武曉琳 趙春燕 江海洋 范聰聰 王麗波

吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原微生物學系1(130021) 吉林大學第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科2

實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮claudin-1、-2、-4表達改變*

武曉琳1趙春燕1江海洋1范聰聰1王麗波2#

吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原微生物學系1(130021)吉林大學第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科2

緊密連接蛋白質(zhì)類； 惡唑酮； 結(jié)腸炎,潰瘍性； 細胞因子類

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一組反復發(fā)作的慢性炎癥性腸道疾病，影響包括兒童在內(nèi)的幾乎各個年齡段的人群，已成為全球性疾病[1]。然而，其病因尚未完全闡明，目前普遍認為UC的致病因素可能包括遺傳、免疫異常、環(huán)境、腸道微生物等的相互作用，最終導致結(jié)腸炎癥的發(fā)生[2]。腸黏膜屏障受損可能是導致UC發(fā)生的病理基礎(chǔ)。近年發(fā)現(xiàn)位于上皮細胞頂側(cè)的緊密連接改變在腸道屏障功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，緊密連接主要由claudin蛋白、occuludin蛋白、JAM等結(jié)構(gòu)蛋白分子共同組成[3]。來源于植物或水果的提取物(如姜黃素、槲皮素、蘋果原漿等)已在Caco-2細胞株中證實可通過抑制激酶或促使轉(zhuǎn)錄因子表達來調(diào)節(jié)claudin表達，從而增加跨上皮電阻，改善腸上皮屏障功能。上述實驗結(jié)論可能延伸到人小腸上皮，從而對腸相關(guān)疾病的研究起積極作用[4-6]。目前claudin在UC病因、診斷、預后以及治療中的分子機制研究少見。本研究通過給予惡唑酮誘導大鼠實驗性結(jié)腸炎模型，并檢測claudin蛋白表達，旨在探討緊密連接在UC中的作用，從而為其用于UC的診治提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料

清潔級雌性Wistar大鼠(吉林大學動物實驗中心)40只，體質(zhì)量180～210 g。惡唑酮購自Sigma公司；claudin-1兔多克隆抗體購自ImmunoWay公司；claudin-2兔多克隆抗體購自Abcam公司；claudin-4山羊多克隆抗體購自Santa Cruz公司；GAPDH鼠單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；RNAiso Plus試劑盒、SuperPrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Erase試劑盒和SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase均購自TaRaKa公司；IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α大鼠ELISA檢測試劑盒均購自R&D公司。

二、研究方法

1.動物分組與造模方法：按照Abdin[7]的實驗方法，將大鼠分為模型組和正常對照組，每組各20只。大鼠禁食不禁水1 d，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將一直徑2 mm的靜脈輸液管由肛門輕緩插入至8 cm處，模型組大鼠注射濃度為7.5 mg/mL的惡唑酮1.1 mL，正常對照組注射等體積0.9% NaCl溶液，倒置1 min，以利藥物與腸壁充分接觸而不致于經(jīng)肛門溢出。結(jié)束后，動物平躺，自然清醒，自由飲食。每日觀察并記錄各組大鼠存活狀況，精神狀態(tài)、進食、活動、排便等情況。

2.標本采集：造模后第7天，10%水合氯醛麻醉大鼠，取結(jié)腸組織。部分結(jié)腸組織以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，行HE染色和免疫組化染色，剩余結(jié)腸組織置于液氮中保存，用于實時PCR和蛋白質(zhì)印跡法。

3.觀察指標：①造模后存活率：主要觀察模型組大鼠死亡情況。②造模后一般情況：包括大鼠飲食、體質(zhì)量、排便、皮毛、活動情況、精神狀態(tài)等情況。③造模后結(jié)腸組織損傷大體形態(tài)評分和組織學評分方法：大體評分指標包括黏連、局部充血、潰瘍和炎癥。黏連和充血按有無以及輕重程度分別計0、1、2分，出現(xiàn)炎癥、潰瘍數(shù)目增加1個、潰瘍直徑>2 cm時每增加1 cm計分均加1分。組織學評分指標包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、纖維化以及病變深度，按有無和輕重程度分別計0、1、2分，病變深度達黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分，各項相加得總評分。④HE染色：光學顯微鏡下觀察組織炎癥和潰瘍情況。

