宋 躍 李淑娟 白曉明 張含國

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

響應面優(yōu)化長白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)條件的研究

宋 躍 李淑娟*白曉明 張含國

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

以長白落葉松胚性愈傷組織為材料，通過Box-Behnken Design設計試驗，建立以體胚發(fā)生量為響應值的響應面模型，優(yōu)化長白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件。結果表明：相對離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)、培養(yǎng)周期(P=0.000)、肌醇濃度與培養(yǎng)周期的交互作用(P=0.007)對長白落葉松體細胞胚胎發(fā)生量的影響極為顯著。長白落葉松體胚形成早期的最適培養(yǎng)條件為：相對離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，預測體細胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個·g-1。為便于實際操作，驗證試驗將培養(yǎng)條件調整為：離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，體胚平均發(fā)生量為336.46 個·g-1，與預測值336.29 個·g-1基本一致，體胚萌發(fā)率與生根率分別達100%和83.33±5.78%，與前期試驗相比，長白落葉松體胚發(fā)生的數(shù)量和質量均有顯著提高。

落葉松屬；長白落葉松；響應面優(yōu)化；體胚發(fā)生；胚胎形成早期

落葉松(LarixMill.)具早期速生、抗逆性強、輪伐期短等特點[1]，是我國東北地區(qū)三大針葉用材樹種之一。長白落葉松(Larixolgensis)作為東北地區(qū)的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種，其種源試驗開展較早，自上世紀70年代末以來已有一批速生豐產、抗逆性強的優(yōu)良長白落葉松家系被陸續(xù)選育出來，其栽培區(qū)不斷向北延伸，推廣面積超過60余萬hm2[2]。但長白落葉松的種子產量不穩(wěn)定[3]，有性生殖的子代變異大，許多優(yōu)良性狀難以維持，而扦插等無性繁殖也存在生根率較低等問題[2～4]，限制了落葉松良種的大規(guī)模繁育利用，難以滿足林業(yè)生產的實際需求。

植物的體細胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、繁殖快、結構完整、植株再生率高以及不受季節(jié)影響等特點，被認為是一種可實現(xiàn)針葉樹大規(guī)模繁殖的重要技術手段[4]。通過幾十年來的不斷努力，落葉松的體細胞胚胎發(fā)生技術獲得了突破性進展。其中一些種，如歐洲落葉松(Larixdecidua)[5]、日本落葉松(Larixkaempferi)[5～7]、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)[8]、雜種落葉松(L.decidua×principis-rupprechtii)(L.decidua×kaempferi)(L.kaempferi×decidua)(L.kaempferi×olgensis)[9～11]等均已通過體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株。但就目前而言，想要利用落葉松的無性繁殖來代替種子繁殖依然存在許多技術上的難題[2]。尤其是在體胚發(fā)生體系中，優(yōu)質體胚的大量獲得是落葉松體胚規(guī)?；a的重要環(huán)節(jié)，而高質量的體胚能否大量獲得受早期原胚發(fā)育狀態(tài)的直接影響[12～13]。

因此，有必要優(yōu)化體細胞胚胎形成早期的培養(yǎng)條件，以改善原胚團在體胚成熟前的生理和發(fā)育狀態(tài)。但對落葉松屬植物而言，有關該方面的研究報道較少，且尚未見長白落葉松體胚形成早期影響因子研究的詳細報道。

響應面法作為一種多因素實驗數(shù)據(jù)回歸分析方法[14]，具有試驗次數(shù)較少、可分析實驗因素間的交互作用、求得的回歸方程精度高等優(yōu)點，被廣泛應用于農業(yè)、化學、食品及制造等領域[15]。本研究以長白落葉松胚性愈傷組織為材料，通過Box-Behnken Design設計試驗，建立以體胚發(fā)生量為響應值的響應面模型，優(yōu)化長白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件，為其良種的規(guī)?；庇屠玫於ɑA。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)誘導并保存的長白落葉松胚性愈傷組織為研究對象[4]。供試的胚性愈傷組織避光繼代于含2,4-D 0.15 mg·L-1、BA 0.05 mg·L-1、KT 0.05 mg·L-1、肌醇1.0 g·L-1、水解酪蛋白CH 0.5 g·L-1、谷氨酰胺1.0 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃。取增殖培養(yǎng)約14 d的新鮮組織作為試材。

