丑歡歡 唐 紅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，蘭州 730070)

基于ITS和matK基因?qū)δ档そM序列分析及其親緣關(guān)系的研究

丑歡歡 唐 紅*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，蘭州 730070)

以芍藥屬牡丹組全部9個(gè)野生種、5個(gè)紫斑牡丹栽培品種及3個(gè)中原牡丹品種為試材，進(jìn)行核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和葉綠體成熟酶K(matK)基因片段測(cè)序分析，探討ITS和matK序列為牡丹組所有野生種種間關(guān)系提供分子證據(jù)。從GeneBank中選取了1個(gè)牡丹及3個(gè)外類群芍藥、川赤芍和草芍藥的ITS及matK序列。對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增并雙向測(cè)序得到44條序列，人工校正后將所得44條序列進(jìn)行比對(duì)；計(jì)算堿基組成頻率、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換/顛換比率、種內(nèi)及種間遺傳距離，以鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，牡丹組所有個(gè)體ITS序列長(zhǎng)度在750～800 bp，含有86個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，74個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換/顛換比率(R)為1.2；而matK序列含有20個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換/顛換比率(R)為1.7。ITS序列分析將牡丹組野生種分為兩大枝，稷山牡丹、紫斑牡丹、卵葉牡丹和楊山牡丹聚為一枝，狹葉牡丹、滇牡丹、黃牡丹和大花黃牡丹聚為另一枝，這兩枝分別與革質(zhì)花盤亞組和肉質(zhì)花盤亞組相對(duì)應(yīng)，而四川牡丹位于革質(zhì)花盤亞組最底端，支持前人研究將四川牡丹歸為革質(zhì)花盤亞組。matK序列分析的牡丹組野生種間遺傳距離結(jié)果不理想，未能清晰的表明野生種之間的親緣關(guān)系。由此說明，ITS序列更適合牡丹組野生種間親緣關(guān)系的研究分析。

牡丹組；ITS；matK；親緣關(guān)系

牡丹組(PaeoniaSect.MoutanDC)隸屬于毛茛科(Ranunculaceae)芍藥屬(Paeonia)，為我國(guó)特有的落葉亞灌木類群，分布于我國(guó)的西南沿東北方向至中北部地區(qū)，包括云南、西藏、四川、甘肅、陜西、山西、河南和安徽等地[1]，是家喻戶曉的觀賞植物和藥用植物，其觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值的利用歷史已經(jīng)超過了兩千多年的歷史[2]。開展野生牡丹種間親緣關(guān)系研究，具有重要的學(xué)術(shù)和實(shí)踐價(jià)值。然而，目前我們對(duì)野生牡丹種間親緣關(guān)系的認(rèn)識(shí)還有限。在以往的研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要分別從形態(tài)學(xué)[3]、細(xì)胞學(xué)[4]、孢粉學(xué)[5]、地理分布[6]，以及分子標(biāo)記[7]和基因序列[8]等多方面對(duì)野生牡丹的種間關(guān)系進(jìn)行了研究。Sang等利用ITS和matK序列對(duì)芍藥屬部分種進(jìn)行測(cè)定(包括矮牡丹和滇牡丹)，對(duì)于牡丹組親緣關(guān)系未能提供準(zhǔn)確有用的信息[9～11]；林啟冰和周志欽等在Sang及Ferguson研究的基礎(chǔ)上利用Adh基因研究牡丹8個(gè)野生種親緣關(guān)系，結(jié)果對(duì)應(yīng)Stern根據(jù)形態(tài)劃分的革質(zhì)花盤亞組和肉質(zhì)花盤亞組[12]；后來對(duì)8個(gè)野生種的GPAT基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果獲得分辨良好的牡丹組種間關(guān)系樹，這一分子證據(jù)支持的牡丹組種間關(guān)系與形態(tài)學(xué)性狀建立的牡丹組種間關(guān)系相當(dāng)吻合[13]；張金梅等對(duì)牡丹野生種間的親緣關(guān)系與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不一致[14]。然而由于樣本數(shù)量有限及選擇基因的不同，尤其是牡丹復(fù)合體內(nèi)各種間關(guān)系及與四川牡丹的關(guān)系在現(xiàn)有的報(bào)道中沒有得到一致的結(jié)論。因此，充分利用我國(guó)牡丹組種質(zhì)資源，進(jìn)一步全面地開展牡丹組種間親緣關(guān)系的研究與分析是非常必要的。

