王 帥 王紅芳 胥保華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜賴氨酸水平

王 帥 王紅芳 胥保華*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

本試驗(yàn)旨在研究意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜賴氨酸水平，為探明意大利蜜蜂工蜂幼蟲發(fā)育階段的賴氨酸營(yíng)養(yǎng)需要提供理論依據(jù)。選用1日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲1 200只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每個(gè)組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)48只。5組工蜂幼蟲分別飼喂賴氨酸實(shí)測(cè)水平為6.08(對(duì)照)、11.08、16.08、21.08和26.08 mg/g的飼糧，飼養(yǎng)至幼蜂羽化出房。分別于特定日齡測(cè)定工蜂幼蟲化蛹率(6日齡)、蟲體總蛋白含量(6日齡)、羽化率(21日齡)等生長(zhǎng)指標(biāo)以及血淋巴生化指標(biāo)和免疫相關(guān)指標(biāo)(6日齡)。結(jié)果表明：1)11.08 mg/g賴氨酸組的工蜂幼蟲化蛹率和羽化率極顯著高于其他各組(P<0.01)。2)與對(duì)照組相比，11.08～26.08 mg/g賴氨酸組6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量和血淋巴中游離賴氨酸含量顯著提高(P<0.05)，其中飼糧賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量和血淋巴中游離賴氨酸含量最高。3)6日齡工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中飼糧賴氨酸水平為16.08 mg/g時(shí)處于最低值，極顯著低于其他各組(P<0.01)。4)11.08～21.08 mg/g賴氨酸組6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但隨著飼糧賴氨酸水平由21.08 mg/g升高到26.08 mg/g，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性急劇下降，26.08 mg/g賴氨酸組顯著低于其他各組(P<0.05)。5)飼糧賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他賴氨酸水平時(shí)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，11.08～16.08 mg/g賴氨酸組6日齡工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。由此得出，賴氨酸能夠促進(jìn)意大利蜜蜂工蜂幼蟲生長(zhǎng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)和賴氨酸的沉積，提高羽化率，并在一定程度上對(duì)脂質(zhì)代謝和幼蟲免疫能力產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用；綜合考慮上述指標(biāo)，推薦意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜賴氨酸水平為11.08～16.08 mg/g。

意大利蜜蜂；工蜂；幼蟲；賴氨酸

賴氨酸是蜜蜂體內(nèi)的一種必需氨基酸[1]，對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育有至關(guān)重要的作用，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪代謝、提高免疫力等方面起到重要作用[2-6]。研究意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧適宜賴氨酸水平對(duì)于科學(xué)、健康飼養(yǎng)意大利蜜蜂具有重要意義。賴氨酸是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的必需氨基酸之一[1]，其在動(dòng)物體內(nèi)不能完全合成，必須從飼糧中獲取，故稱為必需氨基酸。賴氨酸分為L(zhǎng)-型和D-型2種同分異構(gòu)體。D-型賴氨酸幾乎不能被吸收利用，具有生物活性的主要是L-型賴氨酸。諸多試驗(yàn)證明，飼糧中添加適量的賴氨酸可以提高或改善家禽的體重、采食量、體增重、飼料轉(zhuǎn)化率以及胴體品質(zhì)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)適宜的飼糧賴氨酸水平能顯著降低肉仔雞血清尿酸、甘油三酯、極低密度脂蛋白等的含量[2-3]。Kornegay等[4]研究了飼糧中賴氨酸水平與斷奶仔豬免疫功能的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著賴氨酸水平的提高，仔豬卵清蛋白免疫后抗體水平提高。Konashi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧缺乏賴氨酸使蛋白質(zhì)的合成受到抑制，同時(shí)限制了淋巴細(xì)胞的增殖，從而使肉仔雞的免疫力降低，進(jìn)而提高了發(fā)病率和死亡率。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)賴氨酸能提高肉仔雞新城病毒抗體水平，但賴氨酸不足時(shí)會(huì)使肉仔雞抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫降低。適宜的飼糧蛋白質(zhì)類型能夠顯著影響小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高小腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度[9]。De Groot[1]推測(cè)蜜蜂成蜂賴氨酸需要量在0.6%左右。意大利蜜蜂賴氨酸的需要量目前仍無推薦標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)賴氨酸的營(yíng)養(yǎng)功能和需要量的研究是蜜蜂蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)需要研究的重要組成部分，也是科學(xué)配制蜜蜂幼蟲飼糧的基礎(chǔ)。因此，本試驗(yàn)通過研究飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲生長(zhǎng)指標(biāo)、血淋巴生化指標(biāo)及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，確定意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜賴氨酸水平，為意大利蜜蜂的科學(xué)飼養(yǎng)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為意大利蜜蜂工蜂幼蟲，取自蜂群健康、群勢(shì)基本相同的蜂群。試驗(yàn)用賴氨酸為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為L(zhǎng)103479-25 g，純度為98%。

