李 爽 張鐵鷹* 廖朝勇 梁爭文 馬霞飛 劉俊麗

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

地衣芽孢桿菌CP-16脂類水解酶的研究

李 爽1張鐵鷹1*廖朝勇1梁爭文1馬霞飛2劉俊麗1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

本試驗旨在通過異源表達(dá)獲得地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CP-16的脂類水解酶，并探究其在羽毛降解過程中的作用。試驗以地衣芽孢桿菌CP-16基因組DNA為模板，擴(kuò)增脂類水解酶基因，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中表達(dá)，獲得重組酶L-4。研究重組酶L-4的適宜pH、pH穩(wěn)定性、適宜溫度、溫度穩(wěn)定性以及有機(jī)溶劑和金屬離子對其相對活性的影響，同時探究其對角蛋白酶K水解天然羽毛角蛋白的作用。結(jié)果顯示，獲得的脂類水解酶基因大小為747 bp，編碼248個氨基酸，在大腸桿菌中成功表達(dá)出重組酶L-4，其分子質(zhì)量約為28.3 ku，酯酶活性為0.42 U/mL，適宜pH為6.5，適宜溫度為50 ℃；在pH 6.5～9.5條件下處理30 min相對活性保持80%以上，在低于50 ℃溫度條件下處理30 min相對活性保持70%以上。二價鐵離子(Fe2+)、鈉離子(Na+)、錳離子(Mn2+)、鈣離子(Ca2+)對重組酶L-4相對活性具有激發(fā)作用，鋇離子(Ba2+)、鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)、鎳離子(Ni2+)對重組酶L-4相對活性具有抑制作用。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度為30%時，重組酶L-4在二甲基亞砜(DMSO)和甲醇中保存97%和85%的相對活性，在丙酮、乙醇中保存45%以上的相對活性，在異丙醇中保存不到20%的相對活性，而在乙腈中相對活性基本完全喪失。用重組酶L-4預(yù)處理天然羽毛底物，可提高角蛋白酶K對底物的水解效率，促進(jìn)率為4.32%。由此可見，脂類水解酶可降解羽毛表層脂質(zhì)，可在促進(jìn)角蛋白酶水解羽毛角蛋白中發(fā)揮作用。

地衣芽孢桿菌；脂類水解酶；角蛋白；羽毛脂質(zhì)；克隆表達(dá)

我國蛋白質(zhì)飼料資源短缺，長期依賴進(jìn)口，這種現(xiàn)狀很難在短期內(nèi)改變。我國每年屠宰家禽達(dá)100多億只，可產(chǎn)生羽毛70～80萬t。羽毛粗蛋白質(zhì)含量高(85%)、成本低、含硫氨基酸豐富，是一種良好的蛋白質(zhì)資源。若將這部分資源充分開發(fā)利用，不僅能夠緩解我國蛋白質(zhì)飼料資源短缺的現(xiàn)狀，且能減輕其對環(huán)境的污染。目前，羽毛加工處理方法主要有物理、化學(xué)和生物方法。物理、化學(xué)方法存在能耗高、氨基酸被破壞嚴(yán)重、污染環(huán)境等弊端。生物方法主要利用角蛋白降解菌或其產(chǎn)生的酶對角蛋白進(jìn)行處理。其中，利用角蛋白降解菌降解角蛋白的同時會產(chǎn)生利用率較低的菌體蛋白，而生物酶水解角蛋白則可將角蛋白直接水解為利用率較高的小肽和氨基酸。目前，利用角蛋白水解酶處理羽毛角蛋白越來越受到重視，已顯示出巨大的應(yīng)用前景。羽毛表面由脂質(zhì)包裹[1-4]，大部分為尾脂腺分泌的混合脂類[5]，少量為細(xì)胞膜層脂類。表層脂質(zhì)是難于降解的復(fù)雜混合物，形成羽毛與外界物質(zhì)接觸的天然屏障。羽毛內(nèi)部為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的角蛋白，分子內(nèi)存在大量二硫鍵、氫鍵以及疏水基團(tuán)，不易降解。破壞羽毛表層脂質(zhì)是提高角蛋白酶水解羽毛角蛋白效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。探究脂類水解酶在降解羽毛表層脂質(zhì)中的作用，將完善羽毛酶解體系，為羽毛角蛋白高效酶解處理提供指導(dǎo)。