1.2 體細胞胚胎的成熟

稱取約0.2 g長白落葉松胚性愈傷組織，接種到含不同相對離子(無機鹽)濃度及肌醇濃度、且不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上進行過渡培養(yǎng)。一定時間后，將上述組織轉接于含有ABA 20 mg·L-1、PEG400080 g·L-1、AgNO35 mg·L-1、肌醇0.5 g·L-1、谷氨酰胺0.5 g·L-1、水解酪蛋白0.25 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上，(25±1)℃暗培養(yǎng)，完成體細胞胚胎的成熟，8周后統(tǒng)計獲得子葉胚的數(shù)量。各處理均設置3次重復，每次重復接種3團胚性愈傷組織。

1.3 響應面法優(yōu)化體胚形成早期培養(yǎng)條件

前期研究結果[16]的方差分析表明，在長白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)階段，培養(yǎng)周期(P=0.000)、相對離子濃度(P=0.000)及肌醇濃度(P=0.002)對體胚發(fā)生量的影響極為顯著，而蔗糖(P=0.321)、水解酪蛋白(P=0.600)及谷氨酰胺濃度(P=0.122)的影響并不顯著。

因此，本研究著重對培養(yǎng)介質的相對離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等3個因素進行優(yōu)化，以每克胚性愈傷組織的體細胞胚胎發(fā)生量(個·g-1)為響應值建立響應面模型，試驗因素和水平見表1。

表1試驗因素和水平

Table1Experimentalfactorsandlevels

編號Code試驗因素Experimentalfactors處理水平Treatmentlevels-10+1A相對離子濃度Relativeionconcentration(%)02550B肌醇濃度Inositolconcentration(g·L-1)51525C培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)71421

注：以BM培養(yǎng)基所含有的相對離子濃度為100%，以去離子水所含有的相對離子濃度為0%。

Note:The relative ion concentration in the BM medium was 100%,and the relative ion concentration in deionized water was about 0%.

1.4 驗證試驗

為驗證優(yōu)化結果的可靠性，同時考慮到試驗的可行性，選取各條件優(yōu)化值的臨近整數(shù)進行驗證，待體胚成熟后，統(tǒng)計子葉胚的數(shù)量，并與模型預測結果進行比較。驗證共進行3次平行試驗，每次試驗重復接種3團鮮質量約0.2 g的胚性愈傷組織。

1.5 體細胞胚胎的萌發(fā)

選取發(fā)育正常的子葉胚，放置在含有蔗糖20 g·L-1，瓊脂4.0 g·L-1，VB13.0 mg·L-1，AC 2.0 g·L-1的WPM培養(yǎng)基上進行萌發(fā)。每個培養(yǎng)皿接種10個體胚，重復3次。光照時間為16 h·d-1，光照強度約為50 μmol·m-2·s-1。7 d后統(tǒng)計體胚的萌發(fā)率，8周后統(tǒng)計生根率。

1.6 統(tǒng)計與分析

每克胚性愈傷組織的體細胞胚胎發(fā)生量(個·g-1)=體細胞胚胎發(fā)生數(shù)/體胚成熟培養(yǎng)前胚性愈傷組織的鮮質量；體細胞胚胎的萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%；體細胞胚胎的生根率(%)=生根的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%

文中數(shù)據(jù)使用PASW Statistics 18、Minitab 17軟件進行分析，Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 體胚成熟初期培養(yǎng)條件的響應面優(yōu)化結果2.1.1 模型的建立及顯著性檢驗