在高等植物中，核糖體DNA的編碼區(qū)序列是高度保守的，其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal transcribed spacer)由ITS1、ITS2和5.8S共3部分組成，在被子植物中，由于ITS1和ITS2非編碼區(qū)受外界環(huán)境因素的影響較小，承受的選擇壓力較小，因而進(jìn)化速度較快，核苷酸序列變異較大，且主要是以相互獨(dú)立的點(diǎn)突變?yōu)橹?，可為屬以下水平的研究提供較豐富的信息位點(diǎn)和變異位點(diǎn)等有效信息[15]。ITS序列可以顯示親緣關(guān)系很近的種之間的差異，表現(xiàn)出他們之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

matK基因是葉綠體基因組蛋白編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一，也是最早被用于植物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的基因序列之一。目前，matK序列分析已成功為科、屬級(jí)水平類群內(nèi)部的系統(tǒng)重建提供了大量的信息并獲得較高的支持率。同時(shí)matK序列還成功應(yīng)用于某些類群的種間、種內(nèi)的系統(tǒng)進(jìn)化研究[16～20]。

由于前人利用ITS和matK基因?qū)δ档そM關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)，所用的材料、種類不完全相同，因此并未對(duì)其進(jìn)行全面的親緣關(guān)系的探討，本次研究利用ITS和matK基因分別對(duì)全部牡丹組野生種核苷酸進(jìn)行序列分析，希望能在前人的研究基礎(chǔ)上，為牡丹組野生種的親緣關(guān)系及分類找到直接更加清晰可靠的分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的牡丹組野生種材料均采自甘肅省林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣總站的野生牡丹種質(zhì)資源圃，紫斑牡丹栽培品種采自臨洮縣洮陽鎮(zhèn)紫斑牡丹資源圃，中原牡丹品種采自河南洛陽中原牡丹基地。詳細(xì)資料見表1。除了本研究新測(cè)定的基因序列外，在構(gòu)建基因樹時(shí)還使用了GenBank中如下序列。

1.2 葉片總DNA的提取

取冷藏于4℃葉片200 mg，置于液氮中迅速研磨，將研磨后的樣品裝入滅菌的2 mL離心管后，利用植物基因組DNA提取試劑盒(北京，天根)提取總DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。

1.3 ITS和matK序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)GenBank中紫斑牡丹ITS基因的序列(GenBank號(hào)，AF033592.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物ITS1(5′-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-CTTTTCCTCCGCTTATTGATATG-3′)及根據(jù)GenBank中紫斑牡丹matK基因的序列(GenBank號(hào),AF033592.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1(5′-CCTATATCCGCTACTCCTTC-3′)和P2(5′-CTCAGTGAATTTCACCACG-3′)，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL):DNA模板1～1.5 μL(根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整)，上下游引物各0.4 μL，2×Tag Plus PCR Master Mix 9.8 μL，ddH2O(7.9～8.4 μL)，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，(95℃變性30 s，退火溫度43℃持續(xù)45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán))，72℃延伸7 min(引物序列及擴(kuò)增程序如表)。用1%瓊脂糖膠對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR被送往金唯智生物科技有限責(zé)任公司(蘇州)進(jìn)行純化及測(cè)序。為保證測(cè)序的準(zhǔn)確性，采用正反雙向測(cè)序。序列利用軟件BioEdit 5.0及MEGA(ver5.05)進(jìn)行人工校正，對(duì)齊并除去引物區(qū)及測(cè)序質(zhì)量較差區(qū)域的片段，最終獲得干凈、長(zhǎng)度一致的序列用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。利用MEGA 5.05軟件分析序列間的變異位點(diǎn)，計(jì)算種間及品種間遺傳距離。

將芍藥、草芍藥及川赤芍設(shè)為外類群，利用MEGA 5.05分析軟件的K2P距離對(duì)所有實(shí)驗(yàn)樣品的序列以及來自GeneBank的5條序列分別構(gòu)建ITS和matK序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1～2)。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及其來源

圖1 基于牡丹組野生種及部分栽培品種ITS序列和鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 A phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method with ITS sequence of Paeonia Sect. Moutan and part of P.suffruticosa Andr.