天然羽毛經(jīng)過物理化學(xué)脫脂處理后性質(zhì)均會發(fā)生改變。羽毛經(jīng)氫氧化鈉(NaOH)溶液處理后，實際接觸角下降，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6]。王德山等[7]將羽毛經(jīng)石油醚脫脂處理后發(fā)現(xiàn)，多種蛋白酶水解脫脂羽毛的速度均有提高，最高可達(dá)1倍。大量研究發(fā)現(xiàn)，多種角蛋白降解菌均可產(chǎn)生脂類水解酶。Vasileva-Tonkova等[8]在研究羽毛廢棄物降解中，發(fā)現(xiàn)20種放線菌在羽毛培養(yǎng)基中均產(chǎn)生了脂肪酶。Zhang等[9]在弗氏鏈霉菌發(fā)酵液中檢測到了脂肪酶活性。王德山等[7]在地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CP-16發(fā)酵液和胞內(nèi)液均檢測到脂肪酶活性，發(fā)酵液和胞內(nèi)液脂肪酶活性分別為6和1 U/mL。由此推測，角蛋白降解菌產(chǎn)生的脂類水解酶可能在降解羽毛表層脂質(zhì)、促進(jìn)角蛋白酶水解羽毛效率中發(fā)揮作用，但有關(guān)這方面研究報道較少。因此，本研究通過獲得羽毛高效降解菌地衣芽孢桿菌CP-16的脂類水解酶，探究其在角蛋白酶K水解羽毛角蛋白中的作用，進(jìn)一步完善羽毛的酶解體系，為羽毛角蛋白的高效酶解提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 菌株來源

地衣芽孢桿菌CP-16為本實驗室前期篩選保存的羽毛高效降解菌株，大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α和BL21(DE3)購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 載體和工具酶

pMD19-T載體、DNA聚合酶(LA Taq)、DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司，T4 DNA連接酶購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI購自NEB公司，pET-22b載體為本實驗室保存。

角蛋白酶K購自濟(jì)南諾能生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗試劑

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)、5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)均購自Promega公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，鎳瓊脂糖凝膠柱購自北京康為世紀(jì)公司，α-乙酸萘酯(1-naphthyl acetate)、固藍(lán)B鹽購自美國Sigma公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基：酵母提取物0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，氯化鈉1.0 g，去離子水100 mL，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基(含Amp)：酵母提取物0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂粉1.5～2.0 g，去離子水100 mL，自然pH，121 ℃滅菌30 min。冷卻至55～60 ℃添加Amp至終濃度為100 μg/mL，傾倒平板，4 ℃保存。

1.2試驗方法

1.2.1 目的基因克隆

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取地衣芽孢桿菌CP-16的基因組，具體操作按說明書進(jìn)行。

在Uniprot(http://www.uniprot.org/)中搜索地衣芽孢桿菌脂類水解酶蛋白質(zhì)序列，得到脂類水解酶基因全長序列。根據(jù)所得的序列設(shè)計引物擴(kuò)增全長基因，正反向引物分別引入BamHI、XhoI酶切位點，引物序列(下劃線處為酶切位點序列)如下：

上游引物：5′-CGGGATCCGAAAATTGTCAAACC*-3′，

下游引物：5′-CCGCTCGAGTGTCTGCCAATC*-3′。

PCR反應(yīng)程序根據(jù)所用的DNA聚合酶說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMD19-T在16 ℃條件下連接12 h，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中。經(jīng)過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定的陽性克隆，送交北京擎科公司進(jìn)行重組基因序列測定。測序結(jié)果采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行對比分析，并將序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，篩選出可用于下一步試驗的陽性克隆。

