申 彤 司君利 崔京遠 亓玉琴 呂 梅

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)一科1(266011) 急診科2 普外科3

長鏈非編碼RNA TUG1在胃癌患者中的表達及其對預(yù)后的影響

申 彤1*司君利2崔京遠3亓玉琴1#呂 梅1

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)一科1(266011)急診科2普外科3

胃腫瘤； 長鏈非編碼RNA； TUG1； p27； 細胞周期蛋白D1

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見的消化道腫瘤之一[1]，死亡率居所有癌癥的第二位[2]，大多數(shù)中晚期胃癌患者術(shù)后死于腫瘤復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找一種較為有效的基因靶點從而早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷胃癌已成為目前臨床研究的重點。近年研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA可起癌基因或抑癌基因的作用，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與不同類型腫瘤如乳腺癌的發(fā)生[4]。新近研究顯示，?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在膀胱腫瘤、非小細胞肺癌[5-6]等的發(fā)展中起重要調(diào)控作用，但其在胃癌中的臨床意義和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過檢測胃癌組織及其相應(yīng)正常組織中TUG1、p27和cyclin D1的表達，旨在探討TUG1在胃癌中的作用并分析其對胃癌預(yù)后的影響，從而探討TUG1是否可作為胃癌較為敏感的分子學(xué)標(biāo)記物和治療靶點，以期為判斷胃癌患者預(yù)后提供依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

收集2013年6月—2013年12月青島市市立醫(yī)院普外科行胃部手術(shù)的胃癌患者共48例，診斷均經(jīng)病理檢查確診，其中男28例，女20例，平均年齡(60.0±9.2)歲。所有患者術(shù)前均未接受過全身化療、局部放療或其他抗腫瘤治療。取患者腫瘤組織及其相應(yīng)遠端正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm處)，-80 ℃冰箱保存。參照2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的分化分級標(biāo)準(zhǔn)和2002年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期，對胃癌的分化程度和分期進行評估。本研究方案由青島市市立醫(yī)院倫理委員會審批通過，入選者或其家屬均取得知情同意。對48例胃癌患者進行電話隨訪，隨訪時間從術(shù)后開始截至2016年12月31日。

二、主要試劑

cDNA合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑盒、2×SYBR Green Mix(With ROX)試劑盒均購于美國Biomiga公司。GAPDH抗體、p27抗體、cyclin D1抗體均購于美國AbSci公司。羊抗兔IgG購于北京康為世紀生物科技有限公司。

三、研究方法

1.qRT-PCR法：取100 mg凍存組織，Trizol抽提試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。TUG1引物上游：5’-TAG CAG TTC CCC AAT CCT TG-3’，下游：5’-CAC AAA TTC CCA TCA TTC CC-3’；以GAPDH作為內(nèi)參，引物上游：5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG ATT-3’，下游：5’-CGC TCC TGG AAG ATG GTG AT-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置2個復(fù)孔，并檢測其熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算樣品中目的基因的相對表達量。

2.蛋白質(zhì)印跡法：RIPA裂解液裂解組織，勻漿，保留上清液，獲得組織蛋白提取物，BCA法定量蛋白濃度。取70 μg蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4 ℃過夜。加入p27兔多克隆抗體(工作濃度1∶200)、cyclin D1兔多克隆抗體(工作濃度1∶200)和GAPDH兔多克隆抗體(工作濃度1∶1 000)孵育3 h；TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(工作濃度1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。化學(xué)發(fā)光顯影并觀察結(jié)果。使用Quantity One圖像分析軟件，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、TUG1表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中TUG1 mRNA表達顯著高于相應(yīng)正常組織(6.18±0.19對5.09±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

根據(jù)TUG1 mRNA表達的中位數(shù)，將48例胃癌患者分為TUG1高表達組(n=35)和TUG1低表達組(n=13)，發(fā)現(xiàn)TUG1表達與性別、年齡和腫瘤大小無明顯相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(表1)。

表1 胃癌組織中TUG1表達與臨床病理特征的關(guān)系(n)