1.2意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧配制

試驗(yàn)采用5種不同賴氨酸水平的人工幼蟲飼糧飼喂意大利蜜蜂工蜂幼蟲，5種飼糧分別標(biāo)記為A、B、C、D、E，A為不額外添加賴氨酸的基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照)，賴氨酸的實(shí)測(cè)水平為6.08 mg/g。B、C、D、E為在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%賴氨酸的試驗(yàn)飼糧，賴氨酸的實(shí)測(cè)水平分別為11.08、16.08、21.08、26.08 mg/g。5種意大利工蜂幼蟲飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 5種意大利工蜂幼蟲飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

總能和賴氨酸均為實(shí)測(cè)值。GE and lysine were measured values.

1.3試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成，供試蜂場(chǎng)為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)試驗(yàn)蜂場(chǎng)。選用1日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲1 200只，隨機(jī)分為5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)48只幼蟲。5組工蜂幼蟲分別飼喂賴氨酸實(shí)測(cè)水平為6.08、11.08、16.08、21.08和26.08 mg/g的飼糧。將1日齡工蜂幼蟲放入48孔板中，每孔添加150 μL飼糧，將培養(yǎng)板放入干燥器(相對(duì)濕度為95%，15%甘油溶液)，干燥器放入培養(yǎng)箱(35 ℃、相對(duì)濕度為90%)中飼養(yǎng)，每天換1次料。培養(yǎng)至6日齡時(shí)，將大幼蟲轉(zhuǎn)移至鋪滿無菌墊紙的24孔板上化蛹(停止飼喂)，9日齡時(shí)將蜂蛹轉(zhuǎn)移至新的鋪滿無菌墊紙的24孔板中，飼養(yǎng)至幼蜂羽化出房。分別于特定日齡測(cè)定工蜂幼蟲化蛹率、體蛋白質(zhì)含量、羽化率等生長(zhǎng)指標(biāo)以及血淋巴生化指標(biāo)和免疫相關(guān)指標(biāo)。

1.4測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 樣本處理方法

每組隨機(jī)選取3只6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲作為分子生物學(xué)樣品，用于研究蜜蜂化蛹前相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。每組隨機(jī)選取3只6日齡工蜂幼蟲進(jìn)行組織勻漿，用生理鹽水配制成1%的勻漿液，一部分于4 ℃條件下3 000 r/min 離心10 min后取上清，另一部分用于測(cè)定工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量；每組隨機(jī)選取100只6日齡幼蟲，采用20 μL的毛細(xì)采血管汲取工蜂幼蟲血淋巴，用于測(cè)定血淋巴中游離賴氨酸、甘油三酯含量和溶菌酶活性。

1.4.2 工蜂幼蟲化蛹率、羽化率的計(jì)算

以重復(fù)為單位，于6日齡統(tǒng)計(jì)化蛹幼蟲數(shù)，于21日齡統(tǒng)計(jì)幼蟲羽化出房總數(shù)，分別計(jì)算化蛹率和羽化率。