基于BBD(Box-Behnken Design)的試驗設計及結果見表2。采用響應面分析法分析試驗結果，由此建立以體胚發(fā)生量為響應值Y的回歸方程：

Y=-71.2+819.6A+12.41B+36.94C-1 474.1A2-0.428 2B2-1.31C2+1.08A·B-2.83A·C-0.299 9B·C

(1)

式中：A為培養(yǎng)介質的相對離子濃度(% BM)；B為肌醇濃度(g·L-1)；C為培養(yǎng)周期(d)。

方差分析結果(表3)可知，以體細胞胚胎發(fā)生量為響應值時，上述二次方程模型極顯著(P=0.000)，而該模型的失擬不顯著(P=0.320)，說明該模型的擬合良好，可進行下一步的優(yōu)化研究[17]。本實驗中的3個因素A(P=0.007)、B(P=0.000)、C(P=0.000)，二次項A2(P=0.000)、B2(P=0.000)、C2(P=0.000)及B·C(P=0.007)對響應值的影響極顯著，而因素A與B(P=0.601)、C間交互作用(P=0.352)的影響不顯著。這表明各個具體的試驗因素對響應值的影響并不是簡單的線性關系。

表2響應面設計及試驗結果

Table2Experimentaldesignandresultsofresponsesurfaceoptimizationoftransitioncultureconditions

序號Runs變量VariablequantityABC體胚發(fā)生量(個·g-1)Somaticembryogenesis擬合值Fittedvalues1-1-10210．53219．662+1-10246．30243．823-1+10124．53127．014+1+10171．05161．935-10-1187．00181．576+10-1214．82220．997-10+1128．57122．408+10+1136．61142．0490-1-1276．92273．23100+1-1225．00227．95110-1+1249．11246．16120+1+1113．21116．9013000328．42323．0514000325．93323．0515000314．81323．05

表3離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期對體胚發(fā)生量影響的方差分析

Table3Varianceanalysisoftheeffectofionic,inositolcontentandtheculturedayontheoccurrenceofsomaticembryogenesis

變異來源Sources平方和SS自由度df均方MSF值F?measureP值P?measure顯著性Significant模型Model75590．298398．990．540．000???A1744．911744．918．810．007??B15231．2115231．2164．190．000???C9538．619538．6102．820．000???A231340．4131340．4337．840．000???B26770．216770．272．980．000???C215205．5115205．5163．910．000???AB28．9128．90．310．601NSAC97．8197．81．050．352NSBC1763．211763．219．010．007??殘差Residual463．8592．8失擬Lackoffit358．83119．62．280．320NS純誤差Pureerror105．0252．5總計Total76054．114

** .P<0.010； *** .P<0.001； NS.P>0.050

該模型的相關系數(shù)R-sq=0.993 9、R-sq(調整)=0.982 9、R-sq(預測)=0.921 4，表明此方程可以解釋98.29%的數(shù)據(jù)，且使用該模型推測的結果較為可靠。此外，變異系數(shù)(CV)可以反映模型的置信度，CV值越高，模型的置信度越低，反之相反[18]。本試驗的CV=4.44%，說明該模型的置信度較高，模型方程能夠真實地反映試驗值，可以較好地分析響應值的變化。

2.1.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化

通過Minitab 17軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，并繪制響應面曲線圖及等高線圖。

從圖1～3A可知，每個響應面均為開口向下的凸形曲面，這表明響應值存在最大值[19～21]。在一定范圍內調整體胚形成早期階段的培養(yǎng)條件，體胚發(fā)生量會隨介質所含的相對離子濃度、肌醇濃度以及培養(yǎng)周期的增加或延長而呈現(xiàn)出先提高后降低的變化趨勢。等高線圖可以直觀地反映出各因素間交互作用對響應值的影響[19]。由圖1～3的圖B可知，相對離子濃度、肌醇濃度、培養(yǎng)周期間的交互作用均對體胚發(fā)生量有一定的影響，其交互作用的影響力排序為：肌醇濃度與培養(yǎng)周期>相對離子濃度與培養(yǎng)周期>相對離子濃度與肌醇濃度。

