王 雄 李孟偉 馬 杰 陳清華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

牛膝多糖對仔豬腸上皮細胞免疫應(yīng)激的調(diào)控及其作用機制

王 雄1李孟偉2馬 杰1陳清華1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

本試驗旨在考察牛膝多糖(ABPS)對脂多糖(LPS)免疫應(yīng)激下仔豬空腸上皮細胞(IPEC-J2)促炎細胞因子分泌和表達的影響，并探討ABPS調(diào)控IPEC-J2免疫應(yīng)激可能的作用機制。選用4～5代的IPEC-J2，培養(yǎng)基中分別添加0(對照)、300、600、900、1 200 μg/mL ABPS和10 μg/mL LPS，每組12個重復(fù)，每孔為1個重復(fù)。培養(yǎng)72 h后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測ABPS對促炎細胞因子白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)分泌量的影響，采用實時定量PCR測定Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的mRNA表達量，采用Western blot法測定TLR4、NF-κB、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB(p-NF-κB)蛋白表達量。結(jié)果顯示：與對照組相比，300、600、900和1 200 μg/mL ABPS組能顯著減少IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌量(P<0.05)；300 μg/mL ABPS組能顯著減少p-NF-κB蛋白的表達量(P<0.05)，900和1 200 μg/mL ABPS組能顯著減少TLR4、NF-κB的mRNA和NF-κB蛋白的表達量(P<0.05)。由此可見，ABPS通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控促炎細胞因子的分泌，從而緩解免疫應(yīng)激，低濃度ABPS通過直接抑制NF-κB磷酸化過程來降低免疫應(yīng)激，高濃度ABPS則是通過抑制TLR4 mRNA、NF-κBmRNA和NF-κB蛋白的表達量來緩解免疫應(yīng)激。

牛膝多糖；對脂多糖；促炎細胞因子；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子κB

腸道是機體消化和營養(yǎng)吸收的主要器官，也是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。腸道的功能直接影響到動物的健康[1]。腸上皮細胞在腸腔內(nèi)起到重要的生理作用，其不僅負責吸收腸腔內(nèi)的營養(yǎng)元素，同時感知外源異物的刺激，參與腸道免疫應(yīng)答[2]。研究顯示，脂多糖(LPS)這種革蘭氏陰性菌的代謝產(chǎn)物是導(dǎo)致豬腸道功能紊亂的主要因素之一，其作用機制是通過激活腸上皮細胞中的Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號，觸發(fā)細胞內(nèi)的炎性反應(yīng)，促使促炎細胞因子的大量釋放[3-4]。最近的研究表明，植物提取物是一種潛在的營養(yǎng)性添加劑，能起到改善腸道功能的作用。牛膝多糖(Achyranthesbidentatapolysaccharides，ABPS)是從莧科植物牛膝的根中提取、分離和純化的水溶性小分子中性多糖，具有增強動物機體免疫、抵抗炎癥等功能[5-6]。動物試驗的結(jié)果表明，ABPS的添加能夠改善仔豬的腸道功能，減少血液循環(huán)中促炎細胞因子的濃度[7-8]。袁媛等[9]試驗表明，黃芪多糖能通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制NF-κB活化，降低促炎細胞因子的釋放，保護腸道健康。但是ABPS改善腸道功能的分子機制還尚不明確。ABPS也屬于多糖類，作者提出假設(shè)，ABPS通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響促炎細胞因子的釋放，從而改善腸道健康。

本試驗將以仔豬空腸上皮細胞(IPEC-J2)為模型，探討ABPS對LPS應(yīng)激的IPEC-J2的炎癥細胞因子的影響，探討IPEC-J2是否通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來緩解免疫應(yīng)激，研究結(jié)果可幫助人們了解ABPS保護腸道受損的分子機制，也為ABPS在動物生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞株

IPEC-J2由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所惠贈。

1.2主要藥品與試劑

ABPS購自西安天瑞科技生物有限公司，純度98%；LPS購自Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%豬胰蛋白酶、雙抗試劑購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、細胞凍存液購自Gibco公司；中性磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Biotopped公司。

1.3細胞培養(yǎng)

