胡文杰 羅 輝 鄒林海 李冠喜

(1.井岡山大學生命科學學院，吉安 343009； 2.井岡山大學醫(yī)學院，吉安 343000； 3.曲阜師范大學生命科學學院，曲阜 273165)

雪松松針揮發(fā)油化學成分及抗氧化活性研究

胡文杰1羅 輝2鄒林海1李冠喜3*

(1.井岡山大學生命科學學院，吉安 343009；2.井岡山大學醫(yī)學院，吉安 343000；3.曲阜師范大學生命科學學院，曲阜 273165)

采用水蒸氣蒸餾法提取雪松松針揮發(fā)油，利用氣相色譜-質譜聯用技術分析其化學成分。使用維生素C為陽性對照，以DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基清除作用為指標評價揮發(fā)油的抗氧化活性。從雪松松針揮發(fā)油中鑒定了37種化學成分，占揮發(fā)油總量的95.10%，以烴類和醇類為主；揮發(fā)油對DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基有明顯的清除作用，其IC50分別為0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，且呈現一定的量效關系?？梢?雪松松針揮發(fā)油中含有多種有應用價值的化學成分，具有顯著的抗氧化活性。

雪松；揮發(fā)油；化學成分；氣相色譜—質譜聯用儀；抗氧化活性

雪松(Cedrusdeodara(Roxb.)G.Don)是松科(Pianaceae)雪松屬(CedrusTrew)樹種的泛稱，包括雪松(C.deodara)、黎巴嫩雪松(C.libani)、短葉雪松(C.brevifolia)和北非雪松(C.atlantica)，該植物原產于喜馬拉雅山西部自阿富汗至印度海拔1 300～3 300 m，中國自1920年起引種，現在長江流域各大城市中廣泛栽培[1]。雪松松針含有萜類、苯丙素類、黃酮類、酚酸類以及甾體類化合物等[2～4]，富含兒茶素、沒食子酸和原兒茶酸等多酚類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等作用[5～7]。目前有關雪松的研究主要集中于化學成分的提取、分析、化感和抑菌等方面，但其揮發(fā)油的抗氧化活性研究未見報道，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取雪松松針揮發(fā)油，運用氣相色譜—質譜聯用技術(GC-MS)分析其化學成分，并以DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基的清除作用為指標評價雪松松針揮發(fā)油的抗氧化活性，為雪松松針資源的開發(fā)利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

樣品于2015年3月采自吉安；Perkinelmer-Clarus 680型氣相色譜—質譜聯用儀(美國Perkin Elmer公司)；1，1-二苯基苦基苯肼[DPPH，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；2,2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二氨鹽(ABTS)，上海華藍化學科技有限公司；C8-C40正構烷烴(上海西域科技有限公司)；無水硫酸鈉等均為國產分析純。

1.2 雪松松針揮發(fā)油的提取

稱取新鮮雪松松針樣品400 g，放入圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，收集精油，用無水硫酸鈉干燥，得到淡黃綠色透明液體。共提取5組樣品，取平均值，雪松松針出油率為0.39%。

1.3 雪松松針揮發(fā)油的氣相色譜—質譜分析

色譜條件:Elite-5 MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高純氦氣為載氣；體積流量為1 mL·min-1；分流比為：20∶1；程序升溫初始溫度為50℃，以3℃·min-1升至140℃，保持5 min，以10 ℃·min-1升至260℃，保持10 min；進樣量為0.5 μL。質譜條件：電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，掃描質量范圍50～620 amu。

1.4 保留指數RI值的測定

取正構烷烴混合對照品，按照1.3實驗條件下分析，記錄每個正構烷烴出峰的保留時間，采用保留指數的線性升溫公式計算各組分的RI值：

RI=100n+[100(tx-tn)]/[(tn+1-tn)]

(1)

式中：tx、tn和tn+1(tn

1.5 雪松松針揮發(fā)油的抗氧化活性測定1.5.1 對DPPH自由基清除的測定方法

用95%乙醇將雪松松針揮發(fā)油配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的溶液，取0.5 mL樣品溶液和2 mL濃度為24 mmol·L-1的DPPH乙醇(95%)溶液混合，在黑暗中靜置30 min，于波長517 nm處測吸光度(A)，以乙醇為空白對照，測定對照組吸光度(A0)；以VC為陽性對照，最后根據下列公式計算各濃度溶液對DPPH自由基的清除率：