圖1 相對離子濃度與肌醇濃度對體胚發(fā)生量影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface and contour lines effects of ion and inositol content on the occurrence of somatic embryos

圖2 相對離子濃度與培養(yǎng)周期對體胚發(fā)生量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface and contour lines effects of ion concentration and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos

圖3 肌醇濃度與培養(yǎng)周期對體胚發(fā)生量影響的響應面圖及等高線Fig.3 Response surface and contour lines effects of inositol content and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos

圖4 長白落葉松胚性愈傷組織及早期原胚顯微結構A.長白落葉松早期原胚的顯微結構；B.體胚形成早期階段的長白落葉松胚性愈傷組織Fig.4 L.olgensis embryogenic callus and early proembryo microstructure A. Microstructure of early proembryos of L.olgensis; B. Surface structure of embryogenic callus in early stage of somatic embryogenesis of L.olgensis

圖5 長白落葉松體細胞胚胎的成熟Fig.5 The mature somatic embryos of L.olgensis

2.2 最佳培養(yǎng)條件的驗證

通過模型優(yōu)化獲得的最適培養(yǎng)條件為：無機鹽濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，體細胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個·g-1。為便于實際操作，選取各條件的臨近整數(shù)值，具體為：無機鹽濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，重復試驗3次，體胚平均發(fā)生量為336.46 個·g-1，與預測值336.29 個·g-1基本一致，表明該方程與實際情況的擬合良好。

2.3體胚成熟早期培養(yǎng)對體胚形態(tài)發(fā)生及萌發(fā)的影響

形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，在體胚形成早期培養(yǎng)階段，胚性愈傷組織逐漸由半透明轉變?yōu)槿榘咨?，組織表面結構也隨之干燥、最終呈繩索狀或顆粒狀(圖4B)；鏡檢原胚的發(fā)育狀態(tài)相對較好，胚柄類似結構較為粗壯、胚頭飽滿(圖4A)。將這些原胚轉接于含ABA的成熟培養(yǎng)基上約15 d，即有數(shù)量可觀、子葉整齊、大小適中、形態(tài)修長、呈子彈狀的子葉胚出現(xiàn)(圖5)，并且這些胚胎發(fā)生的同步性較高、畸形率低。

相對而言，未經過渡培養(yǎng)而直接進行成熟培養(yǎng)的體胚，其發(fā)生量較低、成熟周期相對較長、同步性差、形態(tài)大小不一且畸形胚所占比率較高。通常，原胚團接種45 d后才可觀察到零星的子葉胚出現(xiàn)，這些胚胎的苗端雖已分化并形成子葉，但仍有部分胚胎根端的胚柄類似結構未能完全消失，導致下胚軸膨大、愈傷化、根原基發(fā)育異常，這些畸形胚的萌發(fā)較為困難且成苗率極低。

綜上所述，在體胚形成的早期階段，適當改變培養(yǎng)基成份進行一定時間的過渡培養(yǎng)可以促進長白落葉松體胚的發(fā)生與形態(tài)建成，并能明顯提高體胚的數(shù)量與質量。最優(yōu)培養(yǎng)條件下獲得的體胚，其萌發(fā)率高達100%，生根率也達80%以上(表4)；與原有的長白落葉松體胚發(fā)生體系[4](子葉胚發(fā)生頻率相對較低，每克愈傷組織上只發(fā)生67.60～179.89個子葉胚，體胚的萌發(fā)率僅為75%，而體胚的生根率不足70%)相比有較大改善。

表4體胚成熟早期培養(yǎng)對體胚萌發(fā)的影響

Table4Effectsofearlyembryocultureonsomaticembryogermination

培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)肌醇濃度Inositolcontent(g·L-1)體胚發(fā)生量(個·g-1)Somaticembryogenesis萌發(fā)率Germinationrate(%)生根率Regenerationrate(%)0—32．33±8．39a62．67±28．87a11．00±5．67a1310336．46±7．25c100b83．33±5．78c1415323．05±4．36b100b50．00±10．0b

注：不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

Note:Different letters indicate significant differences at 0.05 level.