選用4～5代的IPEC-J2，培養(yǎng)在含有DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS、1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、95%濕度)內(nèi)培養(yǎng)。取處在對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，在DMEM/F12培養(yǎng)基中分別混入0(對照)、300、600、900、1 200 μg/mL的ABPS和10 μg/mL 的LPS，每組12個重復(fù)(1個12孔板)，每孔為1個重復(fù)，每孔接種相同密度的細胞。培養(yǎng)72 h后，首先采用預(yù)熱至37 ℃后的PBS洗滌3次，然后采用預(yù)熱至37 ℃后的0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min，加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

1.4IPEC-J2細胞因子分泌量的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法測定細胞因子白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌量，按照試劑盒說明書的方法和步驟進行測定。裂解細胞后，將配制好的各種試劑移至18～25 ℃室溫平衡至少30 min，備用；將標準品、待測樣本加至包被的酶標板，37 ℃溫育2 h；棄去液體，甩干，加入生物素標記工作液，37 ℃溫育1 h；棄去液體，PBS洗板3次，甩干，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記親和素，37 ℃溫育1 h；棄去液體，PBS洗板5次，甩干，加入底物溶液，37 ℃避光顯色15～30 min，加入終止液，終止反應(yīng)；終止反應(yīng)5 min，用酶標儀在450 nm波長測定吸光度(OD)值。

1.5實時定量PCR(RT-qPCR)檢測IPEC-J2中TLR4和NF-κB的mRNA表達量

細胞經(jīng)胰酶消化后，離心，提取總RNA，總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，最后得到的總RNA溶解于超純水中。所提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(圖1)，無DNA污染條帶?？俁NA分別用分光光度計在260與280 nm下檢測，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0方可采用。

圖1 總RNA提取電泳圖

采用相同濃度的總RNA樣品按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀)說明書要求配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總體系30 μL。用于實時定量PCR 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)于-20 ℃保存。目的基因序列在NCBI上搜索，基因引物設(shè)計采用Primer 5軟件，引物序列參數(shù)見表1。采用SYBRGreenⅠ法，反應(yīng)在熒光定量RCP儀PIKO REAL 96(Thermo)上進行。每個樣本每個指標3個孔，每孔10 μL，共30 μL體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2×SYBRGreen PCR Master Mix 15 μL，加滅菌去離子水至30 μL。擴增反應(yīng)條件為:50 ℃、3 min；95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后自60～95 ℃繪制熔解曲線。測定結(jié)果用2-ΔΔCt法計算mRNA的表達量,用內(nèi)參基因β肌動蛋白(β-actin)對各基因表達水平進行均一化，計算公式如下：

△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct;-ΔΔCt=對照組ΔCt-試驗組ΔCt；mRNA表達量=2-ΔΔCt。

1.6Westernblot法測定IPEC-J2中TLR4、NF-κB和磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB(p-NF-κB)蛋白表達量

洗滌細胞后離心2 min，棄去上清液。加入裂解液，混勻；冰上裂解蛋白30 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min，待測。按照50∶1配制二辛可酸(BCA)溶液，混勻。溶解的蛋白質(zhì)標準品濃度為2 mg/mL；分別按0、1、2、3、4、5和6 μL加到96孔板中，用蒸餾水補到20 μL。加待測樣品到96孔板中，補到20 μL；各孔分別加200 μL BCA溶液，37 ℃靜置30 min。根據(jù)標準品的測定結(jié)果繪制標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。取50～100 μg蛋白與5×上樣緩沖液混勻后，沸水煮5 min變性，放入冰盒速凍。已變性蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-變性梯度凝膠電泳(PAGE)分離，分離膠12%，濃縮膠5%。濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，洗膜。用1×TBST將一抗按照一定比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。用1×TBST稀釋HRP標記的二抗(Proteintech公司)，稀釋比例1∶3 000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min。孵育結(jié)束，1×TBST洗3次，每次15 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo公司)與膜孵育3 min，用吸水紙吸盡液體，在暗盒內(nèi)于X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘；顯影沖洗。

蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，平均值的多重比較用Duncan氏法進行，結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2細胞因子分泌量的影響

表2顯示，與對照組相比，300、600、900和1 200 μg/mL ABPS組細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌量顯著降低(P<0.05)，300、600、900和1 200 μg/mL ABPS組間細胞因子分泌量差異顯著(P<0.05)，且IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌量與ABPS添加濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著ABPS添加濃度的增加而減少。

表2 ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2細胞因子分泌量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same row with different letter superscripts differ significantly (P<0.05).