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組酶菌株的表達(dá)

用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI酶切質(zhì)粒pMD19-T-L-4和載體pET-22b。酶切后獲得的基因L-4和載體pET-22b于25 ℃下，用T4 DNA連接酶連接2 h。將連接后的表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-L-4轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)Amp抗性得到潛在陽性克隆。培養(yǎng)擴(kuò)增后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，酶切鑒定，最后測序鑒定獲得連接正確的表達(dá)質(zhì)粒。將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建表達(dá)重組酶菌株。

挑取陽性單菌落接種到LB培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Amp)。37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)得到種子液。種子液按2%的接種量接于50 mL LB培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Amp)，37 ℃培養(yǎng)至吸光度(OD)值0.5～0.6。經(jīng)IPTG(終濃度0.2 mmol/L，30 ℃，4 h)誘導(dǎo)表達(dá)后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心，分別收集上清和沉淀。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組蛋白及包涵體蛋白純化復(fù)性

對超聲破碎后收集的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE，檢測蛋白表達(dá)形式和產(chǎn)量。包涵體蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，純化后的包涵體蛋白溶解于含8 mol/L尿素的洗脫緩沖液中。將包涵體蛋白純化后的蛋白液以合適的濃度裝入處理好的透析袋中。將透析袋放入復(fù)性液中(依次含6、4、2和0 mol/L尿素)，在4 ℃條件下進(jìn)行透析。每個濃度梯度復(fù)性液中透析時間為24 h，保證尿素充分析出。在復(fù)性液中透析完成后放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中繼續(xù)透析24 h。在透析過程中，用磁力攪拌器勻速攪拌使透析袋中的尿素析出，變性蛋白逐漸復(fù)性。

1.2.4 酯酶活性測定

酯酶活性測定參考劉春紅等[10]和梁爭文等[11]的方法。具體步驟：吸取50 μL待測酶液，加入磷酸鹽緩沖液800 μL，再加入50 μL α-乙酸萘酯底物溶液，50 ℃恒溫水浴10 min，加入3%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液終止反應(yīng)，混勻后加入50 μL 0.02%的固蘭B鹽溶液顯色，混勻計時30 s后，再加入50 μL的鹽酸溶液混勻使顯色穩(wěn)定。采用保溫前添加SDS的反應(yīng)管作為對照。用酶標(biāo)儀檢測并記錄535 nm處OD值。

1.2.5 重組酶L-4的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 重組酶L-4適宜pH和pH穩(wěn)定性

適宜pH：在50 ℃條件下，分別在甘氨酸-鹽酸(pH 2.5～3.0)、檸檬酸-檸檬酸鈉(pH 3.5～5.0)、無水嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液(pH 5.5～6.5)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉(pH 7.0～8.0)和三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(pH 8.5～9.5)15種不同pH(每隔0.5為1個測定點)緩沖體系中測定酶活性，每個處理3個重復(fù)，確定其酶促反應(yīng)適宜pH。

pH穩(wěn)定性：將重組酶與不同pH緩沖液按1∶9的體積比稀釋混勻后，放置50 ℃水浴中處理30 min，然后于冰水混合物中冷卻30 min，每個處理3個重復(fù)。50 ℃條件下測定殘余酶活性。未處理的重組酶液作為對照，計算各pH緩沖液處理后重組酶L-4的殘余酶活性占對照酶活性百分比。

1.2.5.2 重組酶L-4適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

適宜溫度：在適宜pH條件下，在30～80 ℃(每隔5 ℃為1個測試點)的各溫度條件下測定酶活性，每個處理3個重復(fù)，確定其酶促反應(yīng)適宜溫度。

溫度穩(wěn)定性：將重組酶L-4在不同溫度(0～80 ℃，每隔10 ℃為1個測試點)下處理30 min，冰水浴30 min，適宜pH條件下測定殘余酶活性。未處理的重組酶液作為對照，計算各溫度條件下處理的重組酶L-4殘余酶活性占對照酶活性的百分比。