清除率=(1-A/A0)×100%

(2)

上述試驗均重復3次，結果取平均值。

1.5.2 對ABTS自由基清除的測定方法

將相同體積的7 mmol·L-1ABTS·溶液與2.45 mmol·L-1過K2S2O8混勻，黑暗處理12～16 h，形成穩(wěn)定溶液。取適量上述溶液加水，調節(jié)溶液使其在734 nm處的吸光度為0.700±0.02。將0.5 mL不同濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的雪松松針揮發(fā)油溶液混合2 mL的ABTS·溶液，在室溫下反應6 min，測定734 nm處的吸光度；以VC為陽性對照，ABTS·清除率的計算公式如下：

清除率=(1-A1/A0)×100%

(3)

式中：A0為不加雪松松針揮發(fā)油溶液的ABTS·溶液的吸光度；A1為加雪松松針揮發(fā)油溶液后的ABTS·吸光度。

上述試驗均重復3次，結果取平均值。

1.5.3 對羥基自由基清除的測定方法

分別取不同濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 μg·mL-1的雪松松針揮發(fā)油溶液1 mL，在體系中分別加入6 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，6 mmol·L-1的水楊酸—乙醇溶液1 mL，6 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL，定容至10 mL。在37℃恒溫下反應30 min，在510 nm處測定吸光度(A)，以蒸溜水為空白對照，于510 nm處測定吸光度(A0)，以VC為陽性對照，羥基自由基清除率的計算公式如下：

清除率=(1-A1/A0)×100%

(4)

上述試驗均重復3次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 雪松松針揮發(fā)油化學成分

雪松松針揮發(fā)油化學成分GC-MS分析的總離子流圖見圖1，采用峰面積歸一化法估算各組分相對含量，對總離子流圖中各色譜峰計算其RI值(表1)。從雪松松針揮發(fā)油中共鑒定出37種化學成分，占揮發(fā)油總量的95.10%。

表1 雪松松針揮發(fā)油成分及其相對含量

圖1 雪松松針揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.1 TLC of volatile oil in tubers from pine needles of C.deodara

Table2ComponentsandtotalrelativecontentsofvolatileoilsfromthepineneedlesofC.deodara

化學成分種類Chemicalspecies烯烴類Olefinhydrocarbon醇類Alcohols酮類化合物Ketones醛類化合物Aldehydes酯類化合物Esters氧化物類Oxidescervidaes相對百分含量Relativecontent(%)90．284．240．220．020．240．10

由表1～2可知，雪松松針揮發(fā)油化學成分比較復雜，含有烴類、醇類、酮類、醛類、酯類及氧化物類等，以烴類和醇類化合物為主。揮發(fā)油中烴類化合物20種(90.28%)，即α-蒎烯、莰烯、金鐘柏-2,4(10)-二烯、β-側柏烯、β-蒎烯、月桂烯、α-水芹烯、對傘花烴、羅勒烯、γ-松油烯、檸檬烯、衣蘭烯、α-蓽澄茄油烯、異喇叭烯、β-波旁烯、石竹烯、香橙烯、雪松烯、α-石竹烯和γ-木羅烯；醇類化合物11種(4.24%)，即龍腦、1-松油醇、1,3,3-三甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-醇、4-萜烯醇、α-松油醇、1,2-二甲基-3-(1-甲乙烯基)環(huán)戊醇、6-崁烯醇、蓽澄茄油烯醇、α-畢橙茄醇、α-紅沒藥醇和表藍桉醇；酮類化合物2種(0.22%)，即2-十一烷酮和2-十三烷酮；醛類化合物1種(0.02%)，即反-2-十二烯醛；酯類化合物2種(0.24%)，即乙酸龍腦酯和月桂酸乙酯；氧化物類化合物1種(0.10%)，即石竹烯氧化物。揮發(fā)油中相對百分含量大于1%的化合物：烴類有7種(87.77%)，即α-蒎烯、β-側柏烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、檸檬烯和石竹烯；醇類有1種(2.99%)，即α-松油醇。而酮類、醛類、酯類和氧化物類在本試驗中各成分相對百分含量均低于1%。

