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·論著·

不同養(yǎng)殖場家蠅成蟲體表攜帶細(xì)菌的分離與鑒定

陳丹1，莊桂芬1，黃振東1，薛志靜1，劉婧1，李妍1，張瑞玲1,2，張忠1,2

目的研究不同養(yǎng)殖場內(nèi)家蠅成蟲體表攜帶細(xì)菌數(shù)量和類別。方法采用網(wǎng)捕法對不同養(yǎng)殖場的家蠅進(jìn)行采樣，利用振蕩洗脫法分離其體表細(xì)菌，對獲得細(xì)菌的16S rDNA基因擴(kuò)增后進(jìn)行分離分子鑒定。結(jié)果不同養(yǎng)殖場內(nèi)家蠅密度、體表攜帶細(xì)菌數(shù)量和種類有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且家蠅密度與體表攜帶細(xì)菌數(shù)量和攜帶的細(xì)菌屬數(shù)呈線性相關(guān)關(guān)系。在養(yǎng)殖場內(nèi)分離到的家蠅體表攜帶細(xì)菌中，葡萄球菌屬、克雷伯氏菌屬、埃希菌屬、沙雷氏菌屬分布較廣，同時(shí)分離的細(xì)菌中多為條件致病菌，存在疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論養(yǎng)殖場家蠅密度反映出養(yǎng)殖場的整體管理水平；養(yǎng)殖場孳生的家蠅可機(jī)械性攜帶條件致病菌，存在將細(xì)菌傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步加強(qiáng)對養(yǎng)殖場蠅類防控及攜帶細(xì)菌的監(jiān)控。

家蠅；養(yǎng)殖場；體表細(xì)菌；機(jī)會(huì)致病細(xì)菌；蠅傳疾病

家蠅是重要的醫(yī)學(xué)媒介生物，為世界性分布的昆蟲，且食性廣泛，活動(dòng)能力強(qiáng)，特別喜歡孳生于居民區(qū)、養(yǎng)殖場、食品加工廠、垃圾處理場等場所，不僅會(huì)對人產(chǎn)生視覺污染，而且可以傳播疾病，影響畜牧業(yè)健康生產(chǎn)，可將病原菌從重度污染的區(qū)域帶向居民區(qū)，造成疾病的發(fā)生與流行。

蠅類傳播疾病通常分為機(jī)械傳播和生物傳播，其中以機(jī)械性傳播為主，可傳播包括細(xì)菌、原生動(dòng)物、病毒、寄生蟲卵囊和卵等30多種病原體[1-8]。蠅類對病原體的機(jī)械性傳播主要通過糞口傳播途徑和體表攜帶兩種途徑，這主要與蠅類體表布滿鬃毛，爪墊上有纖毛等結(jié)構(gòu)有關(guān)；同時(shí)，蠅類在取食時(shí)邊吃、邊吐、邊排便的攝食習(xí)性，增加了其攜帶的病原體污染水、食物、用具等物體表面的機(jī)會(huì)，從而造成人類的感染[9-10]。

目前，家蠅是養(yǎng)殖場重點(diǎn)防控的媒介生物，特別是在一些養(yǎng)殖條件較差的小型養(yǎng)殖場和散戶型養(yǎng)殖場，家蠅孳生非常嚴(yán)重，并影響周邊居民的正常生活。由于家蠅在養(yǎng)殖場、周邊住戶、養(yǎng)殖戶等生態(tài)環(huán)境之間不斷竄擾，有將體表攜帶病原體傳給人類的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要加強(qiáng)對蠅類體表攜帶病原體的檢測研究，為蠅類傳播的疾病提供風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并制定合理的防控預(yù)案。

1 材料與方法

1.1采樣地點(diǎn) 采樣地點(diǎn)位于山東省泰安市岱岳區(qū)和濟(jì)南市平陰縣，共包括9個(gè)養(yǎng)殖場的10個(gè)采樣點(diǎn)。分別為：泰安市岱岳區(qū)朱康村豬舍(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)、泰安市岱岳區(qū)高莊村豬舍(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)、濟(jì)南市平陰縣綠環(huán)托佩克種豬場(東經(jīng)116.4°，北緯36.3°)、泰安市岱岳區(qū)魚東村奶牛場(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)、泰安市岱岳區(qū)同和奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社糧倉和犢牛舍(東經(jīng)117.4°，北緯36.2°)、泰安市岱岳區(qū)西孫村奶牛場(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)、泰安市岱岳區(qū)西孫村養(yǎng)雞場(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)、泰安市岱岳區(qū)西孫村養(yǎng)鴨場(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)和泰安市岱岳區(qū)魚池村鴨場(東經(jīng)116.9°，北緯36.2°)。