1.2.5.3 有機(jī)溶劑對重組酶L-4活性的影響

將甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈6種有機(jī)溶劑(30%、80%的終濃度)與重組酶L-4在30 ℃保溫60 min后，迅速冰水浴30 min，測定殘余酶活性，每個處理3個重復(fù)。以未加有機(jī)溶劑的對照酶活性為100%。

1.2.5.4 金屬離子對重組酶L-4活性的影響

將溶于適宜pH緩沖液的10 mmol/L金屬離子[鈉離子(Na+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)、鈣離子(Ca2+)、鋇離子(Ba2+)、二價鐵離子(Fe2+)、鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)、鉀離子(K+)、鎳離子(Ni2+)、三價鐵離子(Fe3+)]與重組酶L-4液等體積混合，在30 ℃保溫60 min，冰水浴30 min，測定殘余酶活性，每個處理3個重復(fù)。以未加金屬離子對照酶活性為100%。

1.2.6 重組酶L-4對角蛋白酶水解羽毛的影響

1.2.6.1 重組酶L-4與角蛋白酶組合共同降解羽毛作用

測定重組酶L-4、角蛋白酶K二者單獨(dú)和組合時降解羽毛角蛋白的角蛋白酶活。綜合考慮2種酶的酶學(xué)性質(zhì)，選擇在50 ℃、pH 8.0的Tris-HCl緩沖體系中測定角蛋白酶活性。角蛋白酶活性測定方法參照王德山[12]的方法，具體操作步驟如下：吸取1.0 mL待測酶液，加入2.0 mL含有底物羽毛粉(5 mg/mL)的0.05 mol/L，pH 9.5的Tris-HCl緩沖液。適宜溫度條件下，180 r/min振蕩反應(yīng)1 h。反應(yīng)過程中為防止底物羽毛粉聚沉，每隔10 min取出反應(yīng)液混勻。反應(yīng)結(jié)束后立即加入

10%三氯乙酸2.0 mL終止反應(yīng)。反應(yīng)液靜置5 min，10 000 r/min離心10 min(必要時二次離心)。取上清液測其280 nm處OD值，空白對照為保溫前加終止劑的樣品。酶組合的配比方法按表1進(jìn)行。

1.2.6.2 重組酶L-4預(yù)處理天然羽毛底物的作用

將重組酶L-4與天然羽毛底物(5 mg/mL)等體積混合，50 ℃水浴處理1 h，然后在55 ℃條件下測定角蛋白酶K的角蛋白酶活性，每個處理3個重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.3進(jìn)行初步整理和統(tǒng)計，并用軟件GraphPad Prism 5做圖，繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因克隆及測序

以地衣芽孢桿菌CP-16基因組DNA為模板擴(kuò)增基因全長。瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，從圖1可知條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致。

擴(kuò)增獲得全長747 bp的基因序列。具有完整開放閱讀框，編碼248個氨基酸。重組酶L-4基因序列及推測編碼氨基酸序列如下。

2.2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的基因與質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)T4 DNA連接酶將二者連接后轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α。對陽性克隆進(jìn)行菌液PCR初步鑒定后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖2)，結(jié)果顯示表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DNA標(biāo)記物(100～2 000 bp)；1、2：目的基因L-4。

M: DNA marker (100～2 000 bp); 1, 2: target geneL-4.