圖2 基于牡丹組野生種及部分栽培品種matK序列和鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method with matK sequence of Paeonia Sect.Moutan DC and part of P.suffruticosa Andr.

1.4 ITS和matK序列的數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)學(xué)分析

測(cè)序獲得的DNA序列在MEGA(5.05)上進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇芍藥、草芍藥及川赤芍作為外類群，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。不同序列間的堿基組成頻率、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)點(diǎn)，堿基轉(zhuǎn)換/顛換比率、種內(nèi)種間遺傳距離等用MEGA(5.05)計(jì)算。分別用鄰接法NJ(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

牡丹組全部9個(gè)野生種及紫斑牡丹和中原牡丹栽培品種的44條及來自GeneBank的5條序列經(jīng)MEGA軟件比對(duì)，分析其堿基序列差異，統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)Kimura-2參數(shù)的遺傳距離模型計(jì)算各樣本序列間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以芍藥(Paeonialactiflora)、川赤芍(Paeoniaveitchii)和草芍藥(Paeoniaobovata)作為外類群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

所采集的牡丹野生種與栽培品種的ITS序列長(zhǎng)度在750～800 bp，A、T、C、G平均含量分別為23.6%、20.8%、28.3%和27.3%，G和C含量超過了44.4%，明顯高于A和T含量。序列含有86個(gè)多態(tài)位點(diǎn)、12個(gè)單一位點(diǎn)(singleton sites)和74個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換/顛換比率(R)為1.2(表2)。

牡丹組大多數(shù)個(gè)體間的ITS序列差異較大，遺傳距離在0.000～0.078，牡丹組全部野生種間遺傳距離在0.000～0.020，最小為楊山牡丹與紫斑牡丹，其次是楊山牡丹與稷山牡丹、卵葉牡丹和四川牡丹遺傳距離，為0.002，以及紫斑牡丹與稷山牡丹、卵葉牡丹和四川牡丹遺傳距離，也為0.002；組間最大遺傳距離為大花黃牡丹與稷山牡丹和卵葉牡丹之間，為0.020，其次為大花黃牡丹與楊山牡丹與紫斑牡丹之間。而各栽培品種與種間遺傳距離最大的“粉妝樓”與大花黃牡丹，為0.069；其次是“粉妝樓”與狹葉牡丹，為0.064；表明了牡丹栽培品種與野生種之間的遺傳多樣性?！癙aeoniasuffruticosa”(JN572149.1)與卵葉牡丹的遺傳距離最小為0.000，表現(xiàn)很近的遺傳關(guān)系；與稷山牡丹、四川牡丹、楊山牡丹和紫斑牡丹的遺傳關(guān)系也較近，也說明它們之間的親緣關(guān)系較近。來自GeneBank的Paeonia_delavayi(U27679.1)與實(shí)驗(yàn)材料中黃牡丹、狹葉牡丹和滇牡丹的遺傳距離較小，也表現(xiàn)較近的親緣關(guān)系。來自GeneBank的Paeonia_suffruticosa與卵葉牡丹遺傳距離最小為0.000，而與稷山牡丹、四川牡丹、楊山牡丹、紫斑牡丹及栽培品種“包龍圖”、“蝶戀花”、“粉荷”、“粉燕尾”也較近，遺傳距離為0.002～0.003。在所有外類群與牡丹組中，遺傳距離最大的是“粉妝樓”與Paeonia_lactiflora(JN572150.1)，其次為“粉妝樓”與Paeonia_veitchii(DQ313691.1)。外類群芍藥、草芍藥、川赤芍在發(fā)育樹最底端，明顯和牡丹組物種差距很大(表3)。