二、p27、cyclin D1蛋白表達及其相關(guān)性

蛋白質(zhì)印跡法顯示，胃癌組織中p27蛋白表達明顯低于正常組織，cyclin D1蛋白表達明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

Pearson相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中p27蛋白表達與cyclin D1蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.897，P<0.01)。

三、TUG1表達與p27、cyclin D1表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中TUG1表達與p27表達呈負相關(guān)(r=-0.730，P<0.01)，而與cyclin D1表達呈正相關(guān)(r= 0.809，P<0.01)。

組別例數(shù)p27cyclinD1胃癌組織480．1709±0．02120．3417±0．0271正常組織480．3087±0．02520．2417±0．0173

四、TUG1表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier分析顯示，TUG1低表達組和高表達組的中位生存時間分別為34個月和23個月，TUG1高表達的胃癌患者生存時間明顯低于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 TUG1表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier法)

討 論

在人類基因組中，超過98%的基因不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[7]，但可被轉(zhuǎn)錄，生成非編碼RNA。長鏈非編碼RNA是一類轉(zhuǎn)錄長度超過200個核苷酸的RNA分子的總稱，因其無法編碼蛋白質(zhì)[8]，長期被認為是基因組學(xué)的“噪音”[9]。近年發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA因在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多層面調(diào)控基因表達[10]而獲得了越來越多的關(guān)注，其不但與個體生長發(fā)育有關(guān)，還對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起至關(guān)重要的作用。

長鏈非編碼RNA TUG1位于人染色體 22q12.2，長約7.1 kb，廣泛存在于人體各種器官和細胞中，是視網(wǎng)膜和神經(jīng)組織增殖必需的調(diào)控基因[11]。大量文獻[5-6]顯示，TUG1對膀胱腫瘤、非小細胞肺癌的發(fā)生起關(guān)鍵作用，但其在胃癌中的相關(guān)研究甚少。抑癌基因p27位于人染色體12p13，其表達產(chǎn)物p27蛋白是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI)，通過抑制cyclin-CDKs的活性，阻止細胞從G1期進入S期，從而阻礙腫瘤的發(fā)生[12]。cyclin D1為一種重要的細胞周期正調(diào)控因子，其表達上調(diào)會導(dǎo)致細胞周期失衡從而發(fā)生惡性增殖[13]。有研究[14]表明，多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)中EZH2可催化H3K27甲基化，進而抑制抑癌基因的表達。而Huang等[15]的研究表明在肝細胞癌中，TUG1能與PRC2復(fù)合物的EZH2、SUZ12結(jié)合并集中至抑癌因子KLF2啟動子區(qū)，從而促進肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移。關(guān)于在胃癌組織中，TUG1是否通過PRC2途徑抑制p27蛋白表達，進而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生目前尚未見報道。

本研究結(jié)果顯示在胃癌組織中TUG1表達明顯高于相應(yīng)正常組織，表明TUG1可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步分析TUG1表達與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其表達與胃癌患者的性別、年齡和腫瘤大小無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)，表明TUG1可能與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，胃癌組織TUG1表達與p27表達呈負相關(guān)，而與cyclin D1表達呈正相關(guān)，提示TUG1可能通過抑制p27表達、促進cyclin D1表達而促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，TUG1高表達的胃癌患者生存時間明顯低于低表達者，表明檢測TUG1表達可作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過檢測胃癌組織中TUG1、p27、cyclin D1的表達并分析其與胃癌臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，表明TUG1可能通過p27/cyclin D1途徑誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生，且高表達TUG1可能促進胃癌轉(zhuǎn)移，進而影響患者預(yù)后。因此，TUG1有望作為一個潛在的胃癌分子標(biāo)記物，為判斷胃癌患者預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。

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(2017-05-30收稿；2017-07-25修回)

ExpressionofLongNon-codingRNATUG1anditsEffectonPrognosisofPatientsWithGastricCancer

SHENTong1,SIJunli2,CUIJingyuan3,QIYuqin1,LüMei1.

