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·論著·

多房棘球蚴LDH基因的克隆表達及免疫原性研究

何順偉1，李洪清2，李曉燕2，趙瑞雪2，魏曉星1

目的克隆表達青海省多房棘球蚴(Echinococcusmultilocularis, Em)乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase, LDH)基因，鑒定EmLDH重組蛋白的免疫原性，初步評價其免疫診斷價值。方法采用RT-PCR方法克隆EmLDH基因，將其連接入pET15b表達載體中，構建重組表達質粒pET15b-EmLDH，轉化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細胞進行誘導表達。通過SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達形式，Ni-IDA 樹脂親和層析純化重組蛋白。通過Western blotting法鑒定EmLDH重組蛋白的免疫原性，ELISA法檢測泡型包蟲病患者(57例)、囊型包蟲病患者(33例)和正常人(50例)血清，初步評價EmLDH重組蛋白的免疫診斷效果。結果成功克隆了EmLDH基因并表達純化出相應的重組蛋白。Western blotting結果顯示，EmLDH重組蛋白可被泡型和囊型包蟲病患者血清識別，而不被正常人血清識別。ELISA結果顯示，EmLDH重組蛋白對泡型和囊型包蟲病患者血清的診斷敏感性分別為84.21%和84.85%。結論EmLDH重組蛋白具有較高的免疫原性，對包蟲病具有較好的免疫診斷價值。

多房棘球蚴；LDH基因；克??；表達；免疫原性

多房棘球絳蟲是一種可引起人獸共患病的寄生蟲，集中分布于北半球高緯度地區(qū)[1]。由其幼蟲侵染機體引起的泡型包蟲病對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展危害極大，是許多國家和地區(qū)嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[2-3]。快速靈敏的診斷方法對該病的防治十分重要。免疫診斷是包蟲病臨床診斷研究的一項重要內(nèi)容，選擇適宜的特異性抗原是決定包蟲病免疫診斷準確性的關鍵[4-5]。目前，利用基因工程技術篩選和鑒定棘球蚴特異性抗原是包蟲病免疫診斷研究的主要方向[6-8]。本研究以青海省多房棘球蚴原頭節(jié)cDNA為模板克隆EmLDH基因，表達純化EmLDH重組蛋白，通過Western blotting法鑒定該蛋白的免疫原性和ELISA法初步評價其免疫診斷價值，為后續(xù)基于EmLDH蛋白的包蟲病免疫診斷的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源Em原頭節(jié)取自青海西寧地區(qū)經(jīng)感染Em的小鼠完整包囊，無菌條件下抽吸囊液，分離原頭節(jié)，PBS緩沖液清洗干凈后于-80 ℃保存。泡型包蟲病患者血清(57例)和囊型包蟲病患者血清(33例)取自青海省各大醫(yī)院。所有患者均經(jīng)快速免疫診斷試劑盒及影像學診斷確診或手術確診。正常人血清(50例)取自醫(yī)院健康體檢者。

1.1.2主要試劑 2×Taq PCR MasterMix、D2000 DNA Marker、TIANScript RT Kit、6×DNA loading buffer、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、快速質粒小提試劑盒、GeneGreen核酸染料均購自北京天根公司。TRIzol○RLS Reagent、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、辣根過氧化物酶標記(HRP)的羊抗人IgG(HRP-IgG)、DAB底物顯色液試劑盒、ELISA終止液、ELISA包被液(1×)、1×PBST、抗體稀釋液(普通型)、單組分TMB顯色液、5% BSA封閉液、Difco Skim Milk脫脂奶粉均購自上海索萊寶公司；pET15b原核表達載體、Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞、非預染蛋白marker、包涵體溶解液、5×protein loading buffer、PVDF膜、Ni-IDA瓊脂糖蛋白純化試劑盒均購自上海生工公司。NdeI/XhoI限制性內(nèi)切酶、考馬斯亮藍染色試劑盒(常規(guī)法)均購自碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1目的基因克隆和測序 參照GenBank上公布的細粒棘球蚴EgLDH基因(GenBank：No.HM748917.1)設計引物，其中上游引物序列為：5′-CGCCATATGTCTGTGGAGGGGTTGTTG-3′，下游引物序列為：5′-CCGCTCGAGTCACCACTTGATGCCTGCGATAATC-3′(下劃線部分為NdeI/XhoI酶切位點，兩端為保護性堿基)，擴增片段大小為996 bp，由上海生工公司合成。