2.2 雪松松針揮發(fā)油的抗氧化活性2.2.1 雪松松針揮發(fā)油對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過氧化自由基的有效濃度和打斷脂質過氧化鏈式等作用。由圖2可知，雪松松針揮發(fā)油對DPPH·具有一定的清除作用，揮發(fā)油濃度為0.8 μg·mL-1時，清除率為79.56%，但清除率略高于同濃度的VC。揮發(fā)油對DPPH·的清除率隨著揮發(fā)油濃度的增加而增大，兩者呈正相關，揮發(fā)油濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=49.143x+35.434(R2=0.95)，IC50(清除率為50%時樣品的濃度)為0.30 μg·mL-1；VC質量濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=57.711x+23.211(R2=0.96)，對照品VC的IC50為0.46 μg·mL-1。

圖2 雪松松針揮發(fā)油對DPPH·的清除效果Fig.2 DPPH·scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

2.2.2 雪松松針揮發(fā)油對ABTS·的清除作用

ABTS·清除法是被國內外廣泛應用的一種測定總抗氧化能力的方法，其具有操作簡單、快速等優(yōu)點。由圖3可知，雪松松針揮發(fā)油對ABTS·具有一定的清除作用，清除效果優(yōu)于VC，且隨著樣品濃度的增加，兩者清除率的差異逐漸減小。揮發(fā)油濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=39.444x+41.452(R2=0.86)，IC50為0.22 μg·mL-1；VC濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=52.76x+19.034(R2=0.93)，對照品VC的IC50為0.59 μg·mL-1。

圖3 雪松松針揮發(fā)油對ABTS·的清除效果Fig.3 ABTS· scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

2.2.3 雪松松針揮發(fā)油對·OH的清除作用

羥自由基在生物體內可與脂類糖類、多肽、蛋白質、DNA，尤其是硫胺和鳥苷發(fā)生反應，是目前所知活性氧中活性最強、危害最大的一種自由基。由圖4可知，隨著揮發(fā)油濃度的升高，對·OH的清除率也隨著增大，當揮發(fā)油濃度為0.8 μg·mL-1時，清除率為42.22%，揮發(fā)油濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=44.751x+6.8976(R2=0.83)；VC濃度(x)與清除率(y)的回歸方程為y=57.124x+19.995(R2=0.93)；雪松松針揮發(fā)油和VC的IC50分別為0.96和0.53 μg·mL-1。

圖4 雪松松針揮發(fā)油對·OH的清除效果Fig.4 ·OH scavenging effects of volatile oil from the pine needles of C.deodara

3 討論

本試驗結果與李曉鳳等[8]對雪松枝葉揮發(fā)油的化學成分分析的結果存在相似性，α-蒎烯、莰烯、β-側柏烯、β-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯、α-石竹烯、對傘花烴、γ-木羅烯、龍腦、α-松油醇和石竹烯氧化物均是兩者共有的化學成分。本試驗所檢測到的揮發(fā)油化學成分和前人[8]一樣多，為37種，金鐘柏-2,4(10)-二烯、月桂烯、羅勒烯、γ-松油烯、衣蘭烯、α-蓽澄茄油烯、異喇叭烯、β-波旁烯、石竹烯、香橙烯、雪松烯、1-松油醇、1,3,3-三甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-醇、4-萜烯醇、1,2-二甲基-3-(1-甲乙烯基)環(huán)戊醇、6-崁烯醇、蓽澄茄油烯醇、α-畢橙茄醇、α-紅沒藥醇、表藍桉醇、2-十一烷酮、2-十三烷酮、反-2-十二烯醛、乙酸龍腦酯和月桂酸乙酯首次在本試驗中發(fā)現。導致以上結果的原因可能是采集的時間、采集的地點以及揮發(fā)油提取過程中提取條件的差異等因素造成的，有待于進一步研究。

雪松松針揮發(fā)油化學成分比較復雜，含有多種具有應用價值的化學成分。α-蒎烯是雪松松針揮發(fā)油的重要組成成分，能合成多種香料，具有很強的抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化劑和鎮(zhèn)痛等[9～13]生物活性；β-蒎烯不但能人工合成多種香料，而且還是樟腦，冰片、維生素A、E、K、萜烯樹脂等的重要原料，具有抗真菌、抗病毒、抗血壓等用途[14～17]；月桂烯是香料產業(yè)中重要的化學品原料和中間體，可合成薄荷，檸檬醛，香茅醇，香葉醇，橙花醇和芳樟醇等[18]；檸檬烯是食物、肥皂和香料的添加劑，具有抗胃病、抗惡性細胞增生等作用[19～21]；α-松油醇可用作食用香料等[22]。此外，雪松松針揮發(fā)油中還有一些化學成分，其功效目前尚未明確，有待于進一步研究。