3 討論

植物的體細胞胚胎發(fā)生是一個極為復雜的生物學過程，在體胚發(fā)生的不同階段，原胚團及體細胞胚胎的生理狀態(tài)有所不同[22]。因此需根據(jù)胚胎發(fā)育的需求，適當調整培養(yǎng)基的成份。松杉類植物的體細胞胚胎發(fā)育可分為三個階段，即原胚團時期、胚胎形成早期及胚胎形成晚期[23～24]。根據(jù)原胚團形態(tài)的差異，又可將原胚團時期分為原胚團Ⅰ、原胚團Ⅱ及原胚團Ⅲ等3個階段[25]。而在這3個階段的原胚團中，僅有處于原胚團Ⅲ階段的原胚團才能進一步發(fā)育形成成熟的體細胞胚，而增殖培養(yǎng)基中添加的細胞分裂素(如6-BA、KT)與生長素(如2,4-D、NAA)會促使細胞的無序分裂而破壞體胚的極性，導致原胚團Ⅲ破裂[26]。因此在胚胎形成的早期適當改變培養(yǎng)條件，即在體胚成熟早期進行過渡培養(yǎng)利于針葉樹體細胞胚胎的形態(tài)建成。

培養(yǎng)介質中添加的各類元素在細胞的生命活動過程中均起著不同的重要作用。植物體細胞胚胎發(fā)生的不同階段，胚性細胞對各種無機離子的吸收程度也有所不同[22]。有研究表明，處于不同時期的胚性懸浮細胞中氮元素及礦質元素的含量變化明顯，隨著培養(yǎng)時間的延長，鈣、銅、鐵的含量逐漸降低；鉀、氮、鎂的含量有所增加；而磷的含量則呈現(xiàn)出先增加后急劇降低的趨勢[27]。本研究表明，在長白落葉松體胚成熟的早期階段，適當降低培養(yǎng)基中無機鹽的濃度可以顯著提高成熟體胚的獲得量。推測這種現(xiàn)象的原因可能是：某些無機鹽(如KCl、KH2PO4、MgSO4)的濃度過高，影響或抑制了原胚團細胞對其他無機離子(如Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等與體胚形成至關重要的離子)的吸收與利用[22]，其內在的分子機制尚待進一步研究。

肌醇作為一種小分子有機化合物可以參與滲透壓的調節(jié)，并為植物的生長提供碳源，其衍生物還參與如：細胞內信號轉導、生長素的合成及運輸及植物細胞的抗逆調節(jié)等多種理化過程[28～33]。有研究表明，肌醇作為合成磷脂酰肌醇以及磷脂酰肌醇磷酸的底物，參與維持內膜系統(tǒng)的結構與功能，從而影響生長素調控植物胚胎的發(fā)育過程[33]。日本落葉松及日本×長白落葉松的原胚團經9 g·L-1肌醇高滲處理42 d，胚頭的質量與密度較對照組有明顯的改善[34]。本文的研究結果表明：肌醇濃度對長白落葉松體胚發(fā)生的影響極為顯著。在體細胞胚胎成熟的早期階段，適當提高肌醇濃度可以促進體細胞胚的成熟。

4 結論

本研究對體胚成熟早期階段培養(yǎng)基中無機鹽離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等因素對長白落葉松體胚發(fā)生數(shù)量的影響進行了研究，采用響應面法進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。試驗結果表明：相對離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)以及培養(yǎng)周期(P=0.000)對長白落葉松體胚發(fā)生量的影響極為顯著。模型擬合的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：相對離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，體胚發(fā)生量為337.04 個·g-1。實際操作時調整培養(yǎng)條件為：相對離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，體胚的發(fā)生量為336.46 個·g-1，其萌發(fā)率與生根率分別可達100%、83.33±5.78%，為實現(xiàn)長白落葉松良種的規(guī)?；庇於嘶A。

1.王偉達,李成浩,楊靜莉,等.雜種落葉松未成熟胚的體細胞胚發(fā)生和植株再生[J].林業(yè)科學,2009,45(8):34-38.