1DepartmentofGastroenterologyⅠ,2DepartmentofEmergency,3DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedQingdaoMunicipalHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

QI Yuqin,Email:17863939736@163.com

Stomach Neoplasms; Long Non-Coding RNA; TUG1; p27; Cyclin D1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.003

*Email:448037357@qq.com

#本文通信作者，Email:17863939736@163.com

背景：近年胃癌的發(fā)生率呈逐步上升的趨勢，長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)對胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能起有一定的作用。目的研究TUG1在胃癌組織中的表達及其對預(yù)后的影響，并進一步探討TUG1與p27蛋白、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)的相關(guān)性。方法收集2013年6月—2013年12月青島市市立醫(yī)院48例手術(shù)切除的胃癌組織及其相應(yīng)遠端正常組織，采用qRT-PCR法檢測TUG1 mRNA表達，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測p27、cyclin D1蛋白表達，并分析其與TUG1表達的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法分析TUG1表達與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中TUG1 mRNA表達顯著高于相應(yīng)正常組織(6.18±0.19對5.09±0.16，P<0.05)，且其表達與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(P<0.01)。胃癌組織中p27蛋白表達顯著低于正常組織(0.170 9±0.021 2對0.308 7±0.025 2，P<0.01)，cyclin D1蛋白表達顯著升高(0.341 7±0.027 1對0.241 7±0.017 3，P<0.01)，且p27蛋白表達與cyclin D1蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.897，P<0.01)。胃癌組織中TUG1表達與p27表達呈負相關(guān)(r=-0.730，P<0.01)，與cyclin D1表達呈正相關(guān)(r=0.809，P<0.01)。TUG1高表達的胃癌患者生存時間明顯低于TUG1低表達者(P<0.05)。結(jié)論長鏈非編碼RNA TUG1可能通過p27/cyclin D1途徑在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因的作用，通過檢測TUG1表達對判斷胃癌患者預(yù)后具有潛在的價值。

Background:The incidence of gastric cancer is gradually rising in recent years,long non-coding RNA taurine up-regulated gene 1 (TUG1) may have certain effects on the occurrence and progression of gastric cancer.AimsTo study the expression TUG1 in gastric cancer tissue and its effect on prognosis of patients with gastric cancer,and study the correlation between TUG1 and p27,cyclin D1.MethodsSurgically resected gastric cancer tissues and corresponding distal normal tissues of 48 gastric cancer patients from June 2013 to December 2013 at Qingdao Municipal Hospital were collected.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of TUG1,and its relationship with clinicopathological features was analyzed.Protein expressions of p27 and cyclin D1 were determined by Western blotting,and correlation with expression of TUG1 was analyzed.Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between expression of TUG1 and prognosis.ResultsThe mRNA expression of TUG1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in corresponding normal tissues (6.18±0.19vs.5.09±0.16,P<0.05),and was not correlated with gender,age,tumor size,but correlated with lymph node metastasis,tumor differentiation and TNM staging (P<0.01).The protein expression of p27 was significantly decreased in gastric cancer tissues than in normal tissues (0.170 9±0.021 2vs.0.308 7±0.025 2,P<0.01),while protein expression of cyclin D1 was significantly increased (0.341 7±0.027 1vs.0.241 7±0.017 3,P<0.01),and the expression of p27 was negatively correlated with expression of cyclin D1 in gastric cancer tissues (r=-0.897,P<0.01).The expression of TUG1 was negatively correlated with expression of p27 (r=-0.730,P<0.01),and was positively correlated with expression of cyclin D1 (r=0.809,P<0.01) in gastric cancer tissues.The median survival time was shorter in gastric cancer patients with high-expressed TUG1 than in patients with low-expressed TUG1 (P<0.05).ConclusionsLong non-coding RNA TUG1 plays a role of cancer gene in the development of gastric cancer through p27/cyclin D1 pathway.Detection of expression of TUG1 has important significance on the prediction of prognosis of gastric cancer patients.