圖1目的基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1 PCR amplification of target gene

2.3重組酶菌株誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體純化復(fù)性

將鑒定正確的E.coliBL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測表達(dá)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，重組酶L-4進(jìn)行了成功表達(dá)，表達(dá)蛋白大小與預(yù)測值28.3 ku大小相符。進(jìn)一步對超聲上清和超聲沉淀分析(圖4)，重組酶L-4表達(dá)蛋白主要以包涵體的形式存在超聲沉淀中。對表達(dá)菌體超聲破碎收集包涵體蛋白，通過鎳瓊脂糖凝膠柱純化并進(jìn)行梯度尿素透析復(fù)性，得到活性酶蛋白。測定酯酶活性為0.42 U/mL。

M：DNA標(biāo)記物(100～2 000 bp)；1：重組質(zhì)粒pET-22b-L-4；2：單酶切重組質(zhì)粒pET-22b-L-4；3：雙酶切重組質(zhì)粒pET-22b-L-4。

M: DNA marker (100～2 000 bp); 1: recombinant plasmidspET-22b-L-4; 2: enzyme digestion of recombinant plasmidspET-22b-L-4; 3: double enzyme digestion of recombinant plasmidspET-22b-L-4.

圖2酶切結(jié)果

Fig.2 Results of enzyme digestion

2.4重組酶L-4酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 重組酶L-4適宜pH和pH穩(wěn)定性

由圖5可見，重組酶L-4適宜pH為6.5，在pH 5.5～7.0內(nèi)其相對活性能夠較好保持(60%以上)，pH超出此范圍內(nèi)其相對活性急劇下降。重組酶L-4在pH 6.5～9.5內(nèi)處理30 min相對活性保持在80%以上，穩(wěn)定性較好，屬于中性脂類水解酶。

M：彩虹蛋白標(biāo)記物；1：重組酶L-4誘導(dǎo)前；2：重組酶L-4誘導(dǎo)后。

M: rainbow protein marker; 1: before induction of recombinant enzyme L-4; 2: after induction of recombinant enzyme L-4.

圖3重組酶L-4誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析1

Fig.3 SDS-PAGE analysis 1 of inducible

expression of recombinant enzyme L-4

2.4.2 重組酶L-4適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖6可見，重組酶L-4的適宜反應(yīng)溫度為50 ℃，在30～50 ℃相對活性較高(65%以上)，高于50 ℃時，相對活性急劇下降，高于65 ℃時相對活性基本完全喪失。在低于55 ℃的溫度中處理30 min，重組酶L-4相對活性可穩(wěn)定保持90%以上。綜合適宜溫度與溫度穩(wěn)定性，脂類水解酶L-4屬于中溫酶類。

M：彩虹蛋白標(biāo)記物；1、2、3：分別為重組酶L-4誘導(dǎo)后全菌液、超聲上清、超聲沉淀。

M: rainbow protein marker; 1, 2 and 3: whole bacteria fluid, ultrasonic supernatant and ultrasonic sediment of after induction of recombinant enzyme L-4.

圖4重組酶L-4誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析2

Fig.4 SDS-PAGE analysis 2 of inducible

expression of recombinant enzyme L-4

2.4.3 有機(jī)溶劑對重組酶L-4相對活性的影響

由圖7可見，當(dāng)有機(jī)溶劑終濃度為30%時，重組酶L-4在DMSO中可保存相對活性97%，在甲醇中可保存相對活性85%，在丙酮和乙醇中可保存相對活性45%以上，而在異丙醇中保存相對活性不到20%，在乙腈中相對活性基本完全喪失。當(dāng)有機(jī)溶劑終濃度為80%時，重組酶L-4僅在甲醇和異丙醇中保存較低相對活性，在其他有機(jī)溶劑中相對活性基本完全喪失。

2.4.4 金屬離子對重組酶L-4相對活性的影響

由圖8可見，金屬離子濃度為10 mmol/L時，F(xiàn)e2+、Na+、Mn2+、Ca2+對重組酶L-4相對活性具有激活作用，Ba2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+對重組酶L-4相對活性有抑制作用，其他金屬離子對相對活性的影響較小。Fe2+的激活作用最明顯，可使重組酶L-4相對活性提高1倍；Cu2+的抑制作用最為明顯，僅保存相對活性的7.53%。