化蛹率(%)=100×化蛹幼蟲數(shù)/幼蟲總數(shù)；羽化率(%)=100×幼蟲羽化出房總數(shù)/
化蛹幼蟲數(shù)。

1.4.3 工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的貨號(hào)為A045-2的總蛋白定量測(cè)試盒測(cè)定6日齡幼蟲1%組織勻漿液中總蛋白含量，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量的測(cè)定

采用泉州市科諾迪生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號(hào)為SU-B97004的昆蟲賴氨酸試劑盒測(cè)定6日齡工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量，每組3

個(gè)重復(fù)。

1.4.5 工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量的測(cè)定

采用泉州市科諾迪生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號(hào)為SU-B97002的昆蟲甘油三酯試劑盒測(cè)定6日齡工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯的含量，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4.6 工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性的測(cè)定

采用泉州市科諾迪生物科技有限公司生產(chǎn)的貨號(hào)為SU-B97001的昆蟲溶菌酶試劑盒測(cè)定6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4.7 工蜂幼蟲蟲體溶菌酶、防衛(wèi)素1基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

采用Trizol法提取樣品總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將提取的總RNA樣品立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度于相同水平后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? μL cDNA(5倍稀釋)加入到20 μL熒光定量PCR體系中，按照熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)操作指南，用PCR儀檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托上海生工生物科技有限公司合成引物，引物序列見表2。

表2 基因引物序列

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。結(jié)果以柱形圖或折線圖表示。

2 結(jié) 果

2.1飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率的影響

由圖1可知，6日齡工蜂幼蟲化蛹率隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲化蛹率達(dá)到峰值，且11.08 mg/g賴氨酸組極顯著高于其他各組(P<0.01)。當(dāng)飼糧賴氨酸水平由11.08 mg/g逐漸升高到26.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲化蛹率呈梯度下降的趨勢(shì)，且16.08、21.08和26.08 mg/g賴氨酸組之間差異極顯著(P<0.01)，其中21.08和26.08 mg/g賴氨酸組極顯著低于對(duì)照組和11.08 mg/g賴氨酸組(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱或數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Date columns or date points with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲化蛹率的影響

Fig.1 Effects of dietary lysine level of pupation rate of 6-day-old worker bee larvae

2.2飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲羽化率的影響

由圖2可知，21日齡工蜂幼蟲羽化率隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)，21日齡工蜂幼蟲羽化率達(dá)到峰值，且11.08 mg/g賴氨酸組極顯著高于其他各組(P<0.01)。當(dāng)飼糧賴氨酸水平由11.08 mg/g逐漸升高到26.08 mg/g時(shí)，21日齡工蜂幼蟲羽化率呈梯度下降的趨勢(shì)，且16.08、21.08和26.08 mg/g賴氨酸組之間差異極顯著(P<0.01)，其中21.08和26.08 mg/g賴氨酸組極顯著低于對(duì)照組和11.08 mg/g賴氨酸組(P<0.01)。

圖2 飼糧賴氨酸水平對(duì)21日齡工蜂幼蟲羽化率的影響

2.3飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量的影響

由圖3可知，隨著飼糧賴氨酸水平的升高，6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量總體呈上升趨勢(shì)。與飼料賴氨酸水平為6.08 mg/g時(shí)相比，飼糧賴氨酸水平為11.08～26.08 mg/g時(shí)6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量顯著升高(P<0.05)，其中賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

圖3 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量的影響

2.4飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量的影響

由圖4可知，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量隨著飼糧賴氨酸水平的升高整體呈上升趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平由6.08 mg/g升高到11.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量顯著增加(P<0.05)；飼糧賴氨酸水平為11.08～26.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量隨飼糧賴氨酸水平的升高有所增加，各組間差異雖未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量的影響

