冷 霞 陳衛(wèi)昌

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(215006)

·綜 述·

外周血SEPT9基因甲基化檢測在結直腸癌篩查中的應用進展

冷 霞1*陳衛(wèi)昌#

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內科(215006)

結直腸癌(CRC)的早期診斷具有重要臨床意義。外周血SEPT9基因甲基化在大量研究中被證實是CRC的特異性生物學標記物，敏感性和特異性均較高，較之目前常用的糞便隱血試驗、血清腫瘤標記物和結腸鏡篩查具有一定優(yōu)勢，但在篩查腺瘤、息肉等癌前病變中的應用價值有限，用于評估CRC術后復發(fā)和放化療效果的潛力則尚需進一步臨床驗證。本文就外周血SEPT9基因甲基化檢測在CRC篩查中的應用進展作一綜述。

結直腸腫瘤； 篩查； 早期診斷； DNA甲基化； SEPT9基因

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，我國每年CRC新發(fā)病例數(shù)超過25萬，死亡病例數(shù)約14萬，新發(fā)和死亡病例均占全世界同期CRC病例的20%[1]，給社會和個人造成沉重的醫(yī)療負擔。CRC的轉歸和預后與疾病分期密切相關，但60%～70%的患者在確診時已進展至中晚期[2]。因此，CRC的早期診斷具有重要臨床意義，而普及CRC篩查和推廣內鏡下早診、早治是提高CRC早期診斷率、降低CRC相關死亡率的有效途徑。

結腸鏡檢查是診斷CRC的金標準，但腸道準備、侵入性操作、隱私暴露以及患者的恐懼心理等因素，限制了其在結直腸腫瘤篩查中的應用。我國人口眾多，醫(yī)療資源分布極不均衡，直接采用結腸鏡檢查進行人群篩查亦不符合國情。采用無創(chuàng)技術進行初篩，再針對高危人群進行結腸鏡精查則是行之有效的方法。目前常用的無創(chuàng)篩查方法主要有糞便檢測和血清腫瘤標記物檢測，前者包括糞便隱血試驗(fecal occult blood test,FOBT)、糞便microRNAs(miRNAs)、糞便DNA檢測等，但篩查普及率仍偏低。FOBT簡便易行，是最常用的CRC糞便篩查方法，目前免疫化學法(fecal immuno-chemical test,FIT)已逐漸取代傳統(tǒng)愈創(chuàng)木脂法(guaiac-based FOBT,gFOBT)，在CRC篩查中表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性[3]。但糞便檢測取樣困難，可能需多次檢測，且結果易受多種因素影響。臨床常用的血清消化道腫瘤標記物包括CEA、CA19-9、CA125、CA724等，但敏感性和特異性均不高，單一指標對CRC的診斷價值有限。

近年來，國內外多項臨床試驗證實，甲基化SEPT9基因是CRC的特異性生物學標記物，應用熒光探針PCR技術檢測外周血SEPT9基因甲基化水平，可評估CRC患病風險。該項檢查無需禁食，血液標本易采集，受檢者依從性好，對于CRC的診斷有較高的敏感性和特異性，且檢出率與患者性別、腫瘤部位無關[4-5]。本文就外周血SEPT9基因甲基化檢測在CRC篩查中的應用進展作一綜述。

一、SEPT9基因結構及其轉錄產(chǎn)物的生理作用

迄今為止，在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)13個septin基因，分別命名為SEPT1至SEPT12和SEPT14，其蛋白產(chǎn)物隔膜蛋白(septins)是一組具有GTP結合蛋白活性的保守骨架蛋白家族，參與細胞骨架形成、細胞極化、胞質分裂、細胞膜重構等多個細胞生物學過程，特別是與細胞分裂密切相關[6-7]。SEPT9基因位于染色體17q25.3，普遍存在于人類細胞中，共有18種轉錄產(chǎn)物。Septins家族成員相互之間具有高親和力，可形成含有多個septin多肽的三、六、八聚體復合物。SEPT9編碼蛋白在septins八聚體復合物中位于末端位置，具有穩(wěn)定多聚體結構以及促進各亞基聚合的作用，并在細胞分裂時子細胞的最終分離中起關鍵作用[8-9]。因此，SEPT9基因表達異?；蛉笔r，細胞分裂可能受到嚴重影響。