表2 牡丹組ITS序列特異位點(diǎn)的變異式樣

表3 基于牡丹組ITS序列的遺傳距離矩陣

ITS的NJ進(jìn)化樹上，A組主要包括鳳丹、稷山牡丹、紫斑牡丹、楊山牡丹及紫斑牡丹的栽培品種“蝶戀花”、“包龍圖”和“粉荷”。B組中的一個(gè)進(jìn)化枝為卵葉牡丹、四川牡丹、來自GengBank的P.suffruticosa及紫斑牡丹栽培品種“粉燕尾”、“粉妝樓”。C組包括中原牡丹的三個(gè)栽培品種“大粽紫”、“姚黃”和“火煉金丹”。D組包括狹葉牡丹、滇牡丹、黃牡丹及大花黃牡丹和P.delavayi。A組、B組、C組、D組具有很強(qiáng)的自展支持率。

2.2 matK序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用引物擴(kuò)增的所有牡丹組野生種及栽培品種的matK序列，長(zhǎng)度為757～780 bp，含有20個(gè)變異位點(diǎn)數(shù)、20個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，沒有單一位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換/顛換比率(R)為1.7，序列間平均距離為0.005 2(表4)。

表4 牡丹組matK序列特異位點(diǎn)的變異式樣

所測(cè)序的matK序列及GenBank獲取的牡丹組野生種和紫斑牡丹matK序列共49個(gè)，用MEGA(5.05)軟件進(jìn)行序列比對(duì)并計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

牡丹組大多數(shù)個(gè)體間的matK序列差異較小，遺傳距離在0.000～0.049，牡丹組野生種間遺傳距離在0.000～0.014，最大為紫斑牡丹與鳳丹、稷山牡丹、卵葉牡丹、四川牡丹和楊山牡丹之間，遺傳距離為0.014；其次為狹葉牡丹與鳳丹、稷山牡丹、卵葉牡丹及四川牡丹之間，遺傳距離為0.011；其余牡丹野生種之間遺傳距離都較小，說明matK未能將牡丹組大部分種的親緣關(guān)系表現(xiàn)出來。除外類群外，紫斑牡丹、狹葉牡丹與各牡丹種及其栽培品種之間遺傳距離較大，表明紫斑牡丹及狹葉牡丹與其它牡丹種的親緣較遠(yuǎn)；且紫斑牡丹與其栽培品種之間的遺傳距離也較大，這點(diǎn)和ITS序列分析的遺傳距離不同(表5)。

基于matK序列的NJ進(jìn)化樹(圖2)顯示，A組包括鳳丹、稷山牡丹和牡丹栽培品種“蝶戀花”、“包龍圖”、“粉燕尾”、“大粽紫”、“火煉金丹”、“姚黃”及來自GeneBank的P.suffruticosa。B組包括楊山牡丹與栽培品種“粉妝樓”。C組卵葉牡丹和“粉荷”為一個(gè)進(jìn)化枝。D組四川牡丹單獨(dú)為一支，說明四川牡丹在系統(tǒng)進(jìn)化過程中，與其它牡丹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。E組包括大花黃牡丹、黃牡丹、滇牡丹、狹葉牡丹和紫斑牡丹以及來自GeneBank的P.delavayi。除了A、B、C組不同外，E組和ITS的NJ樹的進(jìn)化結(jié)果一致，matK序列的NJ樹未清晰地表明其余牡丹種間的親緣關(guān)系。由于所測(cè)序試材matK序列的變異位點(diǎn)比較少，大部分僅在序列的83、322、462和500位點(diǎn)的變異，所以牡丹組內(nèi)的各進(jìn)化枝自展支持率較低，不能很好的區(qū)分牡丹種間及種內(nèi)的演化關(guān)系，但仍支持大花黃牡丹、黃牡丹、滇牡丹及紫斑牡丹聚為一類，表明大花黃牡丹、黃牡丹、滇牡丹及紫斑牡丹的親緣關(guān)系較近。