由圖5可知，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量隨著飼糧賴氨酸水平的升高整體呈先下降后上升趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為16.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量達(dá)到最低值，極顯著低于其他各組(P<0.01)。

圖4 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量的影響

圖5 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量的影響

2.6飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性的影響

由圖6可知，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性隨著飼糧賴氨酸水平的升高整體呈拋物線形。飼糧賴氨酸水平由6.08 mg/g升高到11.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性表現(xiàn)為顯著上升(P<0.05)；飼糧賴氨酸水平為11.08～21.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性隨飼糧賴氨酸水平的升高無顯著變化(P>0.05)，但顯著高于飼糧賴氨酸水平為6.08 mg/g時(shí)(P<0.05)；飼糧賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性急劇下降至最低值，顯著低于其他各組(P<0.05)。

圖6 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性的影響

2.7飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖7可知，6日齡工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，且顯著高于其他各組(P<0.05)；當(dāng)飼糧賴氨酸水平由11.08 mg/g逐漸升高到26.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量呈梯度下降的趨勢(shì)，其中16.08 mg/g賴氨酸組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，21.08、26.08 mg/g賴氨酸組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖7 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.8飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖8可知，6日齡工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因的相對(duì)表達(dá)量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為11.08～16.08 mg/g時(shí)6日齡工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到較高水平，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；當(dāng)飼糧賴氨酸水平繼續(xù)升高至21.08、26.08 mg/g時(shí)，6日齡工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因的相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，與11.08、16.08 mg/g賴氨酸組差異顯著(P<0.05)，但與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖8 飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡工蜂幼蟲防衛(wèi)素1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率、羽化率的影響

意大利蜜蜂的化蛹率和羽化率，是直接反映意大利蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)。通過研究必需氨基酸缺乏或者蛋白質(zhì)缺乏對(duì)昆蟲生長(zhǎng)、生殖等的影響，發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂營(yíng)養(yǎng)缺乏會(huì)縮短其壽命、降低其產(chǎn)卵力、抑制其腺體發(fā)育、使其體重下降及抗病力下降等[10-11]。營(yíng)養(yǎng)因素是影響意大利蜜蜂級(jí)型分化的一個(gè)重要因素，并且能夠影響意大利蜜蜂幼蟲的發(fā)育過程，如在空間因素一定的情況下，營(yíng)養(yǎng)水平能夠決定幼蟲發(fā)育成蜂王還是工蜂[12]。由此推斷，影響蜜蜂化蛹和羽化的因素可能很多，其中營(yíng)養(yǎng)因素的作用不容忽視，營(yíng)養(yǎng)不良的意大利蜜蜂幼蟲可能不能正?；己陀鸹?，相反，營(yíng)養(yǎng)充足的意大利蜜蜂幼蟲可能更容易正常羽化和發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲的化蛹率和羽化率均有極顯著影響，飼糧賴氨酸水平過低或過高均可能會(huì)導(dǎo)致意大利蜜蜂工蜂幼蟲不能正?；己陀鸹暭Z賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)最有利于意大利蜜蜂工蜂幼蟲正常的化蛹和羽化。