Wang W D,Li C H,Yang J L,et al.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature zygotic embryos of hybrid larch[J].Scientia Silvae Sinicae,2009,45(8):34-38.

2.楊書文.落葉松的遺傳改良[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社,1994.

Yang S W.Genetic improvement of larch[M].Harbin:Northeast Forestry University Press,1994.

3.劉足根,朱教君,袁小蘭,等.遼東山區(qū)長白落葉松(Larixolgensis)種子雨和種子庫[J].生態(tài)學報,2007,27(2):579-587.

Liu Z G,Zhu J J,Yuan X L,et al.On seed rain and soil seed bank ofLarixolgensisin montane regions of eastern Liaoning Province,China[J].Acta Ecologica Sinica,2007,27(2):579-587.

4.宋躍,甄誠,張含國,等.長白落葉松胚性愈傷組織誘導及體細胞胚胎發(fā)生[J].林業(yè)科學,2016,52(10):45-54.

Song Y,Zhen C,Zhang H G,et al.Embryogenic callus induction and somatic embryogenesis from immature zygotic embryos ofLarixolgensis[J].Scientia Silvae Sinicae,2016,52(10):45-54.

5.Von Aderkas P,Klimaszewska K,Bonga J M.Diploid and haploid embryogenesis inLarixleptolepis,L.decidua,and their reciprocal hybrids[J].Canadian Journal of Forest Research,1990,20(1):9-14.

6.呂守芳,張守攻,齊力旺,等.日本落葉松體細胞胚胎發(fā)生的研究[J].林業(yè)科學,2005,41(2):48-52.

Lü S F,Zhang S G,Qi L W,et al.Somatic embryogenesis from immature embryos ofLarixkaempferi[J].Scientia Silvae Sinicae,2005,41(2):48-52.

7.汪小雄,楊映根.日本落葉松體細胞胚胎發(fā)生的研究[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(4):2118-2121.

Wang X X,Yang Y G.Study on the somatic embryogenesis ofLarixleptolepis[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(4):2118-2121.

8.齊力旺.華北落葉松體細胞胚胎發(fā)生與遺傳轉化系統(tǒng)建立的研究[D].北京:中國林業(yè)科學研究院,2000.

Qi L W.Studies on the somatic embryogenesis and establishment of experimental system inLarixprincipis-Rupprechtii[D].Beijing:Chinese Academy of Forestry,2000.

9.Klimaszewska K.Plantlet development from immature zygotic embryos of hybrid larch through somatic embryogenesis[J].Plant Science,1989,63(1):95-103.

10.Lelu M A,Bastien C,Klimaszewska K,et al.An improved method for somatic plantlet production in hybrid larch(Larix×leptoeuropaea):Part 1.Somatic embryo maturation[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1994,36(1):107-115.

11.王偉達,李成浩,楊靜莉,等.不同植物生長調節(jié)物質對雜種落葉松胚性愈傷組織增殖的影響[J].東北林業(yè)大學學報,2008,36(9):5-7.

Wang W D,Li C H,Yang J L,et al.Effect of different plant growth regulators on embryogenic callus proliferation of hybrid larix[J].Journal of Northeast Forestry University,2008,36(9):5-7.

12.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所.一種提高針葉樹種體細胞胚胎發(fā)生數(shù)量與質量的培養(yǎng)基:中國,CN1733906A[P].2006-02-15.

