王 麗，張煥玲

(1. 陜西省太白林業(yè)局，陜西 太白 721600；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西省林業(yè)綜合實驗室，陜西 楊凌 712100)

?

植物體胚成熟發(fā)育外在影響因素研究進展

王 麗1，張煥玲2*

(1. 陜西省太白林業(yè)局，陜西 太白 721600；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西省林業(yè)綜合實驗室，陜西 楊凌 712100)

體胚發(fā)生是植物離體條件下形態(tài)建成的重要途徑之一，體胚成熟培養(yǎng)是體胚發(fā)生中的關(guān)鍵階段，關(guān)系到體胚再生植株得率大小。影響體胚成熟的外在因素較多，主要有植物生長調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光照條件等。一般認(rèn)為，較高濃度的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)有利于體胚成熟；ABA有利于體胚成熟發(fā)育，尤其是和部分滲透劑結(jié)合使用，效果明顯；高濃度的生長素和分裂素不利于體胚成熟發(fā)育；不同植物體胚成熟發(fā)育對光照條件要求不同，多數(shù)需要在黑暗或極弱光下進行；其他措施如空氣干燥、低溫貯藏、培養(yǎng)基中添加活性炭、硝酸銀、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等也有利于體胚的成熟發(fā)育。

體胚；成熟發(fā)育；影響因素

體胚是植物組織培養(yǎng)中由胚性愈傷組織產(chǎn)生的類似合子胚結(jié)構(gòu)的胚狀體，體胚外面包以人工種皮，就是我們所說的人工種子[1]。體胚具有兩極性結(jié)構(gòu)，可以直接形成再生植株，在無性繁殖上具有一定的優(yōu)越性。開展體胚發(fā)生研究，對于植物的基因工程、細胞工程、雜交育種、良種快繁、轉(zhuǎn)基因受體和突變體篩選等具有重大價值，同時，有助于研究細胞離體培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生、細胞分化與胚胎發(fā)生等重大理論問題[1-3]。

植物體胚發(fā)生技術(shù)開始于1948年Curtis和Micho在蘭屬植物中的研究，之后，在其他許多植物組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)有形成胚狀體的現(xiàn)象，人們開始認(rèn)識到體胚發(fā)生是植物離體培養(yǎng)除器官發(fā)生以外的又一基本途徑[3-4]。盡管植物體胚發(fā)生的普遍性已在200多種植物中得到驗證，且已有應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的報道[4-5]，但得到再生植株的依然很少，尤其木本植物，較低的體胚萌發(fā)率依然是研究與應(yīng)用中的瓶頸。影響體胚萌發(fā)的直接因素是體胚的成熟發(fā)育，體胚成熟過程中的畸形化發(fā)育和愈傷組織化以及玻璃化是阻礙其不能正常萌發(fā)的主要原因[4]。目前，專門研究體胚成熟發(fā)育的報道不多見，因此，探討影響植物體胚成熟的各種因素，對體胚在木本植物中的正常應(yīng)用具有重要意義。

1 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑是對體胚發(fā)生影響最大、現(xiàn)有研究中討論最多的因素。體胚發(fā)育順序嚴(yán)格而不可逾越，但發(fā)育周期長短則因培養(yǎng)基及其中的植物生長調(diào)節(jié)劑種類與配比不同而有較大變化。因此，有意識地改變植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和配比，可以加速體胚發(fā)育的進程。但是植物生長調(diào)節(jié)劑的使用同時會引起大量的畸形胚和畸形植株產(chǎn)生[6-9]。而且由于同一培養(yǎng)基中胚發(fā)育的不同步性，植物生長調(diào)節(jié)劑的加入甚至?xí)鹣喾吹慕Y(jié)果，因為體胚的不同發(fā)育階段需要的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度不同[3,6,10]。

1.1 脫落酸(ABA)