表5 基于牡丹組matK序列的遺傳距離矩陣

3 討論

3.1 ITS和matK序列及遺傳距離分析

本研究ITS序列長(zhǎng)度在750～800 bp，含有86個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中在42 bp(A)，43 bp(G)，62 bp(C)，78 bp(A)，612 bp(A)處大花黃牡丹、黃牡丹、狹葉牡丹及滇牡丹與其余種之間存在堿基位點(diǎn)的差異；通過分析牡丹組野生種之間的K2P遺傳距離得出，楊山牡丹、稷山牡丹、卵葉牡丹、紫斑牡丹與四川牡丹之間遺傳距離均在0～0.002，而他們與黃牡丹、大花黃牡丹、狹葉牡丹及滇牡丹之間遺傳距離均大于0.200。這說明，ITS序列的位點(diǎn)差異、遺傳距離均可以作為后續(xù)進(jìn)化樹分析結(jié)果的基礎(chǔ)，可以驗(yàn)證ITS序列將牡丹組分為兩個(gè)亞組的可靠性。

在所有物種的matK序列長(zhǎng)度也在750～800 bp，只有20個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，序列間的平均距離只有0.005 2，且紫斑牡丹、楊山牡丹、卵葉牡丹、稷山牡丹及四川牡丹之間遺傳距離在0～0.014，狹葉牡丹他們之間遺傳距離為0.011，而大花黃牡丹、黃牡丹與滇牡丹與其他種間的遺傳距離只有0～0.008，明顯看出所有牡丹種之間遺傳距離存在交叉現(xiàn)象，并不能清楚得到牡丹組分類依據(jù)，說明以matK序列作為牡丹亞組分類的依據(jù)并不可靠，也不能將所有牡丹種之間的親緣關(guān)系表現(xiàn)出來。在牡丹組植物中，matK序列變異速率較高，序列間簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)少，遺傳距離結(jié)果不理想，因此對(duì)于牡丹組野生種間親緣關(guān)系的分析ITS的效果更理想。

3.2 牡丹組野生種間關(guān)系

本研究ITS構(gòu)建的進(jìn)化樹反應(yīng)了牡丹組植物間的親緣關(guān)系。在以前長(zhǎng)期的研究中，由于使用的材料不齊全，或因所使用的基因變異速率太快，牡丹組種間關(guān)系一直存在爭(zhēng)議[21～22]。

本實(shí)驗(yàn)在避免了材料不足的情況下，對(duì)牡丹組各植物進(jìn)行ITS序列分析，結(jié)果顯示大花黃牡丹、黃牡丹、滇牡丹與狹葉牡丹聚為一支，而稷山牡丹、卵葉牡丹、楊山牡丹和紫斑牡丹聚為一支，這一結(jié)果與王蓮英，成仿云等通過形態(tài)學(xué)研究，牡丹組分為革質(zhì)花盤亞組和肉質(zhì)花盤亞組的聚類結(jié)果一致[23～24]，本研究在他們研究的基礎(chǔ)上，利用ITS序列分析將牡丹組9個(gè)野生種分為兩個(gè)亞組，證明前人的結(jié)論是可靠的。

前人研究關(guān)于革質(zhì)花盤亞組中牡丹間親緣關(guān)系也不盡相同，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，紫斑牡丹與稷山牡丹和楊山牡丹親緣關(guān)系最近，與卵葉牡丹親緣關(guān)系也較近，這與鄒喻蘋利用RAPD[7]、林啟冰Adh[12]和趙宣GPAT[13]稷山牡丹與紫斑牡丹及卵葉牡丹之間親緣關(guān)系的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果稷山牡丹同時(shí)也與鳳丹有較近的親緣關(guān)系，這是因?yàn)椤傍P丹”由楊山牡丹馴化而來的栽培品種，這與孟麗在對(duì)部分牡丹野生種及栽培品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析的結(jié)果一致[25]。而在本研究中四川牡丹，位于革質(zhì)花盤亞組的底端，與紫斑牡丹栽培品種存在較近的親緣關(guān)系，這個(gè)結(jié)果與Sang,Tang，Tank[11,27]及鄒喻蘋[25]分析的結(jié)果一致。單從形態(tài)學(xué)看，稷山牡丹與楊山牡丹、紫斑牡丹及卵葉牡丹之間親緣關(guān)系非常近，該類群花盤在花期全包心皮，心皮5(～7)，密被絨毛；而四川牡丹花盤在花期半包心皮，心皮無毛，且不總是5數(shù)，與革質(zhì)花盤亞組中其它種類區(qū)別較明顯；肉質(zhì)花盤亞組則全為肉質(zhì)而僅包心皮下部的花盤。從這一點(diǎn)上，四川牡丹應(yīng)是革質(zhì)花盤亞組中最進(jìn)化的種，肉質(zhì)花盤亞組處于更進(jìn)化的地位。