4.ELISA法：取各組大鼠血清和結(jié)腸組織，按照ELISA試劑盒說明書，設置標記標準孔和樣品孔后分別加入待測樣本10 μL、樣本稀釋液40 μL以及檢測抗體100 μL，封板膜封住反應孔，37 ℃恒溫箱孵育1 h，清洗反應板。每孔先后加入底物A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育15 min。最后加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔A值。

5.免疫組化染色：取各組大鼠結(jié)腸組織切片二甲苯脫蠟，3% H2O2孵育30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS洗滌，1% BSA封閉30 min后滴加一抗(claudin-1、-2、-4工作濃度分別為1∶100、1∶300、1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗滌，加入二抗。DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為陽性表達。

6.實時PCR法：提取結(jié)腸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。各目的基因的引物序列見表1，反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。上CFX 96TMRealTime System(Bio-Rad)熒光定量儀，具體步驟按照說明書進行。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析樣本中目的基因mRNA相對表達量。

7.蛋白質(zhì)印跡法：提取結(jié)腸組織全蛋白并測定蛋白含量。取60 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入抗claudin-1抗體(工作濃度1∶200)、抗claudin-2抗體(工作濃度1∶300)、抗claudin-4抗體(工作濃度1∶200)4 ℃過夜，次日用TBST洗滌3次，加入二抗孵育1 h，化學發(fā)光ECL放射自顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件處理分析蛋白條帶灰度值。

表1 目的基因引物序列

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、大鼠一般情況

模型組大鼠3 d內(nèi)出現(xiàn)排便次數(shù)增多、稀便、便上有黏液或膿點、肛周有糞便等表現(xiàn)，少數(shù)出現(xiàn)黏液血便，其中4只大鼠因癥狀嚴重而于造模3 d左右死亡。死亡大鼠腹腔內(nèi)可見大量腹水，胃腔高度擴張，空回腸亦明顯擴張，結(jié)直腸水腫、腸壁顏色灰暗，腸壁變薄，部分呈壞疽狀，其中1只可見穿孔灶(圖1)。正常對照組大鼠飲食正常、反應靈活、體質(zhì)量增加，毛發(fā)無光澤，大小便正常均無腹瀉和血便。

二、組織病理學改變

模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮糜爛、潰瘍形成，黏膜下水腫、杯狀細胞和腺體減少，固有層有彌漫性中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，黏膜下淋巴細胞增生；正常對照組結(jié)腸黏膜上皮完整，黏膜下亦無腺體和杯狀細胞消失，僅見少量炎癥細胞浸潤(圖2)。模型組大體評分和結(jié)腸組織學評分明顯高于對照組(P<0.05)(表2)。

三、血清和結(jié)腸組織細胞因子含量

與正常對照組大鼠相比，模型組血清和結(jié)腸組織IL-4和IL-5含量均顯著增高(P<0.05)，而兩組TNF-α和IL-10含量無明顯差異(P>0.05)(表3、表4)。

圖1 模型組死亡大鼠大體表現(xiàn)圖

表2 大鼠結(jié)腸組織學評分比較

*與正常對照組比較，P<0.05

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色圖

四、緊密連接蛋白claudin分布和表達

免疫組化結(jié)果顯示，claudin-1、-2、-4在正常對照組以及模型組大鼠結(jié)腸上皮中均有不同程度的表達，主要位于細胞質(zhì)。與正常對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、-4表達明顯下降，而claudin-2表達明顯增加(圖3)。

表3 各組大鼠血清細胞因子含量比較

表4 各組大鼠結(jié)腸組織細胞因子表達比較

圖3各組大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、-2、-4表達(免疫組化染色，×200)

五、實時定量PCR檢測claudin-1、-2、-4 mRNA表達

與正常對照組相比，模型組claudin-1、-4 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而claudin-2 mRNA表達顯著增高(P<0.05)(圖4)。