INST Forestry CAF.Medium for improving quantity and quality of conifer somatic embryogenesis:Chinese,CN1733906A[P].2006-02-15.

13.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所.一種改良針葉樹種胚性愈傷組織質量的培養(yǎng)基:中國,CN1733905A[P].2006-02-15.

INST Forestry CAF.Culture medium for improving conifer embryogenic callus quality:Chinese,CN1733905A[P].2006-02-15.

14.羅猛,宋卓悅,胡嬌陽,等.超聲法提取山里紅葉總黃酮及其抗氧化活性研究[J].植物研究,2015,35(4):632-637.

Luo M,Song Z Y,Hu J Y,et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromCrataeguspinnatifidaleaves and its antioxidant activities[J].Bulletin of Botanical Research,2015,35(4):632-637.

15.郝學財,余曉斌,劉志鈺,等.響應面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J].食品研究與開發(fā),2006,27(1):38-41.

Hao X C,Yu X B,Liu Z Y,et al.The application of response surface methodology in optimization of microbial media[J].Food Research and Development,2006,27(1):38-41.

16.東北林業(yè)大學.一種提高長白落葉松體細胞胚發(fā)生和植株再生效率的過渡培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法:中國,CN105409767A[P].2016-03-23.

Northeast Forestry University.Transitional culture medium improving somatic embryogenesis and plant regeneration efficiency ofLarixolgensisand culture method:Chinese,CN105409767A[P].2016-03-23.

17.李淑娟,詹亞光,楊傳平,等.基于響應面法的白蠟屬花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基優(yōu)化[J].植物學報,2009,44(2):223-229.

Li S J,Zhan Y G,Yang C P,et al.Response surface methodology to determine the optimal medium for pollen germination for ash[J].Chinese Bulletin of Botany,2009,44(2):223-229.

18.Amenaghawon N A,Nwaru K I,Aisien F A,et al.Application of box-behnken design for the optimization of citric acid production from corn starch usingAspergillusniger[J].British Biotechnology Journal,2013,3(3):236-245.

19.王化,周麗萍,李夢莎,等.微波輔助提取暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷的工藝研究[J].植物研究,2016,36(1):141-145.

Wang H,Zhou L P,Li M S,et al.Optimization of microwave-assisted extraction of syringin and oleuropein fromSyringareticulata[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(1):141-145.

20.劉燕,陳小銀,楊麗麗,等.響應面優(yōu)化菊芋菊糖的提取工藝研究[J].植物研究,2016,36(4):627-633.

Liu Y,Chen X Y,Yang L L,et al.Extraction process optimization of inulin fromHelianthustuberosusL. by response surface methodology[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(4):627-633.

21.林建原,季麗紅.響應面優(yōu)化銀杏葉中黃酮的提取工藝[J].中國食品學報,2013,13(2):83-90.

Lin J Y,Ji L H.Optimization of flavonoids fromGinkgobilobausing respone surface analysis[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2013,13(2):83-90.

22.崔凱榮,戴若蘭.植物體細胞胚發(fā)生的分子生物學[M].北京:科學出版社,2000.

Cui K R,Dai R L.Molecular biology of plant somatic embryogenesis[M].Beijing:Science Press,2000.

23.汪小雄,盧龍斗,郝懷慶,等.松杉類植物體細胞胚發(fā)育機理的研究進展[J].西北植物學報,2006,26(9):1965-1972.

Wang X X,Lu L D,Hao H Q,et al.Research advances about developmental mechanism of somatic embryos in conifers[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2006,26(9):1965-1972.

24.Singh H.Embryology of gymnosperms[M].Berlin:Borntrager,1978.

25.Filonova L H,Bozhkov P V,Von Arnold S.Developmental pathway of somatic embryogenesis inPiceaabiesas revealed by time-lapse tracking[J].Journal of Experimental Botany,2000,51(343):249-264.

