-time RT-PCR

Zhu Ling, Email: abtcxzl72@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.010

四川省科技支撐計劃(No.2014NZ0043)，國家“十二五”科技支撐計劃(No.2015BAD12B04-2.3)聯(lián)合資助

朱 玲，Email:abtcxzl72@126.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611134；

2.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611134

R373.2

A

1002-2694(2017)11-1002-05

Supported by the Sichuan Province Science and Technology Support Program (No.2014NZ0043),and the National Science and Technology Support "The 12th Five-Year" Program(No.2015BAD12B04-2.3)

2017-05-22編輯王曉歡