使用TRIzol法提取原頭節(jié)總RNA，按TIANScript RT Kit操作說明反轉錄成cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。擴增體系(20 μL)：上、下游引物(10 μmol/L)及cDNA 模板各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，ddH2O 7 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收。隨后將目的片段與pGM-T載體連接，轉化入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆經(jīng)雙酶切及菌液PCR鑒定正確后，將陽性菌液送上海生工公司測序。

1.2.2重組質粒的構建和鑒定 將回收純化的EmLDH基因的PCR產(chǎn)物同pET15b表達載體分別用NdeI和XhoI雙酶切，電泳檢測酶切產(chǎn)物并切膠回收目的基因片段和線性化的表達載體。將回收產(chǎn)物連接構建重組表達載體pET15b-EmLDH，轉化至E.coliRosetta (DE3) 感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素(50 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆經(jīng)雙酶切及質粒PCR鑒定正確后送測序。

1.2.3重組蛋白的表達和純化 將重組菌按1∶100的比例接種到含氨芐青霉素和氯霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)。當菌液吸光度OD600值達0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別于20 ℃誘導過夜，37 ℃誘導4 h。吸取1 mL菌液8 000 r/min離心收集菌體，加入500 μL PBS緩沖液懸浮菌體，超聲破碎，12 000 r/min離心分別收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液溶解。分別從各組中取40 μL樣品和10 μL 5×protein loading buffer混勻，沸水浴10 min，取10 μL混合液進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，初步確定蛋白表達形式。

大量誘導重組表達菌株，將重組菌液按1∶100的比例接種到含氨芐青霉素和氯霉素的3 L LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。當菌液吸光度OD600值達0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導過夜。8 000 r/min離心收集菌體。加入1 mL PBS緩沖液懸浮菌體，冰浴中超聲破碎菌體，12 000 r/min 4 ℃離心收集上清進行純化目的蛋白。按照Ni-IDA瓊脂糖樹脂的操作說明純化收集重組蛋白，用SDS-PAGE進行檢測。

1.2.4重組蛋白的Western Blotting分析 將純化的EmLDH重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至PVDF膜上。將膜剪成條狀浸泡于5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉2 h，PBST溶液洗膜3次，5 min/次。分別與多房棘球蚴病患者、細粒棘球蚴病患者和健康人血清(1∶200)結合反應，4 ℃過夜。次日PBST溶液洗膜3次，5 min/次，加入羊抗人IgG-HRP(1∶1 500)抗體37 ℃搖床孵育2 h。PBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入新配制的DAB溶液37 ℃顯色5 min，加入蒸餾水終止反應。

1.2.5重組蛋白的ELISA檢測 使用ELISA法檢測收集的57例泡型包蟲病患者血清、33例囊型包蟲病患者血清和50例正常人血清。用純化的EmLDH重組蛋白(10 μg/mL)包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃過夜。次日，PBST溶液洗板3次，加封閉液100 μL/孔，37 ℃封閉1 h。PBST溶液洗板3次，加血清(1∶100)，100 μL/孔，37 ℃溫育2 h。PBST溶液洗板3次，加羊抗人IgG-HRP(1∶1 000)，100 μL/孔，37 ℃溫育2 h。PBST溶液洗板3次，加TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光顯色15 min。加終止液，450 μL/孔，終止反應，置酶標儀測定吸光度(A490)值。以50例正常人血清的吸光度均值+2倍標準差作為陽性判斷值。應用SPSS 11.0軟件對實驗結果進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1目的基因的克隆和測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小相符(圖1)。將測序結果輸入到GenBank進行Blast比對，與EgLDH基因(GenBank:No.HM748917.1)同源性為99%，確定擴增產(chǎn)物為EmLDH基因。

2.2重組質粒的構建和鑒定 構建的重組質粒pET15b-EmLDH經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切鑒定后，進行電泳檢測出現(xiàn)清晰的酶切片段(圖2)。測序比對后確定插入片段為目的基因，表達載體構建正確。

2.3重組蛋白的表達和純化 SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達結果顯示(圖3)，EmLDH原核表達載體在大腸桿菌中正確表達出目的蛋白，且EmLDH重組蛋白在上清和沉淀中均有表達。鎳柱純化后的目的蛋白經(jīng)電泳檢測顯示(圖4)，條帶單一，清晰明亮。