26.Filonova L H,Bozhkov P V,Brukhin V B,et al.Two waves of programmed cell death occur during formation and development of somatic embryos in the gymnosperm,Norway spruce[J].Journal of Cell Science,2000,113(24):4399-4411.

27.向太和,鐘華鑫,梁海曼,等.水稻胚性懸浮細胞系建立過程中的生理生化變化[J].作物學報,1995,21(2):223-119.

Xiang T H,Zhong H X,Liang H M,et al.Physiological and biochemical changes during the establishment of embryogenic suspension cell lines of rice(OryzasativaL.)[J].Acta Agronomica Sinica,1995,21(2):223-119.

28.Irvine R F,Schell M J.Back in the water:the return of the inositol phosphates[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2001,2(5):327-338.

29.Hall P J,Bandurski R S.[3H]Indole-3-acetyl-myo-inositol hydrolysis by extracts ofZeamaysL. vegetative tissue[J].Plant Physiology,1986,80(2):374-377.

30.Peskan T,Westermann M,Oelmüller R.Identification of low-density Triton X-100-insoluble plasma membrane microdomains in higher plants[J].European Journal of Biochemistry,2000,267(24):6989-6995.

31.Tiede A,Bastisch I,Schubert J P,et al.Biosynthesis of glycosylphosphatidylinositols in mammals and unicellular microbes[J].Biological Chemistry,1999,380(5):503-523.

32.Borner G H H,Sherrier D J,Weimar T,et al.Analysis of detergent-resistant membranes in Arabidopsis.Evidence for plasma membrane lipid rafts[J].Plant Physiology,2005,137(1):104-116.

33.Luo Y,Qin G,Zhang J,et al.D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function inArabidopsisand is essential for auxin-regulated embryogenesis[J].The Plant Cell,2011,23(4):1352-1372.

34.王靜.利用胚性愈傷組織進行落葉松遺傳轉化體系的研究[D].北京:中國林業(yè)科學研究院,2007.

Wang J.Studies on the transformation ofLarixbased on the system of somatic embryogenesis[D].Beijing:Chinese Academy of Forestry,2007.

National High-tech R&D Program(“863” Program 2013AA102704-04-03)

introduction：SONG Yue(1991—)，male，master，Mainly engaged in larch genetic breeding research.

date:2017-01-06

ResponseSurfaceOptimizationofCultureConditionsfortheFormationofEarlyEmbryosinLarixolgensis

SONG Yue LI Shu-Juan*BAI Xiao-Ming ZHANG Han-Guo

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

With the larch embryogenic callus, through the Design Box-Behnken design test, we established a response surface model based on the somatic embryogenesis. The culture conditions of somatic embryo early maturation was optimized inLarixolgensis. The relative ion concentration(P=0.007), the inositol concentration(P=0.000), the culture period(P=0.000) and the interaction between inositol content and culture period(P=0.007) effect on the number of somatic embryos ofL.olgensiswere extremely significant. Cultivation of Larix somatic embryo maturation was 337.04 ind·g-1at the early stage of the most optimum conditions for relative ion content of 26.767 7% BM basic culture medium, inositol 10.454 5 g·L-1, culture time 12.656 6 d, and the number of somatic embryos average. In order to facilitate the practical operation, the culture condition was changed to the relative ion concentration of 25% BM, inositol 10 g·L-1, incubation period of 13 d, then the average number of somatic embryos was 336.46 ind·g-1, that was consistent with the predicted value 336.29 ind·g-1. Compared with previous test, the quantity and quality ofL.olgensissomatic embryos were increased significantly.

Larix;Larixolgensis;response surface optimization;somatic embryogenesis;early embryo formation

國家高技術研究發(fā)展計劃(“863”計劃2013AA102704-04-03)

宋躍(1991—)，男，碩士研究生，主要從事落葉松遺傳育種方面的研究。

* 通信作者：E-mail：lishujuan@126.com

2017-01-06

* Corresponding author：E-mail：lishujuan@126.com

S791.22；Q943.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.018