促進體胚成熟最有效的植物生長調(diào)節(jié)劑是ABA[9]。一般認(rèn)為，適當(dāng)濃度的ABA可抑制不正常體胚的形成，防止胚狀體的過早萌發(fā)，促進胚胎正常發(fā)育[10]。ABA可降低培養(yǎng)基中腐胺的水平，抑制體胚的過早萌發(fā)，增加了貯藏蛋白質(zhì)的積累量，從而提高了體細胞的質(zhì)量[11]。ABA對植物體胚發(fā)生的特異基因表達起調(diào)節(jié)作用，可激活有關(guān)基因表達，大量合成貯藏蛋白、胚胎特異性蛋白以及晚期胚胎豐富蛋白[12-13]。在針葉樹的體胚成熟過程中，子葉胚的發(fā)育通常在附加ABA的培養(yǎng)基上促進后期原胚的成熟，形成4～5 mm長帶有伸長子葉的體胚[14]。Pullman和 Gupta在胚的發(fā)育和成熟培養(yǎng)基中同時使用ABA(25～100 mg·L-1)和活性炭(0.05%～0.25%)使花旗松的體胚活力及形態(tài)建構(gòu)都大為改善，產(chǎn)生大量高質(zhì)量的子葉胚[15]。也有人認(rèn)為ABA可能參與了碳水化合物的代謝[16]。B.Cuenca M.C.S an-Jose M.T.Martinez (1999)研究英國櫟(Quercus robur)的體胚再生發(fā)現(xiàn)，在1/2MS培養(yǎng)基上高濃度的蔗糖(8%)與較高濃度的ABA(2.7 mg·L-1)結(jié)合使用成熟處理四周的體胚，轉(zhuǎn)至含0.5 mg·L-1BA的 1/2MS培養(yǎng)基上體胚萌發(fā)率(根伸長)和轉(zhuǎn)化植株率(根芽都伸長)達到43%和36%；而經(jīng)1/2MS成熟的體胚盡管有35%的體胚長出根，但沒有轉(zhuǎn)化成植株[17]。

1.2 生長素

在體胚發(fā)生過程中研究最多的生長素是2,4-D、NAA和IBA。2,4-D對大多數(shù)植物的體胚誘導(dǎo)是必須的，但長時間培養(yǎng)在含2,4-D的培養(yǎng)基上易造成體胚再生能力的喪失。體胚成熟一般需要較低濃度的生長素，如在三葉草和芹菜誘導(dǎo)體胚發(fā)生及發(fā)育中發(fā)現(xiàn)，如不及時降低2，4-D的濃度，那么球形胚就產(chǎn)生次生胚，當(dāng)次生胚發(fā)育到球形胚后又循環(huán)繼續(xù)形成次生胚，由此形成分支的球形胚鏈，從而抑制體胚的正常發(fā)育，而被“鎖”在一個特殊的發(fā)育階段[18]。在荔枝的體胚再生研究也發(fā)現(xiàn)高濃度的2,4-D阻礙了體胚的進一步發(fā)育，而低濃度的NAA和IBA的配合使用有利于體胚的發(fā)育成熟[14]。

1.3 細胞分裂素

體胚成熟一般不需要或僅需要低濃度的細胞分裂素(常用的是6-BA和KT)參與，因為細胞分裂素的使用會促進次生胚的再生，而不利于體胚的成熟。陳智賢(1987)在棉花的體胚發(fā)生研究中認(rèn)為，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)需要一定濃度的生長素與細胞分裂素的配合使用，但體胚的成熟發(fā)育只需要細胞分裂素，濃度不能超過1 mg·L-1，否則會產(chǎn)生抑制作用[19]。

1.4 赤霉素

多數(shù)研究認(rèn)為，體胚成熟過程中一般不加入GA3，它會促進體胚的畸形發(fā)育或早萌[20]。但有人認(rèn)為GA3對體胚的誘導(dǎo)不是必須的，甚至具有抑制作用，但對胚胎進一步發(fā)育成熟或刺激根和小植株生長是有利的[21]。GA3與玉米素、ABA結(jié)合使用，可以促進頁蒿體胚正常發(fā)育[20]。

2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

滲透劑都是高度水合性的多羥基分子，在植物體胚發(fā)生的各個階段發(fā)揮著重要作用，其中蔗糖和葡萄糖為常用的兩種糖類滲透劑，高濃度的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能產(chǎn)生與ABA類似的作用。一般認(rèn)為，高濃度的蔗糖有利于體胚發(fā)育成熟[22-26]，它不僅為體胚的發(fā)育提供能量，并作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，引起細胞失水，使內(nèi)含物升高，促進細胞發(fā)育。減少畸形胚的發(fā)生。也有相反的報道，龍眼體胚發(fā)生中，低糖濃度可減少畸形胚的產(chǎn)生[22]，這可能與不同植物種類體胚發(fā)育對碳源和滲透壓的特殊要求有關(guān)[23]。

