成 超，李海洋△，葉朝陽，李國煒

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.肝膽外科；2.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴陽 550004)

·經(jīng)驗交流·

波形蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義

成 超1，李海洋1△，葉朝陽2，李國煒1

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.肝膽外科；2.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴陽 550004)

目的探討原發(fā)性肝癌(HCC)組織與癌旁組織中波形蛋白的表達(dá)及其臨床意義。方法收集該院2015年1月至2016年3月30例手術(shù)切除的肝癌組織，離癌2～5 cm(簡稱癌旁近臨)和離癌5 cm以外(簡稱癌旁近遠(yuǎn))組織及患者臨床資料。運用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)檢測組織中波形蛋白表達(dá)，并用Image J軟件及病理評分等對其表達(dá)量進行分析。結(jié)果癌組織、癌旁組織、正常肝組織標(biāo)本里波形蛋白的mRNA分別為8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。癌組織、癌旁近臨和癌旁近遠(yuǎn)組織標(biāo)本里波形蛋白表達(dá)量分別為75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。波形蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤范圍無關(guān)(Pgt;0.05)，與TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(Plt;0.05)。結(jié)論檢測HCC患者的波形蛋白表達(dá)有助于HCC診斷與預(yù)后。

原發(fā)性肝癌；波形蛋白；免疫組織化學(xué)；實時熒光定量PCR；基因表達(dá)

原發(fā)性肝癌(HCC)是發(fā)病率高、治療困難、病死率高的惡性腫瘤之一，全球每年大約有250 000例患者死于HCC，因此受到全球臨床醫(yī)生和研究者的特別關(guān)注，如何早期診斷成為肝癌研究熱點之一。正常分化上皮細(xì)胞不表達(dá)波形蛋白,而波形蛋白通常分布在中胚層來源的間質(zhì)細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。大量研究表明，上皮源性腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)波形蛋白,如乳腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌等[1]，即表現(xiàn)出上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的病理特征，體現(xiàn)為上皮樣功能減弱或消失而間質(zhì)功能增強，并與上皮細(xì)胞纖維化及惡性腫瘤癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。波形蛋白是一種在間質(zhì)中表達(dá)的Ⅲ型中間絲蛋白，在細(xì)胞分裂的時候?qū)θ旧w起支架的作用，并承擔(dān)細(xì)胞中細(xì)胞器的分配和定位[3]。近年研究表明，波形蛋白參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，在腫瘤細(xì)胞遷移、黏附及凋亡中均發(fā)揮重要作用，曾作為間葉組織起源腫瘤的特異性標(biāo)記[4]。據(jù)了解，目前國內(nèi)研究有關(guān)波形蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)狀況報道還較少。本項目用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測波形蛋白在HCC組織、癌旁近臨組織和癌旁近遠(yuǎn)組織標(biāo)本中的表達(dá)狀況，結(jié)合病理特征分析其臨床肝癌診斷意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院肝膽外科2015年1月至2016年3月30例手術(shù)切除的肝癌組織，離癌2～5 cm(簡稱癌旁近臨)和離癌5 cm以外(簡稱癌旁近遠(yuǎn))的組織。其中男24例，女6例，平均年齡(52.2±7.1)歲。所有病例術(shù)前未行放療、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理科檢查證實。標(biāo)本采集后冰塊包被，在15 min內(nèi)放置于-80 ℃冰箱保存。本次研究得到患者的知情同意并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[2014倫審第(83)號]。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測 實時熒光定量PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。分別取肝癌、癌旁及正常肝組織各100 mg，研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL微量離心管中。按照Trizol RMA試劑說明書進行操作。取2 μL RNA樣品，紫外線分光光度儀Nanodrop2000上測定樣品在260 nm和280 nm處吸光度(A)值，評估純度，260/280均在1.65～2.00。

表1 引物序列

1.2.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系20 μL，2 μL總RNA，2 μL Oligo-dt(10 μmol/L),2 μL 10×PCR buffer，2 μL Dntp(5 mmol/L)，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL(4 U/μL)；加入適量的焦碳酸二乙酯使總體積為20 μL，37 ℃、60 min，70 ℃、15 min。最終生成對應(yīng)的cDNA第一鏈。PCR體系20 μL含Maxima SYBR Green 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA模板2 μL，最后加無核酸酶的水將整個反應(yīng)體系補充至20 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min 循環(huán)1次，95 ℃ 10 min 循環(huán)1次，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s循環(huán)40次。試劑購自上海捷瑞生物工程有限公司，實時熒光定量PCR反應(yīng)由ABI Vii7來完成。