自由基是細胞代謝的副產物，具有高度氧化作用，人體內過多的自由基可引起衰老和多種疾病的發(fā)生，抗氧化劑可清除自由基，調整和改善人體生理功能，有助于人體抵抗疾病、延緩衰老[23]。人工合成的抗氧化劑具有潛在的毒性和致癌作用，大多數國家已限制甚至禁止使用，而天然抗氧化劑因其安全、無毒、高效等優(yōu)點備受人們關注和歡迎。本研究結果表明，雪松松針揮發(fā)油對DPPH·、ABTS·和·OH 3種自由基的清除能力與樣品揮發(fā)油濃度有明顯的量效關系，隨著揮發(fā)油濃度的升高，對這3種自由基的清除能力逐漸增強。當揮發(fā)油濃度達到1.2 μg·mL-1時，對DPPH·、ABTS·和·OH的清除率分別達到90.86%、85.43%及53.37%。雪松松針揮發(fā)油對DPPH·、ABTS·和·OH的IC50值分別為0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，以IC50值為指標，雪松松針揮發(fā)油對3種自由基的清除能力大小為：ABTS·>DPPH·>·OH。另外，雪松松針揮發(fā)油對DPPH·和ABTS·的清除作用均優(yōu)于VC，而對·OH的清除作用卻略低于VC，說明雪松松針揮發(fā)油具有較好的體外抗氧化活性，但其體內抗氧化活性及藥理作用有待進一步研究。

4 結論

揮發(fā)油是雪松的主要生物活性成分，對雪松松針揮發(fā)油化學成分和生物活性研究有重要意義。本試驗從雪松松針揮發(fā)油中分離鑒定出37種化合物，含有烴類、醇類、酮類、醛類、酯類及氧化物類等成分，其中以烴類和醇類為主，占94.52%。雪松松針揮發(fā)油中含有多種在食品、醫(yī)藥、化工等方面有重要用途的物質，如α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和檸檬烯等。雪松松針揮發(fā)油具有較好的抗氧化活性，在一定的質量濃度范圍內，對DPPH·、ABTS·和·OH的IC50分別為0.30、0.22及0.96 μg·mL-1，且呈現一定的量效關系。

1.中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:7卷[M].北京:科學出版社,1978:200-204.

China Flora Editorial Board of CAS.Flora Reipublicae Popularis Sinicae,Tomus 7[M].Beijing:Science Press,1978:200-204.

2.劉東彥,石曉峰,李沖,等.雪松松針黃酮類化學成分的研究[J].中草藥,2011,42(4):631-633.

Liu D Y,Shi X F,Li C,et al.Chemical constituents of flavonoids in pine needles ofCedrusdeodara[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2011,42(4):631-633.

3.石曉峰,白朝輝,劉東彥,等.雪松松針二氯甲烷提取物的化學成分研究[J].中藥材,2012,35(3):404-406.

Shi X F,Bai Z H,Liu D Y,et al.Study on the chemical constituent from the dichloromethane extract of the pine needles ofCedrusdeodara[J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2012,35(3):404-406.

4.郝曉雯,張龍,杜莉謝,等.XRF法測定雪松松針及花粉中的無機元素[J].煙臺大學學報:自然科學與工程版,2016,29(1):22-27.

Hao X W,Zhang L,Du L X,et al.Determination of inorganic elements in pine needles and pine pollen ofCedrusdeodaraby XRF[J].Journal of Yantai University:Natural Science and Engineering Edition,2016,29(1):22-27.

5.Chaudhary A K,Ahmad S,Mazumder A.Cognitive enhancement in aged mice after chronic administration ofCedrusdeodaraLoud.andPinusroxburghiiSarg.with demonstrated antioxidant properties[J].Journal of Natural Medicines,2014,68(2):274-283.

6.Dhayabaran N D,Florance E J,Nandakumar R K,et al.Anticonvulsant activity of fraction isolated from ethanolic extract of heartwood ofCedrusdeodara[J].Journal of Natural Medicines,2014,68(2):310-315.

7.Majid A,Azim A,Hussain W,et al.Antibacterial effects ofCedrusdeodaraoil against pathogenic bacterial strains in vitro approaches[J].International Journal of Biosciences,2015,6(1):185-191.