1.2蠅類的采集方法 蠅類的采集采用網(wǎng)捕法，在養(yǎng)殖場蠅類成蟲聚集處隨機(jī)掃3網(wǎng)，將網(wǎng)捕到的蒼蠅經(jīng)乙醚麻醉后分裝到10 mL離心管中，采集所用器材均經(jīng)無菌處理?；貙?shí)驗(yàn)室后，將各種蠅類進(jìn)行分類鑒定，將鑒定出的家蠅進(jìn)行體表細(xì)菌的分離與鑒定。

1.3蠅類體表細(xì)菌的分離方法 家蠅體表攜帶細(xì)菌的分離方法采用振蕩洗脫法。將家蠅樣品按采集地點(diǎn)各取10頭家蠅分別置于50 mL離心管中，再加入20 mL無菌水和10 μL吐溫80，震蕩洗脫3～5 min。取體表洗脫液稀釋50倍后，各取100 μL，涂板，24 h后，計(jì)數(shù)各平板中菌落數(shù)量。培養(yǎng)2 d后，挑取形態(tài)不同的菌落三區(qū)劃線法接種到新的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，直至分離到單一的菌落。

1.4蠅類體表攜帶細(xì)菌的鑒定 將分離到的單菌落置于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖菌過夜，然后采用CTAB法提取各細(xì)菌DNA，并對16S rDNA的V3高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取陽性PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司進(jìn)行序列測定。將測序結(jié)果所測序列提交到GenBank中進(jìn)行序列對比，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得有關(guān)種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，取相似度最高的為鑒定結(jié)果，相似率gt; 99% 視為同種，95%～99%則為同一屬，lt;95% 則認(rèn)為同一科。一般均可鑒定到屬。

2 結(jié) 果

2.1不同養(yǎng)殖場家蠅的密度 不同養(yǎng)殖場采集到的家蠅數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=56.41,P=0.0001)，其中，以開放式奶牛養(yǎng)殖場采集到的家蠅最多，泰安市岱岳區(qū)魚東村奶牛場和西孫村奶牛場家蠅密度平均為88.3頭/網(wǎng)和89.3頭/網(wǎng)，其次是養(yǎng)雞場和養(yǎng)鴨場，平均約為75頭/網(wǎng)，而管理水平較高的同和奶牛養(yǎng)殖合作社內(nèi)，在糧倉和犢牛舍內(nèi)家蠅密度分別為33頭/網(wǎng)和41頭/網(wǎng)。對于3家養(yǎng)豬場來說，由于管理水平不同，家蠅數(shù)量也有較大差異，其中做到了糞便當(dāng)日清理的泰安市岱岳區(qū)高莊村豬舍，家蠅密度較低，平均為24頭/網(wǎng)；而在濟(jì)南綠環(huán)托佩克種豬場，僅養(yǎng)殖種豬用于品種改良和配種，養(yǎng)殖數(shù)量較少，管理水平較高，因此家蠅密度最低，約為18.7頭/網(wǎng)；相反管理比較粗放的泰安市岱岳區(qū)朱康村豬舍中，家蠅密度較高，約為44.7頭/網(wǎng)(圖1)。

注：各字母代表的養(yǎng)殖場如下所示，下同。a：泰安市岱岳區(qū)朱康村豬舍f：泰安市岱岳區(qū)同和奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社犢牛舍b：泰安市岱岳區(qū)高莊村豬舍g：泰安市岱岳區(qū)西孫村奶牛場c：濟(jì)南綠環(huán)托佩克種豬場h：泰安市岱岳區(qū)西孫村養(yǎng)雞場d：泰安市岱岳區(qū)魚東村奶牛場i：泰安市岱岳區(qū)西孫村養(yǎng)鴨場e：泰安市岱岳區(qū)同和奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社糧倉j：泰安市岱岳區(qū)魚池村鴨場圖1 不同養(yǎng)殖場家蠅的密度(頭/網(wǎng))Fig.1 Population density of Musca domestica in different livestock farms