二、SEPT9基因與腫瘤的關系

SEPT9基因在多種惡性腫瘤中存在異常表達。Tóth等[10]的研究表明，從結直腸腺瘤、異型增生至CRC，SEPT9 mRNA表達呈下降趨勢，CRC組織和細胞中的SEPT9蛋白表達較正常組織和細胞顯著降低。SEPT9不同轉錄本在不同組織來源腫瘤中的表達亦存在差異，如在乳腺癌形成過程中可觀察到SEPT9_v1、v2、v3轉錄本高表達[11]；卵巢腫瘤上皮中為v1、v4*轉錄本高表達[12]；CRC上皮中v1轉錄本則呈低表達，v2、v4、v4*、v5轉錄本呈高表達[10]。上述發(fā)現(xiàn)提示在不同組織來源腫瘤的形成過程中，SEPT9基因可能發(fā)揮不同作用，而DNA甲基化可能是調節(jié)SEPT9不同轉錄本差異表達的機制之一。

DNA甲基化包括高甲基化和低甲基化，通常認為高甲基化導致基因沉默、蛋白表達減少，低甲基化則引起基因激活、蛋白表達增多。Wasserkort等[13]對不同性質結腸病變的SEPT9基因及其臨近部位共8個區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行檢測，發(fā)現(xiàn)在CRC和腺瘤組織上皮細胞中，SEPT9基因高甲基化集中發(fā)生于v2轉錄本的CpG島3(CGI3)，這也是Epi proColon試劑盒(德國Epigenomics AG)SEPT9基因甲基化檢測的靶片段。在CRC組織中，高甲基化從CGI3的核心區(qū)域擴展至5’末端，而在腺瘤組織中，5’末端無高甲基化表現(xiàn)，表明高甲基化區(qū)域的擴展可能是腺瘤進展至CRC過程中的晚期事件，這可能是SEPT9基因甲基化檢測在腺瘤中的敏感性明顯低于CRC的原因。

鑒于SEPT9基因異常甲基化不僅發(fā)生在CRC中，Grützmann等[14]對多種惡性腫瘤患者的血漿SEPT9基因甲基化情況進行了比較，發(fā)現(xiàn)CRC患者甲基化陽性率為72%(90/125)，而非CRC惡性腫瘤患者陽性率僅為11.5%(11/96)，為SEPT9基因甲基化作為CRC的特異性診斷指標提供了依據(jù)。

三、SEPT9基因甲基化檢測篩查結直腸腫瘤的臨床研究

2008年至今，國內外不同研究小組發(fā)表了一系列通過檢測SEPT9基因甲基化篩查早期CRC的臨床研究，尤其是第二代檢測試劑盒Epi proColon 2.0應用以來，其敏感性進一步提高至79.3%(2/3算法)～95.6%(1/3算法)，特異性達到84.8%(1/3算法)～98.9%(2/3算法)[4]。1/3算法即3次PCR反應中有1次陽性即判定為SEPT9基因甲基化陽性，2/3算法則為3次反應中有2次或以上陽性判定為陽性。1/3算法雖能保證高敏感性，但導致特異性降低[4-5]。在CRC篩查過程中，篩查手段的高特異性有利于排除非癌樣本以避免不必要的結腸鏡檢查，可能漏診的高危人群則可通過定期復查FOBT得到補償[1]。因此，Epi proColon 2.0試劑盒使用手冊推薦使用2/3算法，一系列采用該算法的國內外研究[4,15-18]顯示其敏感性為 71.1%～79.3%，特異性為 87.4%～98.9%(表1)。目前該試劑盒已完成國產(chǎn)化，降低了檢測成本，并對檢測過程作了簡化，將原有的2～3次PCR反應簡化至1次，避免了算法對檢測結果的影響。北京協(xié)和醫(yī)院吳東等[19]的研究顯示，采用簡化算法的國產(chǎn)化試劑盒在中國人群中的診斷敏感性和特異性分別達到80.0%和95.3%。最新關于外周血SEPT9基因甲基化檢測診斷CRC準確性的系統(tǒng)綜述顯示，其總體敏感性為71%(95% CI:67%～75%)，特異性為92%(95% CI:89%～94%)，在不同檢測方法和技術中，Epi proColon 2.0和2/3算法檢出CRC最為有效；對于癌前病變的篩查，腺瘤敏感性為11%～19%，特異性為85%～94%，息肉敏感性為3%～8%，特異性為90%～97%，敏感性均較低，提示SEPT9基因甲基化檢測對CRC癌前病變的診斷價值有限[20]。