2.2ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2中TLR4和NF-κB的mRNA表達量的影響

圖2顯示，與對照組相比，900和1 200 μg/mL ABPS組TLR4和NF-κB的mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，300 μg/mL ABPS組TLR4和NF-κB的mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，600 μg/mL ABPS組TLR4和NF-κB的mRNA表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)，但低于對照組。TLR4和NF-κB的mRNA表達量與ABPS添加濃度呈一定的量效關(guān)系，隨著ABPS添加濃度的增加而減少。

數(shù)據(jù)柱形標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Data columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖2ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2中TLR4(a)和NF-κB的mRNA表達量(b)的影響

Fig.2 Effects of ABPS on mRNA expression levels ofTLR4 (a) andNF-κB(b) in IPEC-J2 under LPS immunological stress

2.3ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2中TLR4、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達量的影響

圖3顯示，與對照組相比，300 μg/mL ABPS組TLR4蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)，600、900和1 200 μg/mL ABPS組TLR4蛋白表達量與對照組差異不顯著(P>0.05)；1 200 μg/mL ABPS組NF-κB蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，300、600和900 μg/mL ABPS組NF-κB蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)；300 μg/mL ABPS組p-NF-κB蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)，600、900和1 200 μg/mL ABPS組p-NF-κB蛋白表達量與對照組差異不顯著(P<0.05)。

3 討 論

腸上皮細胞是抵御病原菌通過腸道進入機體的第1道防線。IPEC-J2細胞來源于1日齡小豬的空腸組織，常作為腸道上皮細胞的模型來研究微生物對腸道的感染[10-11]。大量研究結(jié)果表明，腸上皮細胞在病原微生物入侵腸道或受到LPS刺激時，能分泌促炎細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等[12-14]。本試驗結(jié)果也證實了LPS可以導(dǎo)致IPEC-J2細胞分泌促炎細胞因子。促炎細胞因子的大量釋放可誘導(dǎo)腸上皮細胞凋亡，增強細胞免疫和體液免疫介導(dǎo)的組織損傷過程，趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位，引起一系列腸道炎癥反應(yīng)和組織破壞，進而導(dǎo)致仔豬腹瀉和水腫等癥狀的出現(xiàn)[4]，因此減少促炎細胞因子的過量分泌有利于仔豬腸道健康。ABPS能通過調(diào)控機體促炎細胞因子的釋放來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用。陳清華等[15]和Chen等[16]研究表明，ABPS可提高仔豬血清中促炎細胞因子TNF-α、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6的分泌量；ABPS也能提高仔豬肝臟、空腸黏膜和腸系膜淋巴結(jié)的IL-1β基因表達水平。王紅權(quán)等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在草魚飼糧中添加ABPS也能提高血清中TNF-α的分泌量。但當機體接受LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致促炎細胞因子大量釋放時，ABPS能抑制促炎細胞因子的分泌。朱惠玲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ABPS能夠顯著緩解LPS所致的仔豬血漿中的TNF-α升高。張文俊[7]研究結(jié)果也表明，ABPS能抑制LPS導(dǎo)致的仔豬血漿中促炎細胞細胞因子分泌量的升高。徐小娟[19]發(fā)現(xiàn)ABPS能降低TNF-α的活性，從而降低小鼠炎癥反應(yīng)。諸多動物試驗的結(jié)果表明，ABPS的添加能夠改善仔豬的腸道功能，然而ABPS是否能通過調(diào)控腸上皮細胞促炎細胞因子的釋放來發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用尚不明確。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜濃度的ABPS可抑制LPS所致IPEC-J2分泌IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α，這為ABPS能緩解腸道免疫應(yīng)激提供了理論依據(jù)，為進一步研究ABPS對IPEC-J2的免疫調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

圖3 ABPS對LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2中TLR4 (a)、NF-κB (b)和p-NF-κB (c)蛋白表達量的影響