3.3 牡丹栽培品種與野生種間關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中紫斑牡丹栽培品種“蝶戀花”、“包龍圖”、“粉荷”3個(gè)個(gè)體聚在一起，與楊山牡丹親緣關(guān)系最近，其次和紫斑牡丹野生種聚在一起，與稷山牡丹的親緣關(guān)系不如楊山牡丹近，說明紫斑牡丹作為母本，而楊山牡丹作為父本在紫斑牡丹栽培品種中起到了極大地作用，其基因在紫斑牡丹中產(chǎn)生了很大程度的滲透，而稷山牡丹也存在滲透，可能在不同品種中滲透程度不同，且紫斑牡丹作為雜交親本自身起源的復(fù)雜性及培育代數(shù)也會(huì)影響其栽培品種的形成，這與成仿云，李嘉玨等之前的研究結(jié)果是一致的[27]。另外，從樹中可以看出紫斑牡丹栽培品種“粉燕尾”、“粉妝樓”與卵葉牡丹及P.suffruticosa聚為一支，說明卵葉牡丹也在一定程度上參與了紫斑牡丹栽培品種的雜交馴化，這個(gè)結(jié)果與李嘉玨根據(jù)形態(tài)學(xué)及中國(guó)牡丹栽培馴化的研究結(jié)果一致[28～30]；其次和四川牡丹親緣關(guān)系較近，這點(diǎn)與形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果不一致。由于四川牡丹花盤革質(zhì)，僅半包心皮，心皮無毛且不總為5個(gè)，洪德元和潘開玉并未將其歸在復(fù)合體(包括稷山牡丹、卵葉牡丹、紫斑牡丹)內(nèi)[3]。然而此ITS序列研究則支持紫斑牡丹與四川牡丹有較近的親緣關(guān)系。而中原牡丹品種“大棕紫”、“姚黃”、“火煉金丹”單獨(dú)聚為一支，除了紫斑牡丹栽培品種“粉妝樓”與三者遺傳距離較大為0.053、0.057、0.069外，他們與其他種之間的遺傳距離在0.003～0.026，其中與鳳丹、稷山牡丹、卵葉牡丹、四川牡丹、楊山牡丹遺傳距離較小，說明在中原牡丹品種中楊山牡丹、稷山牡丹及卵葉牡丹及四川牡丹參與其進(jìn)化，此結(jié)果也驗(yàn)證了中原牡丹多元進(jìn)化的特征，與孟麗等中原牡丹起源的研究結(jié)果一致[25]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)牡丹組野生種及部分栽培品種與來自GeneBank上的49條序列經(jīng)過比對(duì)分析，能夠在牡丹組野生種材料充足的條件下利用ITS序列將其清楚的分類，證明牡丹組分為革質(zhì)和肉質(zhì)花盤亞組的可靠性，并對(duì)他們的親緣關(guān)系進(jìn)一步分析。而matK基因由于信息位點(diǎn)不足、遺傳距離分化不明顯及系統(tǒng)進(jìn)化樹不可信，不能單獨(dú)作為牡丹組及部分栽培品種之間的分類。

牡丹野生組由于地理位置分布的差異導(dǎo)致它們產(chǎn)生地理隔離，種質(zhì)很難交流，而處于一個(gè)分布區(qū)的種質(zhì)親緣關(guān)系則較近，分布區(qū)環(huán)境及不同的生物因素會(huì)影響牡丹組進(jìn)化過程中形態(tài)的變化[31]。研究人員會(huì)根據(jù)亞組間形態(tài)及生物學(xué)特性的不同進(jìn)行牡丹近緣及遠(yuǎn)緣雜交選育工作，而親本的選擇極為關(guān)鍵[32]，所以，清楚了解牡丹組間及野生種與栽培品種之間的親緣關(guān)系對(duì)于雜交育種工作極為重要，何麗霞曾對(duì)牡丹野生種之間進(jìn)行亞組內(nèi)及組間正反的雜交，選育出50多個(gè)雜交新品種，為我國(guó)牡丹育種工作提供了重要依據(jù)[34]。