3.2飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量的影響

賴氨酸主要用于蛋白質(zhì)沉積，還參與酶蛋白和某些多肽激素的合成，因此與生長(zhǎng)密切相關(guān)。賴氨酸作為機(jī)體必需氨基酸，參與體內(nèi)骨骼肌、酶、血清蛋白、多肽激素等多種蛋白質(zhì)的合成。早期的動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)，長(zhǎng)期進(jìn)食低賴氨酸飼糧會(huì)抑制大鼠的生長(zhǎng)，降低大鼠血清白蛋白和β-球蛋白含量，肝臟蛋白質(zhì)的合成也受到抑制[13]。已有研究表明賴氨酸可以通過自噬體-溶酶體系統(tǒng)抑制部分肌纖維蛋白質(zhì)降解，維持機(jī)體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[14]。Haunerland[15]研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲貯藏蛋白在昆蟲變態(tài)發(fā)育時(shí)期具有重要作用，主要是作為氨基酸貯存庫(kù)，為昆蟲發(fā)育構(gòu)成組織架構(gòu)。因此，昆蟲貯藏蛋白的多少是衡量昆蟲能否發(fā)育完全的一個(gè)重要指標(biāo)。由此也可以推測(cè)，昆蟲蟲體總蛋白越豐富，昆蟲發(fā)育的可能越健全。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量存在顯著影響，蟲體總蛋白含量隨著飼糧賴氨酸水平的升高總體呈上升趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為6.08～11.08 mg/g時(shí)處于上升范圍；飼糧賴氨酸水平為11.08～21.08 mg/g時(shí)，蟲體總蛋白含量隨飼糧賴氨酸水平的升高無顯著變化，但顯著高于對(duì)照組；飼糧賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)，蟲體總蛋白含量達(dá)到峰值，顯著高于其他各組。綜上可知，飼糧賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量最高。

3.3飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量的影響

賴氨酸作為機(jī)體必需氨基酸，參與體內(nèi)骨骼肌、酶、血清蛋白、多肽激素等多種蛋白質(zhì)的合成[13]。賴氨酸是產(chǎn)生肉堿的前體物質(zhì)，而肉堿負(fù)責(zé)將一些不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為能量，參與脂肪代謝，有利于降低膽固醇水平。蜜蜂的免疫機(jī)制需要賴氨酸的參與，賴氨酸對(duì)蜜蜂的免疫系統(tǒng)有至關(guān)重要的作用[16]。Ma等[17]研究表明，飼糧賴氨酸水平對(duì)山羊血清中賴氨酸含量具有顯著影響。由此推斷，賴氨酸類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在一定水平范圍內(nèi)可能會(huì)隨營(yíng)養(yǎng)水平的增加在體液中的含量逐漸增加，但是超過機(jī)體所需的最適水平后吸收效率及利用率可能會(huì)降低。本研究中發(fā)現(xiàn)飼糧賴氨酸水平對(duì)6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸含量的影響差異顯著，飼糧賴氨酸水平為6.08～11.08 mg/g時(shí)，血淋巴中游離賴氨酸含量會(huì)隨飼糧賴氨酸水平的升高呈升高趨勢(shì)，但當(dāng)飼糧賴氨酸水平增加至11.08～26.08 mg/g時(shí)，血淋巴中游離賴氨酸含量持續(xù)保持在較高水平，不再出現(xiàn)顯著上升，但均顯著高于對(duì)照組。綜上認(rèn)為，飼糧賴氨酸水平為11.08～26.08 mg/g時(shí)，意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中游離賴氨酸的含量可保持在較高水平。

3.4飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量的影響

斯日古楞[2]研究了飼糧賴氨酸水平對(duì)0～3周齡肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)適宜賴氨酸水平對(duì)0～3周齡雄性肉仔雞血清中甘油三酯的含量顯著影響，隨著飼糧賴氨酸水平的升高，血清中甘油三酯的含量先降低再升高。陳志敏等[3]研究發(fā)現(xiàn)飼料中適宜的賴氨酸水平能降低0～3周齡雄性肉仔雞血清中尿酸、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量。本研究中發(fā)現(xiàn)飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量存在極顯著影響，血淋巴中甘油三酯含量隨飼糧賴氨酸水平的升高整體呈先下降后上升趨勢(shì)。飼糧賴氨酸水平為16.08 mg/g時(shí)，血淋巴中甘油三酯含量達(dá)到最低值，極顯著低于對(duì)照組；當(dāng)飼糧賴氨酸水平繼續(xù)升高至16.08～26.08 mg/g時(shí)，血淋巴中甘油三酯含量呈梯度上升趨勢(shì)，且這3組之間差異極顯著；飼料賴氨酸水平為11.08、16.08、26.08 mg/g時(shí)與對(duì)照組相比差異極顯著。這可能是因?yàn)轱暭Z中適宜水平的賴氨酸能夠提高意大利蜜蜂工蜂幼蟲的脂肪代謝，使得工蜂幼蟲對(duì)脂肪的利用率提高，從而減少了血淋巴中甘油三酯的含量。綜上認(rèn)為，飼糧賴氨酸水平為16.08 mg/g時(shí)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中甘油三酯含量最低。