圖2 不同養(yǎng)殖場家蠅體表分離到的細(xì)菌數(shù)量(105/頭)Fig.2 Number of bacteria isolated from body surface of Musca domestica in different livestock farms

2.2不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量 不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=248.95,P=0.0001)，其中以開放式奶牛養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量最高(泰安市岱岳區(qū)魚東村奶牛場和泰安市岱岳區(qū)西孫村奶牛場)，捕獲的家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量平均約為1×106個(gè)/頭，而管理水平較高的同和奶牛養(yǎng)殖合作社內(nèi)，在糧倉和犢牛舍內(nèi)捕獲的家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量平均約為8×104個(gè)/頭。對養(yǎng)豬場來說，濟(jì)南綠環(huán)托佩克種豬場內(nèi)家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量最低，平均約為2×105個(gè)/頭，而管理水平較低的高莊村豬舍中家蠅體表攜帶細(xì)菌量最高，平均約為6×105個(gè)/頭。3個(gè)禽類養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌數(shù)量相近，平均約為7×105個(gè)/頭(圖2)。

2.3不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌的種類 不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌的種類也有區(qū)別。其中在3個(gè)養(yǎng)豬場分離到細(xì)菌13屬，在4個(gè)奶牛場分離到細(xì)菌27屬，1個(gè)養(yǎng)雞場分離到8屬，2個(gè)養(yǎng)鴨場分離到15屬。

就分離到的細(xì)菌來說，葡萄球菌屬、克雷伯氏菌屬、埃希菌屬、沙雷氏菌屬為養(yǎng)殖場家蠅體表廣泛存在細(xì)菌，在本研究的5-7個(gè)養(yǎng)殖場內(nèi)的家蠅體表均分離到。芽孢桿菌屬、變形桿菌屬、香味菌屬分布也比較廣，在調(diào)查的4個(gè)養(yǎng)殖場內(nèi)的家蠅體表分離到。而不動(dòng)桿菌屬、鏈霉菌屬、拉烏爾菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、果膠桿菌屬、泛菌屬、短狀桿菌屬、志賀氏菌屬、固氮螺菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和微桿菌屬等13屬細(xì)菌分布較窄，僅在1個(gè)養(yǎng)殖場蠅類體表分離到。其它細(xì)菌可在2-3個(gè)養(yǎng)殖場內(nèi)的家蠅體表分離到(表1)。

在分離到的細(xì)菌中，革蘭氏染色陰性菌有19屬，占73%；革蘭氏染色陽性細(xì)菌7屬，占27%，分別為葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬、鏈霉菌屬、短狀桿菌屬和微桿菌屬。養(yǎng)殖場家蠅體表分離到的細(xì)菌中，多數(shù)為條件致病菌，對從業(yè)人員和周圍人群存在一定的威脅。

2.4不同養(yǎng)殖場家蠅數(shù)量與其體表攜帶細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌屬數(shù)的關(guān)系 養(yǎng)殖場家蠅數(shù)量與其體表攜帶細(xì)菌數(shù)量及細(xì)菌屬數(shù)均成線性相關(guān)關(guān)系(圖3)。說明養(yǎng)殖場管理水平越高，家蠅的密度越低，家蠅體表攜帶細(xì)菌的數(shù)量和種類越少，因此可以由養(yǎng)殖場孳生家蠅的數(shù)量反映出養(yǎng)殖場的整體管理水平。

圖3 不同養(yǎng)殖場家蠅密度與家蠅體表分離到細(xì)菌數(shù)量(A)和菌屬數(shù)(B)的相關(guān)性Fig.3 Correlations of Musca domestica adults’ population density with the isolated bacteria numbers (A) and the number of isolated bacteria genus (B)

表1 不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶細(xì)菌種類
Tab.1 Genus of bacteria isolated from body surface of Musca domestica in different livestock farms