1.2.3結(jié)果判定 采用β-actin作為內(nèi)參照，以β-actin內(nèi)參的拷貝數(shù)為校正基數(shù)，實驗各樣本中波形蛋白的Ct值與同標(biāo)本中β-actin內(nèi)參的Ct值相減，為該標(biāo)本的波形蛋白的ΔCt值；以正常肝組織中的波形蛋白與β-actin內(nèi)參的差值ΔCt值作為校正，得出ΔΔCt值(肝癌組織ΔCt-正常肝臟組織ΔCt、癌旁組織ΔCt-正常肝臟組織ΔCt)，按目的基因表達(dá)量(RQ)=2-ΔΔCt,計算癌組織、癌旁組織中波形蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測 每個標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置于20%(w/v)蔗糖溶液(4 ℃)中過夜。組織石蠟包埋后連續(xù)切片，取石蠟切片脫蠟、水化，滴加3%的H2O2-甲醇液30 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加入0.3%Triton-100 30 min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；水洗，加一抗(抗波形蛋白,1∶100)，4 ℃存放24～48 h，吸去抗體，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加0.01 mol/L PBS稀釋的二抗，室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；加入ABC復(fù)合物之類的抗體，室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次，蒸餾水迅速沖3次；加入顯色液，進行免疫組織化學(xué)顯色，時間3～10 min，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時,馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速沖3次后加入0.01 mol/L PBS終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，梯度脫水之后透明、封片、拍照。每組均設(shè)陰性對照，以Tris液替代一抗。SimPlePCI圖像分析系統(tǒng)測定免疫組織化學(xué)測試區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)目、平均灰度級、陽性產(chǎn)物的平均灰度與面積、背景面積進行測量。

本院兩位病理科醫(yī)生按照隨機雙盲原則在光學(xué)顯微鏡下進行讀片，每張切片隨機選取5個(×40)高倍鏡視野，并存取得到文件；按照Image J軟件說明讀取圖片圖像的灰度值。并結(jié)合HCC TNM分期評分標(biāo)準(zhǔn)(2015年)分組。(1)T-原發(fā)病灶：Tx為原發(fā)腫瘤不能測定；T0為無原發(fā)腫瘤的證據(jù)；T1為孤立腫瘤沒有血管受侵；T2為孤立腫瘤，有血管受侵或多發(fā)腫瘤直徑小于或等于5 cm；T3a為多發(fā)腫瘤直徑大于5 cm；T3b為孤立腫瘤或多發(fā)腫瘤侵及門靜脈或肝靜脈主要分支；T4為腫瘤直接侵及周圍組織，或致膽囊或臟器穿孔。(2)N-區(qū)域淋巴腺：Nx為區(qū)域內(nèi)淋巴腺不能測定；N0為無淋巴腺轉(zhuǎn)移；N1為區(qū)域淋巴腺轉(zhuǎn)移。(3)M-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：Mx為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不能測定；M0為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；M1為有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。(4)肝癌分期：Ⅰ期為T1N0M0；Ⅱ期為T2N0M0；ⅢA期為T3aN0M0；ⅢB期為T3bN0M0；ⅢC期為T4N0M0；ⅣA期為任何T，N1M0；ⅣB期為任何T，任何N，M1。

2 結(jié) 果

2.1實時熒光定量PCR檢測 癌組織、癌旁組織及正常肝組織的波形蛋白的mRNA分別為8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見表2。

表2 波形蛋白mRNA在各組織中的表達(dá)

2.2免疫組織化學(xué)檢測 波形蛋白在癌組織中呈強陽性表達(dá)，在癌旁近臨組織及癌旁近遠(yuǎn)組織呈弱陽性表達(dá)，而正常組織里無表達(dá)。癌組織、癌旁近臨和癌旁近遠(yuǎn)組織樣本里波形蛋白表達(dá)量分別為75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見圖1。

A：癌組織；B：癌旁近臨組織；C：癌旁近遠(yuǎn)組織;D:正常組織。

圖1波形蛋白在各組織中病理切片表達(dá)(×400)

2.3臨床病理資料 波形蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤范圍無關(guān)(Pgt;0.05)，與TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(Plt;0.05)。見表3。

表3 波形蛋白在HCC患者中的表達(dá)與臨床病理關(guān)系

續(xù)表3 波形蛋白在HCC患者中的表達(dá)與臨床病理關(guān)系

3 討 論

惡性腫瘤是危害人類健康的主要原因，是目前導(dǎo)致疾病死亡的第二位因素。HCC是危害人類健康的腫瘤疾病,近10年來發(fā)病率逐年升高，由于惡性程度高、起病隱匿，早期診斷率和手術(shù)切除率均很低，且對放療和化療不敏感，預(yù)后差。