3.5飼糧賴氨酸水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性以及蟲體溶菌酶和防衛(wèi)素1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

Kornegay等[4]研究了飼糧賴氨酸水平與斷奶仔豬免疫功能的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著賴氨酸水平的升高，仔豬卵清蛋白免疫后抗體水平提高。Konashi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧缺乏賴氨酸使蛋白質(zhì)的合成受到抑制，同時(shí)限制了淋巴細(xì)胞的增殖，從而使肉仔雞免疫力降低，進(jìn)而提高了發(fā)病率和死亡率。Chen等[6]也發(fā)現(xiàn)，賴氨酸能提高肉仔雞的新城病毒抗體水平，但賴氨酸缺乏時(shí)會(huì)使肉仔雞抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫降低。蜜蜂的免疫機(jī)制有細(xì)胞免疫和體液免疫2種，細(xì)胞免疫主要依靠增加血細(xì)胞的吞噬、成瘤和包囊作用，體液免疫主要是通過提高血漿中某些物質(zhì)的含量來發(fā)揮免疫能力。體液免疫包括先天性免疫因子和后天性免疫因子。先天性免疫因子包括溶菌酶、凝集素、抑血細(xì)胞聚集素和酚氧化酶，后天性免疫因子包括防衛(wèi)素、富脯氨酸抗菌肽和抗真菌肽。其中所有昆蟲防衛(wèi)素的序列中在α-螺旋和β-片層第1鏈之間都含有強(qiáng)陽(yáng)離子氨基酸(精氨酸和賴氨酸)。在大部分防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)角區(qū)與C-末端也有陽(yáng)離子氨基酸存在，推測(cè)序列內(nèi)這些帶電荷的區(qū)域?qū)Ψ佬l(wèi)素的作用方式具有意義[16]。因此，蜜蜂的免疫機(jī)制需要賴氨酸的參與，賴氨酸對(duì)蜜蜂的免疫系統(tǒng)有至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧賴氨酸水平為6.08～11.08 mg/g時(shí)，意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性隨飼糧賴氨酸水平的升高呈上升趨勢(shì)；飼糧賴氨酸水平為11.08～21.08 mg/g時(shí)，意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性隨飼糧賴氨酸水平的升高無顯著變化，但顯著高于對(duì)照組；飼糧賴氨酸水平為21.08～26.08 mg/g時(shí)，意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性隨飼糧賴氨酸水平的升高呈下降趨勢(shì)。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)溶菌酶基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值；意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體防衛(wèi)素1基因的相對(duì)表達(dá)量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在賴氨酸水平為11.08～16.08 mg/g時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到較高水平。綜上認(rèn)為，飼糧賴氨酸水平為11.08～16.08 mg/g時(shí)，賴氨酸能最大限度地提升意大利蜜蜂工蜂幼蟲的免疫力。

4 結(jié) 論

① 飼糧賴氨酸水平為11.08 mg/g時(shí)能顯著提高意大利蜜蜂工蜂幼蟲的化蛹率、羽化率以及蟲體溶菌酶和防衛(wèi)素1基因的表達(dá)。

② 飼糧賴氨酸水平為16.08 ～21.08 mg/g時(shí)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴中溶菌酶活性以及防衛(wèi)素1基因的表達(dá)均有不同程度的提高，但當(dāng)飼糧賴氨酸水平超過16.08 mg/g后，化蛹率、羽化率以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)又會(huì)受到抑制。