圖5 pH對重組酶L-4相對活性的影響及pH穩(wěn)定性

圖6 溫度對重組酶L-4相對活性的影響及溫度穩(wěn)定性

圖7 有機(jī)溶劑對重組酶L-4相對活性的影響

2.5重組酶L-4對角蛋白酶K水解羽毛的影響

2.5.1 重組酶L-4與角蛋白酶K組合共同降解羽毛的作用

從表2可以看出，重組酶L-4不具有角蛋白酶活性，且重組酶L-4和角蛋白酶K混合共同降解角蛋白，影響角蛋白酶K的活性。重組酶L-4對角蛋白酶K酶解羽毛底物起到負(fù)面作用，其原因有待進(jìn)一步探討。

2.5.2 重組酶L-4預(yù)處理天然羽毛底物的作用

從表3可以看出，重組酶L-4對底物(天然羽毛)進(jìn)行預(yù)處理，測定角蛋白酶K的角蛋白酶活性，重組酶預(yù)處理天然羽毛底物對角蛋白酶K的活性有提高趨勢，促進(jìn)率為4.32%。

圖8 金屬離子對重組酶L-4相對活性的影響

項目Items酶活性Enzymeactivity/(U/mL)重組酶L-4RecombinationenzymeL-4—角蛋白酶KKeratinaseK37.00重組酶L-4+角蛋白酶KRecombinationenzymeL-4+keratinaseK—

—：未測出 not detected。

表3 重組酶L-4預(yù)處理底物的作用

3 討 論

E.coli是現(xiàn)代研究中運(yùn)用最多、研究最成熟的基因工程原核表達(dá)系統(tǒng)，其主要優(yōu)點是易繁殖、生產(chǎn)成本低、表達(dá)外源基因產(chǎn)量高、遺傳圖譜和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制明確[13]。以E.coli為表達(dá)宿主時，表達(dá)速度快，修飾作用少，不能將表達(dá)的蛋白質(zhì)有效的分泌至胞外[14]。本研究中表達(dá)的重組酶L-4以包涵體的形式存在，表達(dá)量較高，但大部分無生物活性。在工業(yè)化生產(chǎn)中，E.coli表達(dá)脂類水解酶沒有優(yōu)勢，仍需繼續(xù)探討其他表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)情況。

酶學(xué)性質(zhì)決定了酶蛋白在生產(chǎn)中的應(yīng)用潛質(zhì)和領(lǐng)域。重組酶L-4包涵體經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化和梯度尿素復(fù)性獲得有活性的酶蛋白，并對其性質(zhì)進(jìn)行研究。脂肪酶適宜pH一般在6.0～8.0的弱酸偏堿的范圍內(nèi)，pH的穩(wěn)定范圍一般在4.0～11.0之間[15-17]。本研究獲得的重組酶L-4其適宜pH為6.5，在pH 6.5～9.5之間具有良好的穩(wěn)定性，在此pH范圍緩沖液中處理30 min，能保持80%以上的相對活性。這可能與地衣芽孢桿菌CP-16以羽毛角蛋白為唯一碳源和氮源有關(guān)。地衣芽孢桿菌CP-16在發(fā)酵過程中進(jìn)行脫氨作用產(chǎn)生碳骨架作為碳源，脫氨作用使發(fā)酵液隨時間呈堿性變化[18]。地衣芽孢桿菌CP-16產(chǎn)生的蛋白酶為堿性蛋白酶[12]，加快角蛋白降解，為地衣芽孢桿菌CP-16提供更多養(yǎng)分，有利于生存。