TLR4是天然免疫系統(tǒng)中的跨膜受體，也是LPS的主要識別受體[20]。TLR4接受LPS刺激后，將信號傳到細胞內(nèi)，通過髓樣細胞分化基因88(MyD88)依賴和非依賴的信號通路激活NF-κB[21]，導(dǎo)致促炎因子的大量釋放，啟動機體炎癥反應(yīng)。NF-κB是TLR4下游調(diào)控免疫反應(yīng)的一組多效性核轉(zhuǎn)錄因子，其主要發(fā)揮調(diào)控細胞增殖與凋亡、免疫炎癥反應(yīng)的作用[22]。參與炎癥反應(yīng)的重要促炎細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6等均已證實可受NF-κB調(diào)控[23]。研究發(fā)現(xiàn)，某些植物多糖能通過抑制NF-κB活化而發(fā)揮其抗炎免疫作用[24-26]。本試驗結(jié)果顯示，高濃度ABPS能顯著降低LPS免疫應(yīng)激下TLR4、NF-κB的mRNA和NF-κB蛋白的表達量，低濃度ABPS能顯著降低p-NF-κB蛋白的表達量。這表明ABPS通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制LPS免疫應(yīng)激下IPEC-J2促炎細胞因子的釋放，從而緩解免疫應(yīng)激對腸道的損傷；但不同濃度的ABPS發(fā)揮作用的進程有區(qū)別，低濃度ABPS通過直接抑制NF-κB磷酸化過程來降低免疫應(yīng)激，高濃度ABPS則是通過抑制TLR4的mRNA、NF-κB的mRNA和NF-κB蛋白表達量來緩解免疫應(yīng)激。

4 結(jié) 論

ABPS通過TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控促炎細胞因子的分泌，從而緩解免疫應(yīng)激，低濃度ABPS通過直接抑制NF-κB磷酸化過程來降低免疫應(yīng)激，高濃度ABPS則是通過抑制TLR4的mRNA、NF-κB的mRNA和NF-κB蛋白的表達量來緩解免疫應(yīng)激。

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*Corresponding author, professor, E-mail: chqh314@163.com

AchyranthesbidentataPolysaccharides:RegulationonImmunologicalStressinPigletIntestinalEpithelialCellsandItsActionMechanism

WANG Xiong1LI Mengwei2MA Jie1CHEN Qinghua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.BuffaloResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530001,China)

The purpose of this research was to investigate the effects ofAchyranthesbidentatapolysaccharides (ABPS) on secretions and expressions of proinflammatory cytokines in piglets jejunum epithelial cells (IPEC-J2) under the immunological stress of lipopolysaccharide (LPS), and to explore the possible mechanism of ABPS to regulate the immune stress of IPEC-J2. The 4th and 5th passages of IPEC-J2 were selected and cultured with 0 (control), 300, 600, 900 and 1 200 μg/mL ABPS, respectively, and both with 10 μg/mL LPS. Each group had 12 replicates with 1proe as 1 replicate. After cultured for 72 h, secretions of proinflammatory cytokines [interleukin (IL-1), interleukin 6 (IL-6), interleukin 8 (IL-8) and tumor necrosis factor α (TNF-α)] were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method, expression levels of Toll-like receptor 4 (TLR4) and nuclear factor κB (NF-κB) mRNAs were detected by real time quantitive PCR, and expression levels of TLR4, NF-κB and phosphorylated nuclear factor κB (p-NF-κB) proteins were detected by Western blot method. The results showed as follows: compared with control group, secretions of IL-1, IL-6, IL-8 and TNF-α were significantly decreased in 300, 600, 900 and 1 200 μg/mL ABPS groups (P<0.05); 300 μg/mL ABPS group significantly reduced p-NF-κB protein expression level (P<0.05); 900 and 1 200 μg/mL ABPS group significantly reduced the expression levels ofNF-κB andTLR4 mRNAs, and NF-κB protein (P<0.05). In conclusion, ABPS control the release of proinflammatory cytokines and relieve immune stress through TLR4/NF-κB signal transduction pathway, low concentration of ABPS reduce immune stress by inhibiting NF-κB phosphorylation process, high concentration of ABPS alleviate immune stress by inhibitingTLR4 mRNA,NF-κBmRNA and NF-κB protein expressions.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4116-4122]

Achyranthesbidentatapolysaccharides; lipopolysaccharide; proinflammatory cytokines; Toll-like receptor 4; nuclear factor κB

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.034

S828

A

1006-267X(2017)11-4116-07

2017-05-11

湖南省教育廳重點項目“牛膝多糖通過TLR4信號通路調(diào)控仔豬腸道樹突狀細胞成熟的研究”(14A067)

王 雄(1991—)，男，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向為飼料資源開發(fā)與利用。E-mail: 188735129@qq.com

*通信作者:陳清華，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: chqh314@163.com

(責任編輯 王智航)