菌屬BacteriaGenus養(yǎng)豬場PigFarms奶牛場DairyFarms養(yǎng)雞場ChickenFarms養(yǎng)鴨場DuckFarmsabcdefghij葡萄球菌屬Staphylococcus+++++++克雷伯氏菌屬Klebsiella++++?++埃希菌屬Escherichia+++?++沙雷氏菌屬Serratia+++++芽孢桿菌屬Bacillus+++?+變形桿菌屬Proteus++++香味菌屬myroides++++普羅威登斯菌屬Providencia++++腸桿菌屬Enterobacter+?++魏斯氏菌屬Weissella+?+腸球菌屬Enterococcus++假單孢菌屬Pseudomonas++黃桿菌屬Flavobacterium++不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter?+鏈霉菌屬Streptomyces+拉烏爾菌屬Raoultella++檸檬酸桿菌屬Citobacter+產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes+鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium+果膠桿菌屬Pectobacterium+泛菌屬Pantoea+短狀桿菌屬Brachybacterium+志賀氏菌屬Shigella?+固氮螺菌屬Azospirillum?+寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas+微桿菌屬M(fèi)icrobacterium+

3 討 論

家蠅是養(yǎng)殖場孳生的最常見蠅類，國內(nèi)外對養(yǎng)殖場家蠅的研究，多集中于對蠅類的控制，而對不同養(yǎng)殖場家蠅體表攜帶病原體的研究尚少[11]。

由于家蠅主要孳生于養(yǎng)殖場的禽畜糞便、飼料殘?jiān)?、?dòng)物尸體等養(yǎng)殖廢棄物上。養(yǎng)殖場家蠅的密度受到廢棄物處理狀況的影響，在廢棄物處理較好的養(yǎng)殖場內(nèi)，家蠅的密度顯著低于管理粗放的養(yǎng)殖場。如在本研究中魚東村奶牛場和西孫村奶牛場為完全開放式養(yǎng)殖，養(yǎng)殖場內(nèi)存在多個(gè)養(yǎng)殖戶，養(yǎng)殖廢棄物亂堆亂棄現(xiàn)象嚴(yán)重，家蠅密度較高；而在養(yǎng)殖規(guī)范程度較高的同和奶牛養(yǎng)殖合作社，養(yǎng)殖環(huán)境為封閉式，養(yǎng)殖廢棄物嚴(yán)格日清，成年奶牛舍、犢牛舍、糧草倉、廢棄物處理區(qū)等均進(jìn)行嚴(yán)格隔離，且定期進(jìn)行蠅類防治，家蠅密度則較低。在養(yǎng)豬場，家蠅的密度也受到養(yǎng)殖場管理水平的影響，在養(yǎng)殖粗放的朱康村養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖環(huán)境較差，廢棄物、污水較多，孳生的家蠅也較多；而在附近的高莊村養(yǎng)殖場，管理水平較高，廢棄物處理較好，養(yǎng)豬場內(nèi)比較整潔，因此家蠅孳生數(shù)量較少；在濟(jì)南綠環(huán)托佩克種豬場，由于養(yǎng)殖數(shù)量較少，與周邊存在樹林等隔離帶，且經(jīng)常進(jìn)行防治，因此家蠅的數(shù)量相對較低。在禽類養(yǎng)殖場，雖然均為封閉式養(yǎng)殖，但由于養(yǎng)殖廢棄物處理不及時(shí)，飼料存在堆放現(xiàn)象，且產(chǎn)生糞便中的蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)含量相對豐富，更適合家蠅等蠅類的孳生。

本研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖場家蠅的密度與其體表攜帶細(xì)菌數(shù)量和種類呈線性相關(guān)關(guān)系，因此養(yǎng)殖場家蠅的密度在一定程度上反映出養(yǎng)殖場的整體管理水平。養(yǎng)殖場內(nèi)家蠅主要孳生于養(yǎng)殖廢棄物(包括糞便、飼料殘?jiān)?，其中存在的大量細(xì)菌及其它病原體，家蠅在孳生過程中，粘附于體表，通過家蠅飛行攜帶到其它區(qū)域，造成病原體的傳播。