重組酶L-4適宜溫度為50 ℃，在低于55 ℃的溫度中處理30 min，相對活性穩(wěn)定，屬于中溫脂類水解酶。脂肪酶的適宜反應(yīng)溫度一般在30～50 ℃[19-20]。不同來源的脂肪酶溫度穩(wěn)定性存在區(qū)別，有研究者篩選到耐高溫脂肪酶[21]，其適用性更加廣泛。工業(yè)生產(chǎn)中紙漿脫脂脫墨、母乳脂肪代替品結(jié)構(gòu)油脂1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)的生產(chǎn)，都需要耐熱良好的脂肪酶參與[22-23]。

金屬離子可以作為酶的激活劑或抑制劑，通過組成酶活性中心，穩(wěn)定酶的構(gòu)象，連接酶與底物而影響酶活性。本試驗中，金屬離子濃度為10 mmol/L時，F(xiàn)e2+、Na+、Mn2+、Ca2+對重組酶L-4相對活性具有激發(fā)作用，Ba2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+對相對活性具有抑制作用，Cu2+的抑制作用最為明顯。閻金勇[24]研究結(jié)果表明，Ba2+對脂肪酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，與本研究的結(jié)果相反，這可能與酶基因類型不同有關(guān)。很多酶促反應(yīng)是在非水相的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的，如脂肪酸酯、生物柴油的合成[25-26]，有機(jī)溶劑對酶活性的影響也很值得探究。當(dāng)有機(jī)溶液濃度為30%時，重組酶L-4在DMSO、甲醇中保持較高相對活性，在丙酮、乙醇中保存相對活性45%以上，異丙醇、乙腈中相對活性基本喪失。當(dāng)有機(jī)溶液濃度為80%時，對重組酶L-4相對活性的影響特別大，活性基本損失。

羽毛表面的脂類主要為尾脂腺分泌的脂類混合物，存在多種酯化方式，包括脂肪族單酯類、二酯類[27]。傳統(tǒng)的脫脂方法包括堿性溶液皂化法、表面活性劑乳化法、有機(jī)溶劑法[28]。傳統(tǒng)脫脂方法不僅污染環(huán)境，且處理后的羽毛仍含有大量的化學(xué)試劑，很難在動物飼料中利用。脂類水解酶是具有催化酯鍵水解和生成的一類水解酶，包括酯酶和脂肪酶，可實現(xiàn)高效環(huán)保脫脂。微生物酶解脫脂，在羊毛加工工藝中廣泛應(yīng)用，常利用脂肪酶去除表層疏水性脂類物質(zhì)[4,29]，角質(zhì)酶水解纖維中的脂肪酸酯[30]。王平[31]通過脂肪酶、角質(zhì)酶、角蛋白酶綜合作用對羊毛改性加工。多個角蛋白降解菌發(fā)酵液中檢測到了脂肪酶活性[7-9]，但角蛋白降解菌脂類水解酶對天然羽毛角蛋白降解影響的研究尚未見報道。在研究脂類水解酶對角蛋白酶水解羽毛的影響中，將重組酶L-4和角蛋白酶K混合處理角蛋白1 h，測定角蛋白酶活性。發(fā)現(xiàn)2種酶共同作用時角蛋白酶活性不如單獨(dú)用角蛋白酶處理時，脂類水解酶可能對角蛋白酶的活性產(chǎn)生影響。這種現(xiàn)象的具體原因及影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在實際羽毛降解菌發(fā)揮作用時，這2種酶作用時間可能存在先后關(guān)系。用重組酶L-4預(yù)處理天然羽毛底物后，可以促進(jìn)角蛋白酶K對底物的水解作用，促進(jìn)率為4.32%。說明重組酶L-4對降解羽毛表面的脂質(zhì)起到一定的作用。脂類水解酶將羽毛表面的脂質(zhì)水解，增加了羽毛的親水性，促進(jìn)角蛋白酶直接作用于羽毛角蛋白。但重組酶L-4促進(jìn)角蛋白酶的效率不高，有待進(jìn)一步挖掘地衣芽孢桿菌CP-16降解羽毛脂質(zhì)較快的其他脂類水解酶。