惡性腫瘤最具危害性之處在于它的侵襲轉(zhuǎn)移性，HCC的侵襲轉(zhuǎn)移是一個非常復(fù)雜的過程，為很多因素與環(huán)節(jié)相互作用的結(jié)果，其機制尚未清晰。盡管如此，目前人們也認(rèn)識了許多重要的病理過程：惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時，癌細(xì)胞之間的黏附能力下降，細(xì)胞外基質(zhì)框架結(jié)構(gòu)被損壞，癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處擴散轉(zhuǎn)移及癌細(xì)胞擴散到其他部位形成新生血管等[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在HCC細(xì)胞中波形蛋白異常表達(dá)，表現(xiàn)出EMT的病理特征，具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間充質(zhì)細(xì)胞過程，這暗示EMT為HCC細(xì)胞脫離原發(fā)灶侵襲轉(zhuǎn)移鄰近組織提供必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，由此也可能為臨床診斷提供分子標(biāo)記。波形蛋白屬于Ⅲ型中間絲蛋白,是細(xì)胞骨架組成中除微管和微絲之外的第3組分[6]；從胞核到胞膜呈放射狀分布,在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞正常形態(tài)和功能中起重要作用,如細(xì)胞收縮、遷移、增殖、蛋白合成、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和機械力傳導(dǎo)[7]。Tsuruta等[8]用黃色和藍(lán)色熒光蛋白分別標(biāo)記整合素β3和波形蛋白研究表明，波形蛋白通過與整合素β3形成黏著斑來影響細(xì)胞黏附。Ivaska等[9]進一步研究表明，波形蛋白與整合素的黏著與脫附是通過蛋白激酶Cε(PKCε) 的磷酸化與去磷酸化來調(diào)節(jié)的，以實現(xiàn)細(xì)胞移動,是細(xì)胞移動的參與者。上皮源腫瘤細(xì)胞中波形蛋白的高表達(dá)，可能使腫瘤細(xì)胞去分化而“顯現(xiàn)”為更加原始“腫瘤祖細(xì)胞”，并促成EMT。借助或利用間質(zhì)細(xì)胞來實現(xiàn)其侵襲轉(zhuǎn)移[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織、癌旁組織標(biāo)本及正常肝組織標(biāo)本的波形蛋白的mRNA分別為8.97±4.19、2.14±1.12和1.00±0.00,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。癌組織，癌旁近臨和癌旁近遠(yuǎn)組織樣本里波形蛋白表達(dá)量分別為75.22±16.87、41.72±6.19和36.26±4.71，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。有學(xué)者詳細(xì)論述了腫瘤細(xì)胞分泌外泌體作為“先鋒兵”“教唆犯”介導(dǎo)組織器官微環(huán)境的改變，為腫瘤轉(zhuǎn)移定植生長提供有利環(huán)境[11-12]。最新的研究表明，腫瘤細(xì)胞外泌體是通過誘導(dǎo)提高波形蛋白和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的表達(dá)，以促成EMT[13]。筆者推測：HCC細(xì)胞分泌腫瘤外泌體，向周圍組織或血液等擴散，誘導(dǎo)波形蛋白等的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，雖然此時腫瘤細(xì)胞還未侵襲到此處，表現(xiàn)為組織中波形蛋白表達(dá)隨距離HCC組織的近遠(yuǎn)而逐漸降低；隨著癌旁組織里波形蛋白表達(dá)逐漸增加，促成EMT，腫瘤細(xì)胞可能會隨之侵襲到此處。因此，波形蛋白既可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展及惡性程度某種特征因子，同時又是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的“鋪路石”，通過癌細(xì)胞分泌泌外體的擴散，在癌旁組織里誘導(dǎo)其表達(dá)，越靠近癌組織泌外體的濃度越高，促其表達(dá)也越高，還有待于進一步深入的研究。現(xiàn)階段研究表明，波形蛋白對于癌癥患者的診斷依然有爭論，波形蛋白的表達(dá)與癌癥患者療效不佳相關(guān)[14]；體外實驗證明，細(xì)胞外基質(zhì)與化療藥物密切相關(guān)，但是很多研究證實，波形蛋白不能夠預(yù)計癌癥患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率及生存率[15]。

本研究顯示，波形蛋白在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且其表達(dá)與TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤范圍無關(guān)。波形蛋白在肝癌組織的高表達(dá)可能對肝癌有一定的促進作用，這與國內(nèi)外大多數(shù)研究一致。但具體調(diào)節(jié)靶基因類型及其分子機制還需進一步探索。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.035

貴州省省校合作計劃項目(黔科合LH字[2014]7118號)。

成超(1985-)，住院醫(yī)師,碩士,主要從事肝膽外科方面的研究?！?/p>

，E-mail:2690527939@qq.com。

R735.7

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1671-8348(2017)33-4714-04

2017-05-10

2017-08-08)