山梨醇、甘油、甘露糖醇、聚乙二醇(PEG)等也可用作滲透劑，促進體胚發(fā)生，并能防止其早熟萌發(fā)[25-29]。PEG等滲透劑是不能滲透細胞壁的高分子量化合物，可能會產(chǎn)生與干旱條件下形成相似的水分脅迫，促進體胚成熟[30]。已有證據(jù)表明， PEG、山梨醇等滲透劑與ABA和活性炭同時使用，對改善針葉樹體胚成熟和儲藏物質(zhì)的形成十分有效[31]。白云杉的未成熟體胚在含ABA和PEG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～8周，不但可抑制體胚早熟萌發(fā)，而且成熟同步化及頻率明顯提高；在同時添加山梨醇和ABA的培養(yǎng)基中，成熟體胚的數(shù)目是單獨添加ABA的培養(yǎng)基中的兩倍，同時添加甘露糖醇和ABA的培養(yǎng)基中，成熟體胚的數(shù)目比單獨添加ABA增加了一倍[30,31]。栓皮櫧體胚在添加6%山梨醇的MS培養(yǎng)基中處理3周后，轉(zhuǎn)到不含山梨醇只含低濃度BAP的WPM培養(yǎng)基中能使萌發(fā)率達到20%，而在不含山梨醇的培養(yǎng)基中的的萌發(fā)率僅為1%[32]。劉桂珍在巴西橡膠體胚發(fā)生中用甘油代替蔗糖作為碳源，能明顯促進體胚成熟[33]。

3 光照條件

已報道的影響體胚成熟的光照因素有光強和光質(zhì)。一般認(rèn)為，體胚成熟過程都是在黑暗或極弱光照下完成的[34]。鄧向陽(2000)在光強對花生體胚發(fā)生及再生體系的建立研究中發(fā)現(xiàn)，光下體胚無明顯的根端，芽端雖明顯變綠，但往往發(fā)育不充分，停滯于魚雷期或更早時期[35]。但也有相反的報道，楊金玲等(2000)在白杄體胚的懸浮培養(yǎng)中，將黑暗條件下產(chǎn)生的懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到光下進行體胚的成熟培養(yǎng)，30天后產(chǎn)生大量成熟子葉期體胚[36]。翁浩等(2013)在金花茶的體胚誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，白光利于體胚發(fā)育成熟，單質(zhì)光不利于體胚發(fā)育成熟[37]。

4 其它因素

空氣干燥、低溫貯藏、活性炭、硝酸銀、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等其他因素也影響體胚成熟過程。

干燥可以提高貯存后體胚的轉(zhuǎn)化率[38]。將經(jīng)ABA加PEG處理后的白云杉和黑云杉成熟體胚在相對濕度81%～43%甚至在空氣中干燥兩周后，使其含水量會從原來的60%～70%降至32%后再吸液，可使體胚轉(zhuǎn)化率高達80%以上[30]。

低溫對體胚的成熟和萌發(fā)也有促進作用。Manzanera J A(1992)將栓皮櫧體胚置于鋪有濕潤的纖維素濾膜的封閉培養(yǎng)皿中5℃低溫處理10周和22周，發(fā)現(xiàn)低溫可有效地打破休眠，促進下胚軸伸長，然后將體胚轉(zhuǎn)接在含低濃度6-BA的S培養(yǎng)基上，體胚上胚軸萌發(fā)得到再生植株[39]。

活性炭可吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有毒代謝物和多余植物生長調(diào)節(jié)劑，對體胚發(fā)育有利，其最適的使用濃度為0.05%～0.25%。在子葉期胚發(fā)育培養(yǎng)基中同時加入ABA和活性炭，可使子葉胚產(chǎn)生一種與合子胚更加類似的頂端優(yōu)勢區(qū)，幾周后即可形成大量粗壯的子葉胚[10]。

人們在培養(yǎng)基中加入有機添加物如CH(水解酪蛋白)來促進體胚的成熟發(fā)育，但CH對胚狀體的誘導(dǎo)和發(fā)育還存在分歧，盡管一些實驗表明CH的作用不明顯，但有人認(rèn)為，CH中含有NH4+，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓而影響體胚發(fā)育[4]。此外，組培時白云杉通過在培養(yǎng)基中添加硝酸銀[31]，栓皮櫟通過添加硝酸銀和PVP[26]，均有效促進了其體胚的成熟發(fā)育。