4 結(jié) 論

① 從地衣芽孢桿菌CP-16基因組中擴(kuò)增脂類水解酶基因，在E.coli中成功表達(dá)，獲得重組酶L-4。

② 重組酶L-4適宜溫度為50 ℃，適宜pH為6.5，在堿性環(huán)境條件下活性相對穩(wěn)定，F(xiàn)e2+、Na+、Mn2+、Ca2+對其相對活性有促進(jìn)作用。重組酶L-4在有機(jī)溶液DMSO中保持相對活性97%，甲醇中保持相對活性85%，丙酮、乙醇中保存相對活性45%以上，其他有機(jī)溶劑使其相對活性基本喪失。

③ 重組酶L-4預(yù)處理天然羽毛底物1 h后，對角蛋白酶K水解底物有促進(jìn)趨勢但效率不高。

④ 脂類水解酶將羽毛表面的脂質(zhì)水解，增加了羽毛的親水性，促進(jìn)角蛋白酶直接作用于羽毛角蛋白。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: zhty999@163.com

ResearchonLipolyticEnzymesfromBacilluslicheniformisCP-16

LI Shuang1ZHANG Tieying1*LIAO Chaoyong1LIANG Zhengwen1MA Xiafei2LIU Junli1

(1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100193,China2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

In order to explore the influence of lipolytic enzyme on feather degradation, the lipolytic enzyme gene ofBacilluslicheniformisCP-16 was cloned and heterologous expressed in this research. The target gene of recombinant enzyme L-4, which was usedBacilluslicheniformisCP-16 genome DNA as a template, amplified lipid hydrolase gene, and then transferred intoEscherichiacolifor expression of the targeted gene. The optimum pH, pH stability, temperature, temperature stability and effects of organic solvents and metal ions on relative activity of the recombinant enzyme L-4 were determined, and its application on keratin K hydrolyzed natural feather keratin was also investigated. The results showed that the length of lipid hydrolase gene was 747 bp, encoded 248 amino acids, the recombinant enzyme L-4 was successfully expressed inEscherichiacoli, and the molecular weight was about 28.3 ku, the esterase activity was 0.41 U/mL, the optimum pH was 6.5, the optimum temperature was 50℃. The relative activity of recombinant enzyme L-4 kept above 80% treated with 30 min under pH 6.5 to 9.5 condition, and the relative activity kept above 70% treated with 30 min under below 50 ℃ condition. The ferrous iron (Fe2+), sodion (Na+),manganese ion (Mn2+) and calcium ion (Ca2+) had an stimulative effect on the relative activity of recombinant enzyme L-4, while the barium ion (Ba2+), zinc ion (Zn2+), copper ion (Cu2+) and nickel ion (Ni2+) had an disincentive effect on the relative activity of recombinant enzyme L-4. When the concentration of organic solvent was 30%, the relative activity of recombinant enzyme L-4 kept 85% and 97% in methanol and dimethyl sulfoxide solutions, the relative activity kept above 45% in acetone and ethanol solutions, the relative activity kept less than 20% in isopropanol solution, while the relative activity was complete loss in acetonitrile solution. The pretreatment of natural feather substrates with recombinant enzyme L-4 promoted the hydrolysis of keratinase K to the substrate, and the promotion rate is 4.32%. In conclusion, lipolytic enzymes can degrade feather surface lipids and it may play a role in promoting keratin hydrolysis of feather keratin.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4048-4057]

Bacilluslicheniformis; lipolytic enzymes; keratin; feather lipid; cloning and expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.026

TQ925+.2

A

1006-267X(2017)11-4048-10

2017-05-02

國家自然科學(xué)基金面上項目(31470122)

李 爽(1992—)，女，河南安陽人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail： 15236286917@163.com

*通信作者:張鐵鷹，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： zhty999@163.com

(責(zé)任編輯 武海龍)