外周血SEPT9基因甲基化在不同臨床分期CRC中的陽性率見表2。相關meta分析表明，該項檢測在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC中的陽性率分別為45%、70%、76%和79%[20]，表明對于早期CRC，SEPT9基因甲基化檢測仍有一定的檢出率，可為診斷提供依據(jù)。甲基化陽性率總體上隨CRC臨床分期的進展而升高，可能與原發(fā)病灶腫瘤細胞壞死和凋亡隨疾病進展而增多，釋放至外周血中的甲基化SEPT9基因DNA量增加有關。

表1外周血SEPT9基因甲基化檢測篩查CRC的臨床研究(Epi proColon 2.0試劑盒，2/3算法)

研究發(fā)表年份樣本量敏感性(%，95%CI)特異性(%，95%CI)Tóth等[4]201218479．3(69．6～87．1)98．9(94．1～100)康倩等[15]201413275．0(64．7～83．6)98．1(90．9～99．9)賀娜等[16]201428171．1(59．4～80．6)95．6(91．2～98．6)丁清清等[17]201526273．2(62．1～82．1)95．6(89．5～98．7)Jin等[18]201547674．8(67．0～81．6)87．4(83．5～90．6)

表2不同臨床分期CRC外周血SEPT9基因甲基化檢測陽性率(%)

研究發(fā)表年份Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期Tóth等[4]201260．092．888．677．8Song等[5]201753．880．077．484．2康倩等[15]201448．082．693．166．7賀娜等[16]201435．781．079．380．0丁清清等[17]201550．053．387．580．0Jin等[18]201566．782．684．1100吳東等[19]201657．180．081．2100李士杰等[21]201540．065．588．288．9郁迪等[22]201542．988．982．4100Lee等[23]201330．836．725．064．7Church等[24]201435．063．046．077．4Johnson等[25]201461．580．065．292．3

2013年結束的一項納入來自美國和德國32個醫(yī)療機構的7 941例50歲及以上無癥狀人群的大樣本CRC篩查研究[24]結果顯示，血漿SEPT9基因甲基化篩查CRC的敏感性為48.2%(95% CI:32.4%～63.6%)，明顯低于上文中多項回顧性驗證研究得出的敏感性。該研究的篩查對象為無癥狀人群，代表了外周血SEPT9基因甲基化檢測應用于一般風險人群CRC篩查的實際操作情況，其結果有更好的指導意義。

Lee等[23]的研究觀察了CRC患者根治性手術前后血漿SEPT9基因甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)在近4個月的隨訪期內，9例術前甲基化陽性者中有8例轉陰(88.9%)，且生存分析顯示SEPT9甲基化水平與CRC術后無病生存期呈顯著負相關。盡管該研究樣本量較小，但提供了外周血SEPT9基因甲基化作為CRC術后復發(fā)監(jiān)測指標的研究思路，該指標能否作為CRC放化療效果的評估指標有待進一步研究。