5 研究展望

以往研究中，因?qū)Τ墒祗w胚形態(tài)并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，均以成熟體胚具有較高萌發(fā)率作為判斷體胚發(fā)育是否成熟的依據(jù)，但體胚萌發(fā)率不光受體胚成熟度的影響，還受其他因素如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等的影響，這些因素是否會和影響體胚成熟發(fā)育的因素產(chǎn)生互作效應(yīng)，進而影響實驗結(jié)果，這應(yīng)該是今后研究中需要考慮的。此外，很多研究報道提出了不少可以促進體胚成熟發(fā)育的因素，但缺乏對其促進機理的研究。只有探明其機理，才能從根本上解決體胚成熟發(fā)育不完全，萌發(fā)率低的瓶頸，今后不同因素影響體胚成熟發(fā)育機理應(yīng)作為研究重點之一。

[1] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程(第一版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1999.

[2] 金曉玲,何平.喬木樹種體細胞胚胎發(fā)生的研究與應(yīng)用[J].林業(yè)科學(xué)研究,2003,16(3): 343-350.

[3] 崔凱榮,戴若蘭.植物體細胞胚發(fā)生的分子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2000.

[4] 陳金慧,王洪云,諸葛強，等.林木體胚發(fā)生技術(shù)進展[J].林業(yè)科技開發(fā),2000,14(3): 9-11.

[5] 劉福平,張小杭,崔壽福.植物人工種子研究概況[J].江西科學(xué),2015,33(4):484-489.

[6] 曾超,代金玲,白玉娥,等.林木體細胞胚胎發(fā)生影響因子研究進展[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(16):5100-5103.

[7] 陳敏敏,張建軍,周音,等.百合根外植體體細胞胚胎再生影響因素研究[J].核農(nóng)學(xué)報,2015,29(8):1494-1501.

[8] 崔洪,郭仲琛,桂耀林.芹菜體細胞胚胎發(fā)生及干化體細胞胚的研究[J].植物學(xué)報,1993,35(增刊): 94-96.

[9] 陳夜江,賴鐘雄.果樹和林木體細胞胚胎發(fā)生的研究與利用[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,30(3): 420-426.

[10] Gupta PK,Pullman GS. Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using abscisic acid and smotic potential variation [P]. U.S.Patent,No.5036007,1991.

[11] 李映紅,郭仲琛.青杄在不同條件下的體細胞胚胎發(fā)生及苗的形成[J].植物學(xué)報,1990,32(7):568-570.

[12] Colorado P,Nicolas C,Nicolas G. Expression of three ABA-regulated clones and their relationship to maturation processes during the embryogenesis of chick-pea seeds[J]. Physiologia Plantorum,1995,94: 1-6.

[13] 陳雄,王亞馥.植物體細胞胚發(fā)生中基因表達調(diào)控研究的某些現(xiàn)狀[J].遺傳,1995,17(增): 34-38.

[14] 賴鐘雄,桑慶亮.荔枝胚性愈傷組織發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化及轉(zhuǎn)化抗性愈傷組織培養(yǎng)再生植株[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2003,9(2):131-136.

[15] Pullman GS,Gupta PK. Method for reproducing conifer plants by somatic embryogenesis using adsorbent materials in the development stage media[P].U.S.Patent ,No,5034326,1991.

[16] Vasil V. Characterization of an Embryogenic cell suspension culture derived from cultured nflorescences of pennisetum americanum(Pearl Millet Gramumineae) [J]. Amer.j.Bot,1982,69:1441-1449.

[17] Cuenca B,San-Jose MC,Martinez MT,etal. Somatic embryogenesis from stem and leaf explant of Quercus robur L[J]. Plant Cell Report ,1999,18: 538-543.

[18] 崔凱榮,刑更生,周功克,等.植物植物生長調(diào)節(jié)劑對體細胞胚胎的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)[J].遺傳,2000,22 (5) :349-354.

[19] 薛美風(fēng),郭余龍,李名揚,等.長期繼代對棉花胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力及再生植株變異的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2002,15(4): 19-21.

[20] 劉華英,蕭浪濤,何長征.植物體細胞胚發(fā)生與內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑的關(guān)系研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,28(4): 349-354.

[21] Ammirato PV. Techniques for Propagation and Breeding [M]// Evans DA et al .Handbook of plant cell culture.U.S.A. Macmillan Publ.，1983：82.

[22] 賴鐘雄,陳振亮.龍眼胚性愈傷組織的高頻率體細胞胚胎發(fā)生[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1997,26(3): 271-276.

[23] 黃學(xué)林,李筱菊.乙烯和多胺的生物合成與植物體細胞胚胎發(fā)生[J].植物生理學(xué)通訊,1995,31(2):81-85.