六、蛋白質(zhì)印跡法檢測claudin-1、-2、-4蛋白表達

與正常對照組相比，模型組claudin-1、-4蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而claudin-2蛋白表達顯著增高(P<0.05)(圖5)。

*與正常對照組比較，P<0.05

圖4各組大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、-2、-4 mRNA表達(實時PCR法)

1 Da=0.992 1 u

圖5各組大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、-2、-4蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

近年腸黏膜屏障功能在IBD病理生理過程中的作用逐漸引起重視。機械屏障是腸黏膜屏障的重要組成部分，由單層腸上皮細胞和細胞間連接(包括緊密連接、黏附連接和縫隙連接)組成，緊密連接通透性是決定腸道通透性的關(guān)鍵因素，維持完整的緊密連接形態(tài)和功能對保護腸黏膜屏障、防止細菌易位具有重要意義。急性期IBD患者腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加，腸上皮完整性受損，如潰瘍、糜爛等肉眼可見病變是引起屏障功能受損的主要原因，但在上皮組織完整的腸黏膜區(qū)同樣可見緊密連接結(jié)構(gòu)受損、通透性增加[8]。

細胞因子通過兩種方式影響緊密連接，一是調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達，二是影響緊密連接蛋白重新分布的過程[9]。惡唑酮為一種半抗原，可誘發(fā)大鼠結(jié)腸發(fā)生接觸性過敏反應。惡唑酮誘導的實驗性結(jié)腸炎為IL-4介導的以IL-4/IL-5含量增高為主、TNF-α和INF-γ含量正常的典型Th2型炎癥。本研究中，與正常對照組相比，模型組大鼠血清以及結(jié)腸組織促炎細胞因子IL-4和IL-5表達顯著增高，而TNF-ɑ和IL-10表達無明顯差異。但UC發(fā)病過程中涉及多種細胞因子，如促炎細胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23、IFN均與UC的發(fā)病和進展密切相關(guān)，而抗炎細胞因子如IL-4、IL-10和IL-13與UC的發(fā)病以及病理特征密切相關(guān)，促炎因子和抗炎因子共同影響結(jié)腸黏膜炎癥的發(fā)生、發(fā)展，因此各細胞因子在惡唑酮誘導UC中的作用仍需進一步研究。

緊密連接復合體由occludin、claudin以及膜周蛋白JAM和ZO蛋白以及相關(guān)激酶組成。Claudin蛋白是組成緊密連接復合體的功能和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可直接影響上皮/內(nèi)皮組織跨上皮細胞電阻，決定緊密連接復合體的離子選擇性，并調(diào)節(jié)緊密連接復合體的通透性。一部分claudin可加固細胞間的連接，其表達上調(diào)可降低緊密連接復合體的通透性，稱之為“封閉性”claudin蛋白，包括claudin-1、-3、-4、-5、-8等；另一部分claudin分子可通過形成特異性離子通道而增加緊密連接復合體的通透性，稱之為“滲漏性”claudin蛋白，如claudin-2可增加緊密連接結(jié)構(gòu)孔數(shù)量，增加經(jīng)細胞旁物質(zhì)運輸，尤其是Na+離子的吸收。claudin蛋白與occludin、ZO蛋白相連，在組裝成熟的緊密連接結(jié)構(gòu)和維持緊密連接復合體的完整性方面發(fā)揮重要作用[9]。

本研究免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法和實時PCR結(jié)果均顯示，與正常對照組相比，惡唑酮誘導的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮滲漏性緊密連接蛋白claudin-2表達增加，封閉性緊密連接蛋白claudin-1、-4表達顯著下降。推測這些緊密連接蛋白表達變化是引起惡唑酮大鼠結(jié)腸緊密連接復合體受損、腸黏膜屏障功能下降的主要機制。Fischer等[10]的研究表明TNF-α單克隆抗體阿達木單抗可緩解TNF-α引起的結(jié)腸癌細胞株T-84細胞緊密連接蛋白claudin-1、-2、-4以及occludin表達減少導致的細胞屏障功能紊亂以及滲透性增加。因此細胞屏障的保護作用將成為抗TNF-α治療機制的研究新方向，這一作用可對炎癥性腸病造成的結(jié)腸上皮重塑以及組織損傷均具有重要意義[11]。