四、SEPT9基因甲基化檢測與目前常用CRC篩查方法的比較

目前CRC篩查方法主要有糞便檢測(FOBT、糞便miRNAs、糞便DNA等)、血清糖蛋白類腫瘤標記物和結腸鏡檢查。FOBT包括FIT和gFOBT兩種檢測方式，前者敏感性和特異性更高，分別達到79%～89%和92%～94%[3]。意大利一項研究[26]顯示，以FIT為基礎的篩查方案能顯著降低CRC死亡率并提高早期手術治療率。但FIT的應用存在一定局限性，如易受其他出血性疾病影響，且有證據(jù)顯示，由于血紅蛋白的降解，糞便在腸道內積存時間過長或檢測與取樣時間間隔過久可致假陰性率明顯升高[27]。多項研究比較了外周血SEPT9基因甲基化檢測和FIT單獨或聯(lián)合應用于CRC篩查的診斷效能，結果顯示單獨應用SEPT9、FIT的敏感性分別為73.3%～81.5%和53.8%～88.9%，特異性分別為81.5%～95.3%和54.1%～97.4%[15,18-19,22,25]，兩者聯(lián)合 診斷的敏感性和特異性則分別為88.7%～97.8%和 52.9%～78.8%[19,25]，SEPT9甲基化在特異性方面優(yōu)于FIT，而聯(lián)合檢測有助于進一步提高敏感性。近年來糞便miRNAs和DNA檢測成為研究熱點。在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中，患者糞便中可觀察到miRNAs和DNA的持續(xù)改變。相關meta分析顯示糞便miRNAs在亞洲人群CRC篩查中的敏感性和特異性分別為79.5%(95% CI:76.8%～84.4%)和81.9%(95% CI:79.1%～84.4%)[28]，而糞便DNA的敏感性和特異性分別為85%～92%和90%～95%[29]。但糞便miRNAs和DNA檢測方法復雜，價格較高，結果受糞便樣本質量影響較大，可能需多次檢測，難以在人群篩查中推廣應用。

臨床上用于CRC篩查的糖蛋白類腫瘤標記物主要包括CEA、CA19-9、CA125、CA724和CA242。余捷凱等[30]篩選出的由CEA、CA19-9、CA242、CA211和CA724五個腫瘤標記物組成的診斷模型篩查CRC的敏感性和特異性分別為83%和95%，與外周血SEPT9基因甲基化檢測相近，而最常用的單項血清腫瘤標記物CEA的敏感性和特異性均低于SEPT9基因甲基化檢測[4，16,21-22]。

結腸鏡聯(lián)合活檢病理檢查是診斷CRC的金標準。近年來，結直腸腫瘤的內鏡下治療技術日漸成熟，內鏡黏膜切除術(EMR)、內鏡黏膜下剝離術(ESD)等內鏡手術治療在結直腸癌前病變中的應用逐漸增多。但采用結腸鏡進行大規(guī)模人群篩查需消耗大量醫(yī)療資源，加之結腸鏡檢查要求徹底的腸道準備以保證觀察視野清晰，并存在禁忌證和并發(fā)癥風險，患者依從性差。因此，目前我國共識推薦的早期CRC篩查流程是先對篩查人群進行危險分層，低危人群先選擇FIT和(或)SEPT9基因甲基化檢測，高危人群直接進行結腸鏡精查[1]。

五、結語

大量臨床數(shù)據(jù)證實外周血SEPT9基因甲基化檢測對于診斷CRC有較高的敏感性和特異性，可用于早期CRC篩查，其結果不受性別和腫瘤部位影響，并能指導后續(xù)篩查方法的選擇，提高人群對結腸鏡檢查的依從性。但對于結直腸腺瘤、息肉等癌前病變的篩查，其應用價值有限。SEPT9基因甲基化檢測在CRC術后復發(fā)和放化療效果評估中的應用潛力，尚需大量臨床數(shù)據(jù)加以驗證。

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(2017-05-05收稿；2017-05-19修回)

ProgressinApplicationofPeripheralBloodMethylatedSEPT9GeneAssayforColorectalCancerScreening

LENGXia,CHENWeichang.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

CHEN Weichang,Email:weichangchen@126.com

The early detection and diagnosis of colorectal cancer (CRC) is of great clinical importance.Peripheral blood methylated SEPT9 gene was found to be a sensitive and specific biomarker for CRC and was superior to other commonly used screening methods such as fecal occult blood test,serum tumor markers and colonoscopy in a variety of studies.But it is of limited value in screening of adenomas,polyps and other precursors of CRC,and its capacities for assessment of cancer recurrence and therapeutic effects of radiotherapy and chemotherapy need further clinical validation.This article reviewed the progress in application of peripheral blood methylated SEPT9 gene assay for CRC screening.

Colorectal Neoplasms; Screening; Early Diagnosis; DNA Methylation; SEPT9 Gene

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.009

*Email:20155232024@stu.suda.edu.cn

#本文通信作者，Email:weichangchen@126.com