家蠅體表攜帶的細(xì)菌多為機(jī)會(huì)性致病細(xì)菌，如Butler等[12]在野生家蠅體表分離到了鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumanni)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)、阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)、大腸埃希菌(EscherichiacoliO157:H7)、甲基桿菌(Methylobacteriumpersicinum)、痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)等細(xì)菌。當(dāng)蠅類得到有效控制的時(shí)候，腹瀉病和志賀氏菌病發(fā)生率可下降42%和85%[13]，兒童的腹瀉比例可下降23%[14]。Shane[15]等研究表明，家蠅還可傳播引起急性腸道傳染病的空腸彎曲菌。在英國，空腸彎曲菌引起腹瀉的發(fā)生與蠅類的密度密切相關(guān)，靠近養(yǎng)殖場或動(dòng)物活動(dòng)區(qū)居民感染彎曲桿菌的比例較高，而在衛(wèi)生條件較好的城市，感染率則較低[11]。

本研究中，在養(yǎng)殖場家蠅體表分離到的細(xì)菌中存在條件致病菌，多數(shù)來自養(yǎng)殖廢棄物，而通過家蠅傳播有污染鮮牛奶、禽蛋等食品中的風(fēng)險(xiǎn)，影響食品安全。另外，養(yǎng)殖場的從業(yè)人員以婦女和老年人為主，在散戶型養(yǎng)殖場內(nèi)，養(yǎng)殖區(qū)與居住區(qū)的分隔不明顯，因此，家蠅體表攜帶的條件致病菌傳播給從業(yè)人員和居住區(qū)的老人、兒童的風(fēng)險(xiǎn)更高，需要引起足夠的重視。在國家倡導(dǎo)健康養(yǎng)殖的主題下，養(yǎng)殖場內(nèi)醫(yī)學(xué)媒介生物的無害化控制也應(yīng)作為重要課題，以減少養(yǎng)殖場內(nèi)病原細(xì)菌通過蠅類在內(nèi)部傳播或擴(kuò)散到周邊，引起疾病的發(fā)生和流行。

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BacteriaonbodysurfaceofMuscadomesticaadultsfromdifferentlivestockfarms

CHEN Dan1, ZHUANG Gui-fen1, HUANG Zhen-dong1, XUE Zhi-jing1, LIU Jing1, LI Yan1, ZHANG Rui-ling1,2, ZHANG Zhong1,2

(1.CollaborativeInnovationCenterfortheOriginandControlofEmergingInfectiousDiseases,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China; 2.DepartmentofPathogenicBiology,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China)

This study aims to isolate and identify the bacteria from the surface ofMuscadomesticaadults in different livestock farms. The adults ofMuscadomesticawere collected with sweep nets, then the surface of adult flies were washed with sterile water,and the eluted bacteria cultured with LB culture medium. The DNA of the bacteria isolated was extracted, 16SrDNA fragment was amplified through general PCR, and the 16SrDNA sequence was blasted with bacteria sequence in NCBI. Results showed that the number ofMuscadomesticaadults and the bacteria from their surface had significant different in different livestock farms. The population density ofMuscadomesticaadults had linear correlation with the number of bacteria fromMuscadomesticaadults and the number of bacteria genus. Among the bacteria isolated fromMuscadomesticaadults,Staphylococcus,Klebsiella,EscherichiaandSerratiawere the most common genus in the livestock farms. Most of the bacteria isolated from livestock farm house flies were opportunistic human bacterial pathogen, and the risk of bacterial pathogens spread to people was existed. The population density of house flies reflected the management level of different livestock farms. The house flies could mechanical transmit opportunistic human bacterial pathogen from livestock residue to human. So the house flies control and the monitoring of bacteria on body surface of house flies carried should be strengthened.

Muscadomestica; livestock farms; bacteria on the body surface of house flies; opportunistic bacteria; fly borne diseases

Zhang Zhong, Email: nasonia@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.001

國家自然科學(xué)基金(Nos.81401693,81572028,81271874)和山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014GSF121007)聯(lián)合資助

張 忠，Email: nasonia@163.com

1.泰山醫(yī)學(xué)院新發(fā)傳染病溯源及防控協(xié)同創(chuàng)新中心，泰安 271016； 2.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，泰安 271016

R384

A

1002-2694(2017)11-0951-05

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81401693, 81572028 and 81271874), the Science and Technology Development Projects of Shandong Province (No. 2014GSF121007)

2016-09-08編輯王曉歡