M：DNA標志物(D2000)；1：目的條帶 2：陰性對照M：DNA marker(D2000); 1: Target band 2: Negative control圖1 EmLDH基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplication of EmLDH gene

M：DNA標志物(D2000)；1：未酶切重組質粒2：重組質粒雙酶切M：DNA marker (D2000); 1: recombinant pET15b-EmLDH plasmid 2: recombinant pET15b-EmLDH plasmid digested by NdeI and XhoI圖2 重組質粒pET15b-EmLDH的酶切鑒定Fig.2 Identification of the pET15b-EmLDH plasmid by digestion with restriction enzymes

M：蛋白標志物；1：誘導前菌體總蛋白；2：20 ℃沉淀；3：20 ℃上清；4：37 ℃沉淀；5：37 ℃上清M: Protein marker; 1:Total bacteria protein before induction; 2: 20 ℃ Precipitation;3: 20 ℃ Supernatant; 4: 37 ℃ Precipitation; 5: 37 ℃ Supernatant圖3 EmLDH表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression product from EmLDH

M：蛋白質標志物；1：純化的EmLDH重組蛋白M: Protein Marker; 1: Purified EmLDH recombinant protein圖4 純化的EmLDH重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the purified EmLDH recombinant protein

2.4重組蛋白的Western Blotting分析 Western Blotting結果表明(圖5)，純化的EmLDH重組蛋白能被泡型包蟲病患者和囊型包蟲病患者血清特異性識別，在約38 kDa處出現(xiàn)深色顯色帶，與正常人血清無反應。

M：蛋白質標志物；1：泡型包蟲病患者血清；2：囊型包蟲病患者血清；3：正常人血清M：Protein Marker;1:Serum samples from alveolar echinococlosis patients;2:Serum samples from cystic echinococcosis patients; 3: Serum samples from healthy persons圖5 純化的EmLDH重組蛋白的Western Blotting分析Fig.5 Western Blotting analysis of the purified EmLDH recombinan protein

2.5重組蛋白的ELISA檢測 ELISA檢測結果顯示(表1)，EmLDH重組蛋白對泡型包蟲病和囊型包蟲病患者血清的診斷敏感性分別為84.21%(41/57)和84.85%(28/33)。

表1 EmLDH重組蛋白的ELISA檢測結果
Tab.1 ELISA detection result of EmLDH recombinant protein

檢測病例Cases例數(shù)No．ofcases陽性數(shù)No．ofpositive陽性率/%Positiverate/%多房棘球蚴病患者Alveolarechinococcosis574184．21細粒棘球蚴病患者Cysticechinococcosis332884．85正常人Healthypersons5000

3 討 論

多數(shù)寄生蟲在宿主體內(nèi)主要是通過無氧糖酵解途徑來獲取能量。作為糖酵解途徑的末端酶，LDH對寄生蟲的生存至關重要，尤其是寄生在宿主腸道部位的寄生蟲，LDH的表達量升高，經(jīng)常被認為是抗蟲藥物良好的的作用靶點[9-11]。眾多研究表明，LDH同樣是寄生蟲病的潛在診斷抗原分子。李雪峰等[12]使用OptiMal-IT金標層析快速檢測試劑盒評估瘧原蟲乳酸脫氫酶Mab的特異性和敏感性，發(fā)現(xiàn)該試劑盒在瘧疾診斷和鑒別診斷中具有快速、簡便、特異性強、敏感性高的特點，可用于瘧疾的快速診斷。呂剛等[13]通過對日本血吸蟲SjLDH基因進行克隆表達和生物活性鑒定，發(fā)現(xiàn)SjLDH重組蛋白具有較強的免疫活性和酶活性。黃江等[14]通過對牛帶絳蟲亞洲亞種成蟲LDH基因進行克隆表達和免疫原性分析發(fā)現(xiàn)，TaLDH重組蛋白能和受感染的豬血清和患者血清發(fā)生免疫反應，認為TaLDH蛋白可能是免疫診斷分子。杜武英等[15]通過對豬帶絳蟲LDH基因進行克隆表達和免疫原性分析發(fā)現(xiàn)，TsLDHA能夠識別被重組蛋白免疫的SD大鼠血清、感染豬帶絳蟲的病人血清和豬血清，提示該蛋白具有較好的免疫原性和免疫反應性，是潛在的診斷抗原。2010年，Lu等[16]通過細粒棘球絳蟲EgLDH基因進行克隆，發(fā)現(xiàn)EgLDH基因全長1 233 bp，包含996 bp的開放閱讀框，編碼331個氨基酸；生物信息學預測顯示該蛋白包含3個跨膜域和4個主要的抗原表位，提示EgLDH為抗原蛋白，具有一定的免疫原性。