③ 意大利蜜蜂工蜂幼蟲蟲體總蛋白含量和血淋巴中游離賴氨酸含量隨飼糧賴氨酸水平的升高呈逐漸上升的趨勢(shì)，飼糧賴氨酸水平為26.08 mg/g時(shí)，蟲體總蛋白含量和血淋巴中游離賴氨酸含量均處于最高值。

④ 綜合考慮以上指標(biāo)，推薦意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜賴氨酸水平為11.08～16.08 mg/g。

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*Corresponding author, professor, E-mail： bhxu@sdau.edu.cn

DietaryAppropriateLysineLevelforApismelliferaligusticaWorkerBeeLarvae

WANG Shuai WANG Hongfang XU Baohua*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China)

The objective of this experiment was to research the appropriate level of lysine in the diet forApismelliferaligusticaworker bee larvae, and to provide the theoretical basis for the study of lysine requirement ofApismelliferaligusticaworker bee in larvae stage. A total of 1 200 one-day-oldApismelliferaligusticaworker bee larvae were randomly divided into 5 groups with 5 replicates per group and 48 larvae per replicate. The worker bee larvae in 5 groups were fed diets with the measured level of lysine was 6.08 (control), 11.08, 16.08, 21.08 and 26.08 mg/g until emergence, respectively. The growth indexes, such as pupation rate (6-day-old), total protein content in whole body (6-day-old), eclosion rate (21-day-old), and the hemolymph biochemical parameters and immune related indicators (6-day-old) of worker bee larvae were measured to certain age, respectively. The results showed as follows: 1) the pupation rate and eclosion rate of worker bee larvae in 11.08 mg/g lysine group were extremely significantly higher than those in other groups (P<0.01). 2) Compared with the control group, the total protein content in whole body and the free lysine content in hemolymph of 6-day-old worker bee larvae in 11.08 to 26.08 mg/g lysine groups were significantly increased (P<0.05), and the highest values of them were found in 26.08 mg/g lysine group. 3) The hemolymph triglyceride content of 6-day-old worker bee larvae was decreased firstly and then increased with dietary lysine level increasing, and the lowest value was found in 16.08 mg/g lysine group which was extremely significantly lower than that in other groups (P<0.01). 4) The haemolymph lysozyme activity of 6-day-old worker bee larvae was significantly higher than that of control group (P<0.05), but with dietary lysine level was increased from 21.08 to 26.08 mg/g, the haemolymph lysozyme activity decreased rapidly, and it in 26.08 mg/g lysine group was significantly lower than that in other groups (P<0.01). 5) When dietary lysine level was 11.08 mg/g, the relative expression level of lysozyme gene of 6-day-old worker bee larvae was the highest, which was significantly higher than that of the other lysine levels (P<0.05). Compared with the control group, the relative expression level of defensin 1 gene of 6-day-old worker bee larvae in 11.08 to 16.08 mg/g lysine groups was significantly increased (P<0.05). In conclusion, lysine can promote the growth ofApismelliferaligusticaworker bee larvae, promote the deposition of protein and lysine, increase the rate of eclosion, and regulate the lipid metabolism and the immunity of larvae to some extent. Based on the above indexes, it is recommended that the appropriate lysine level in the diet ofApismelliferaligusticaworker bee larvae is 11.08 to 16.08 mg/g.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4236-4244]

Apismelliferaligustica; worker bee; larvae; lysine

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.048

S816

A

1006-267X(2017)11-4236-09

2017-04-11

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-45);山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)蜜蜂及蠶桑新品種培育(2014—2016)”

王 帥(1993—)，男，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯錉I(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail： 619130691@qq.com

*通信作者：胥保華，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： bhxu@sdau.edu.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)