總之，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中claudin-1、-2、-4表達改變與黏膜屏障損傷、功能紊亂以及滲透性改變可能具有重要聯(lián)系，可作為UC的治療研究靶點，是UC藥物治療療效的重要評價指標以及藥物機制研究的重要方向，未來需行進一步研究探討。

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(2017-05-17收稿；2017-07-01修回)

ChangesofExpressionsofClaudin-1,-2,-4inExperimentalColitisRats

WUXiaolin1,ZHAOChunyan1,JIANGHaiyang1,FANCongcong1,WANGLibo2.

1DepartmentofPathogenBiology,CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun(130021);2DepartmentofGastroenterology,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun

WANG Libo,Email:wanglibo75@163.com

Claudins; Oxazolone; Colitis,Ulcerative; Cytokines

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.005

吉林省科技發(fā)展項目計劃(20130413011GH)

#本文通信作者，Email:wanglibo75@163.com

背景：潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥病變，大量研究表明，UC腸黏膜損傷與緊密連接蛋白改變有關(guān)。目的探討實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸中claudin-1、-2、-4的表達。方法將40只雌性Wistar大鼠隨機分為正常對照組和模型組，給予大鼠7.5 mg/mL惡唑酮灌腸制備實驗性結(jié)腸炎模型，以等量0.9% NaCl溶液灌腸作為正常對照。造模7 d后，行大體評分和結(jié)腸組織學評分，以ELISA法檢測血清和結(jié)腸中細胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10含量，免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法檢測緊密連接蛋白claudin-1、-2、-4蛋白表達，實時PCR法檢測claudin-1、-2、-4 mRNA表達。結(jié)果與正常對照組相比，模型組結(jié)腸大體評分和組織學評分均顯著升高(P<0.05)；血清和結(jié)腸組織IL-4和IL-5含量均顯著增高(P<0.05)，而兩組TNF-α和IL-10含量無明顯差異(P>0.05)；claudin-1、-4 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05)，claudin-2 mRNA和蛋白表達顯著增高(P<0.05)。結(jié)論實驗性結(jié)腸炎大鼠中緊密連接蛋白claudin-1、-2、-4的分布和表達發(fā)生改變，導致腸黏膜屏障功能受損，有望作為UC治療的潛在靶點。

Background:Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory disorder.Studies have shown that intestinal injury of UC is related to changes of tight junction proteins.AimsTo investigate the expressions and localizations of tight junction protein claudin-1,-2,-4.MethodsForty female Wistar rats were randomly divided into normal control group and model group.Rats in model group

7.5 mg/mL oxazolone enema to induce experimental colitis.Rats received 0.9% NaCl solution enema were served as normal controls.Macroscopic score and histological score were assessed.ELISA was used to determine serum and colon tissue inflammatory factor TNF-α,IL-4,IL-5,IL-10 levels.Protein expressions of tight junction protein claudin-1,-2,-4 were measured by immunohistochemistry and Western blotting.mRNA expressions of claudin-1,-2,-4 were determined by real-time PCR.ResultsCompared with normal control group,macroscopic score and histological score were significantly increased (P<0.05),serum and colon tissue IL-4 and IL-5 levels were significantly increased (P<0.05) in model group,however,no significant differences in TNF-α and IL-10 levels were found between the two groups (P>0.05).mRNA and protein expressions of claudin-1,-4 were significantly decreased in model group than in normal control group (P<0.05),while mRNA and protein expressions of claudin-2 were significantly increased (P<0.05).ConclusionsChanges of distributions and expressions of tight junction protein claudin-1,-2,-4 are found in experimental colitis rats,which may lead to impaired epithelial barrier,and might be served as potential target for treatment of UC.