本研究利用核基因ITS和葉綠體基因matK進(jìn)行測(cè)序，ITS能夠揭示出牡丹組野生種間一定的親緣關(guān)系，而葉綠體基因的進(jìn)化還是比較保守，對(duì)牡丹組間的類群所提供的信息位點(diǎn)不足，原因可能與樣本量大小有關(guān)，在今后的研究中可適當(dāng)加大樣本量。牡丹是“多地”“多元”“多種”起源，種內(nèi)種間雜交事件復(fù)雜及其漸滲雜交和反復(fù)回交，導(dǎo)致其具有豐富的遺傳多樣性[28]。而在牡丹遺傳多樣性、鑒定品種和選擇雜交親本的研究偏少，因此，尋找高效的遺傳標(biāo)記及在基因組的層面上解決這些問題，能夠?yàn)槟档ば缕贩N培育提供一定的理論基礎(chǔ)[34～35]。

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WithITSnuclear gene sequence as molecular markers to establish research of Paeonia Rockii cultivars in gansu province standard(GNSW-2014-7)；Gansu Province Agricultural and Pastoral Office biological technology special project

introduction：CHOU Huan-Huan(1993—),female,master’s graduate students,mainly engaged in forest tree genetics and breeding research.

date:2017-01-06

InterspecificRelationshipamongtheWildSpeciesofPaeoniaSect.MoutanDCwithITSandmatKSequence

CHOU Huan-Huan TANG Hong*

(College of Forestry in Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070)

Revealing the interspecific relationship between wild species ofPaeoniaSect.MoutanDC at molecular evidences would provide theoretical basis for preserving and utilizing wild peony resources. The sequence of ribosomal DNA internal transcribed spacer(ITS) and the coding region of thematKgene sequenced from 9PaeoniaSect.MoutanDC, 5 cultivars ofP.rockii, and 3 accessions ofP.suffriticosa. Sequences ofITSandmatKof oneP.suffruticosa, oneP.delavayiand three outgroups ofP.lactiflora,P.veitchiiandP.obovatawere retrieved from GeneBank. The 44 sequences were obtained and corrected, and the divergences, variable sites, parsim-informative sites, the ratio of transition to transversion(R) and pairwise distances were analyzed. The phylogenetic analysis was conducted by Neighbor-joining(NJ) method. The size ofITSsequences ofPaeoniaSect.MoutanDC wild species and cultivars ranged from 750 to 800 bp containing 86 polymorphic sites and 74 parsim-informative sites with R of 1.2, whereas, theirmatKsequences encompassing 20 parsim-informative sites with R of 1.7. From the phylogenetic trees ofITS,P.jishanensis,P.rockii,P.qiuiandP.ostiifell into a large clade. The similarity coefficients betweenP.ludlowii, and the species ofP.lutea,P.potaniniiandP.delavayiwere clustered in another clade. These two clades corresponded well to Subsect.P.decompositawere at the bottom of Subsect. Vaginatae, which showed the classification ofP.decompositainto Subsect Vaginatae. BymatKsequences analysis, there is closely genetic distance between wild species fromPaeoniaSec.MoutanDC; however, there was no clear genetic relationships between wild species. As a result,ITSsequence can be better used to study interspecific relationship among wild species ofPaeoniaSect.MoutanDC.

PaeoniaSect.MoutanDC;ITS;matK;genetic relationship

以核基因ITS序列為分子標(biāo)記建立甘肅省紫斑牡丹品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)的研究(GNSW-2014-7)；省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(xiàng)

丑歡歡(1993—)，女，研究生，主要從事林木遺傳育種方面的研究。

* 通信作者：E-mail:gsth@21cn.com

2017-01-06

* Corresponding author：E-mail:gsth@21cn.com

S567.1+5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.017