本研究從多房棘球蚴原頭節(jié)中擴增出了EmLDH基因完整的編碼區(qū)序列，同EgLDH基因進行同源性比對發(fā)現(xiàn)相似度達99%。通過原核表達和鎳柱層析我們獲得了純化的EmLDH重組蛋白。Western blotting結果顯示，泡型和囊型包蟲病患者血清可與純化的EmLDH重組蛋白發(fā)生特異性結合，而與正常人血清無反應，表明人體感染多房棘球蚴和細粒棘球蚴后，血清中產(chǎn)生了LDH蛋白的抗體，EmLDH蛋白具有良好的免疫原性，為抗原蛋白。ELISA結果顯示，EmLDH重組蛋白不僅與泡型包蟲病患者血清發(fā)生反應，也能識別囊型包蟲病患者血清，并且兩者診斷敏感性相當。EmLDH蛋白不能單獨對兩型包蟲病進行區(qū)分，但可與其它多房棘球蚴特異性抗原聯(lián)合應用來對兩型包蟲病進行鑒別診斷。此外，EmLDH蛋白同血吸蟲病、豬肉絳蟲病和弓形蟲病等患者血清之間是否存在交叉反應，以及EmLDH蛋白作為多房棘球蚴有效抗原的基本條件和誘導宿主產(chǎn)生的特異性免疫應答，仍需要進一步實驗證實。

本次研究表明多房棘球蚴LDH蛋白具有良好的免疫原性和潛在的免疫診斷價值，為后續(xù)多房棘球蚴LDH蛋白的免疫原性研究和應用提供基礎資料。

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CloningandprokaryoticexpressionofLDHgeneinEchinococcusmultilocularisandimmunogenicityresearchoftherecombinantprotein

HE Shun-wei1, LI Hong-qing2, LI Xiao-yan2, ZHAO Rui-xue2, WEI Xiao-xing1

(1.DepartmentofEcologically-environmentEngineering,QinghaiUniversity,Xininig810016,China;2.TheAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xininig810016,China)

The present study aimed to clone and express the EmLDH gene ofEchinococcusmultilocularisin Qinghai Province, identifying immunogenicity of EmLDH recombinant protein and evaluating its immune diagnostic value preliminarily. EmLDH genes were cloned by RT-PCR technology and linked into pET15b vector. Recombinant expression pET15b-EmLDH vectors were constructed and transformed intoE.coliRosetta (DE3) competent cells. Recombinant proteins were induced and expressed. Expression forms of recombinant proteins were detected by SDS-PAGE. Recombinant proteins were purified by affinity chromatography of Ni-IDA resin. Immunogenicity of recombinant proteins was identified by Western blotting. Serum samples from patients with alveolar echinococcosis (57 cases), cystic echinococcosis (33 cases), and healthy persons (50 cases) were examined by ELISA, which evaluated preliminarily immune diagnosis effect of EmLDH recombinant proteins. Results showed that EmLDH gene was cloned successfully and the recombinant proteins were expressed and purified. Results of Western blotting showed EmLDH recombinant proteins were recognised by serum samples from patients with alveolar echinococcosis and cystic echinococcosis, but not by serum samples from healthy persons. Results of ELISA showed that diagnostic sensitivities of EmLDH recombinant protein reacted with serum samples from patients with alveolar echinococcosis and cystic echinococcosis were 84.21% and 84.85% respectively. EmLDH recombinant proteins ofEchinococcusmultilocularishave high immunogenicity and good immune diagnostic value for echinococcosis.

Echinococcusmultilocularis; LDH gene; cloning; expression; immunogenicity

Wei Xiao-xing, Email: weixiaoxing@tsinghua.org.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.004

青海省科技項目(No. 2016-ZJ-746)資助

魏曉星，Email：weixiaoxing@tsinghua.org.cn

1.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，西寧 810016；

2.青海大學附屬醫(yī)院，西寧 810016

Email: heshunwei1219@foxmail.com

R383.3

A

1002-2694(2017)11-0967-05

Supported by the Science and Technology Project of Qinghai Province (No.2016-ZJ-746)

2017-03-23編輯王曉歡