[24] 張宇.蔗糖對水曲柳體細胞胚發(fā)生的影響[J].防護林科技,2015(6):43-44.

[25] 吳麗君.濕地松體胚增殖與成熟培養(yǎng)研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,25(2):217-221.

[26] 張存旭,張煥玲,賈小明,等.栓皮櫟體胚的增殖、成熟與萌發(fā)[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(6):39-45.

[27] Gupta PK.,Pullman GS. High concentration enrichment of conifer embryonal cells[P]. U.S.Patent,No.5041 382. 1991.

[28] Autorus TE,Fowke LC,Dunstan DI. Somatic embryogenesis in conifers[J]. Can J Bot,1991,69(9):1873- 1899.

[29] 吳麗君.火炬松成熟合子胚體胚發(fā)生與成熟試驗[J].福建林業(yè)科技,2013,40(4):74-78.

[30] Fowke LC,Attree SM. Applied and basic studies of somatic embryigenesis in white spruce(Picea glauca) and black spruce(Picea mariana) [M]// Soh WY,Liu JR,Kamamine A. Advances in Development Biology and Biotechnology of Higher Plants. Korea：The Korean Soc Plant Tiss Cult,1993.

[31] Attree SM,Pomeroy MK,Fowke LC. Manipulation of conditions for the culture of somatic embryos of white spruce for improved triacylglycerol biosynthesis and disiccation tolerance[J]. Planta,1992,187(3) : 395-404.

[32] Vladimir Chalupa. Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured immature embryos of oak (\%Quercus robur\% L) and linden.(\%Tilia cordata \%Mill.) [J] . Plant Cell Report,1990,9(7): 398-401.

[33] 劉桂珍.巴西橡膠懸浮細胞培養(yǎng)胚胎發(fā)生與植株再生[J].熱帶植物學(xué)報,1999,20(4):1-5.

[34] 韓碧文,劉淑蘭.植物離體體細胞胚胎發(fā)生[J].植物生理學(xué)通訊,1988(1): 9 -15.

[35] 鄧向陽,衛(wèi)志明.幼胚長度、2,4-D濃度、光強度對花生體細胞胚發(fā)生的影響及高效再生系統(tǒng)的建立[J]. 植物生理學(xué)報,2000,26(6): 525-531.

[36] 楊金玲,桂耀輝,郭仲琛.白杄體細胞胚懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)研究[J].生物工程學(xué)報,2000,16(2): 218 - 220.

[37] 翁浩,賴鐘雄.不同因素對金花茶體胚成熟的影響研究[J].園藝與種苗,2013(7):39-34.

[38] 周麗儂,曹靜.園藝植物體胚發(fā)生及植株再生技術(shù)研究[J].熱帶作物學(xué)報,1998,19(2): 15-19.

[39] Manzanera JA,Astorrga R ,Bueno MA. Somatic embryo induction and germination in \%Quercus\% L [J]. Silvae Genetica ,1993,42(2-3):90-93.

External Factors Affecting Somatic Embryos Maturation of Plants

WANG Li1,ZHANG Huan-Ling2*

(1.TaibaiForestryBureauofShaanxi,TaibaiShaanxi721600; 2.ShaanxiForestryKeyLaboratory,CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100)

Somatic embryogenesis is one of the most important methods on plant morphogenesis in vitro. Maturation is the critical stage during somatic embryogenesis,which related directly to re-generated plant yield. There are many external factors affecting somatic embryo maturation,mainly including plant growth regulators,osmotic adjustment substances,lights and so on. Generally speaking,high concentration of osmotic adjustment substances is beneficial to somatic embryos maturation,and ABA,especially combined with portion of osmotic adjustment substances has obviously effect in maturation,nevertheless high concentration of auxin and cytokinin has opposite effect. Different plant require imparity light during somatic embryos maturation,most of them mature in dark or under very weak light. Other measures such as air drying,cold storage,special additives as activated carbon,argentums nitricum,polyvinylpyrrolidone (PVP) on medium also benefit somatic embryos maturation.

Somatic embryos; maturation; affecting factors

2016-05-18

陜西省林業(yè)綜合實驗室開放課題“幾種重要樹種工廠化育苗技術(shù)研究”

王麗(1973-)，女，陜西榆林人，林業(yè)工程師，主要從事森林資源管理方面的工作。

S722.8

A

1001-2117(2016)05-0074-04

*通訊作者