8.李曉鳳,焦慧,袁藝,等.雪松枝葉揮發(fā)性物質的化感作用及其化學成分分析[J].生態(tài)環(huán)境學報,2015,24(2):263-269.

Li X F,Jiao H,Yuan Y,et al.Allelopathic effects and chemincal components of the volatiles fromCedrusdeodaraleaves and branches[J].Ecology and Environmental Sciences,2015,24(2):263-269.

9.Bae G S,Park K C,Choi S B,et al.Protective effects of alpha-pinene in mice with cerulein-induced acute pancreatitis[J].Life Sciences,2012,91(17-18):866-871.

10.Dorman H J D,Figueiredo A C,Barroso J G,et al.In vitro evaluation of antioxidant activity of essential oils and their components[J].Flavour and Fragrance Journal,2000,15(1):12-16.

11.Wang W,Li N,Luo M,et al.Antibacterial activity and anticancer activity ofRosmarinusofficinalisL.essential oil compared to that of its main components[J].Molecules,2012,17(3):2704-2713.

12.Aydin E,Türkez H,Geyikoglu F.Antioxidative,anticancer and genotoxic properties ofα-pinene on N2a neuroblastoma cells[J].Biologia,2013,68(5):1004-1009.

13.Wang W,Wu N,Zu Y G,et al.Antioxidative activity ofRosmarinusofficinalisL. essential oil compared to its main components[J].Food Chemistry,2008,108(3):1019-1022.

14.Liao S L,Shang S B,Shen M G,et al.One-pot synthesis and antimicrobial evaluation of novel 3-cyanopyridine derivatives of(-)-β-pinene[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2016,26(6):1512-1515.

15.Li J,Tian X R,Gao Y Q,et al.A value-added use of volatile turpentine:antifungal activity and QSAR study ofβ-pinene derivatives against three agricultural fungi[J].RSC Advances,2015,5(82):66947-66955.

17.Guzmán-gutiérrez S L,Gómez-cansino R,García-zebadúa J C,et al.Antidepressant activity ofLitseaglaucescensessential oil:identification ofβ-pinene and linalool as active principles[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,143(2):673-679.

18.王金娥,朱岳麟,熊常健.月桂烯的來源及其在香料化學中的應用[J].山東化工,2011,40(3):47-50.

Wang J E,Zhu Y L,Xiong C J.Sources and application in perfume chemistry of myrcen[J].Shandong Chemical Industry,2011,40(3):47-50.

19.Sun J.D-Limonene:safety and clinical application[J].Alternative Medicine Review,2007,12(3):259-264.

20.Whysner J,Williams G M.D-Limonene mechanistic data and risk assessment:absolute species-specific cytotoxicity,enhanced cell proliferation,and tumor promotion[J].Pharmacology & Therapeutics,1996,71(1-2):127-136.

21.Bacanli M ,Baaran A A,Baaran N.The antioxidant and antigenotoxic properties of citrus phenolics limonene and naringin[J].Food and Chemical Toxicology,2015,81:160-170.

22.葛麗娜,韓雪,任珂珂,等.火棘花揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析及抗氧化活性研究[J].植物研究,2014,34(2):276-281.

Ge L N,Han X,Ren K K,et al.GC-MS analysis on chemical constituents and antioxidant activity of volatile oil from pyracantha fortuneana flowers[J].Bulletin of Botanical Research,2014,34(2):276-281.

23.陳志偉,程鵬,王如剛,等.石榴花揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析及體外抗氧化活性測定[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2013,33(4):280-282.

Chen Z W,Cheng P,Wang R G,et al.Analysis of the chemical constituents of essential oil from pomegranate flower by GC-MS and determination of its antioxidant activityinvitro[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy,2013,33(4):280-282.

The Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20151278);Science and technology projects of northern jiangsu in Jiangsu province(BN2014029)

introduction：HU Wen-Jie(1974—),male,Doctor,Mainly engaged in natural product chemistry.

date:2017-02-21

ChemicalComponentsandAntioxidantActivityofVolatileOilfromPineNeedlesofCedrusdeodara

HU Wen-Jie1LUO Hui2ZOU Lin-Hai1LI Guan-Xi3*

(1.College of Life Sciences,Jinggangshan University,Ji’an 343009；2.School of Medicine,Jinggangshan University,Ji’an 343000；3.School of Life Sciences,Qufu Normal University,Qufu 273165)

The volatile oil from pine needles ofCedrusdeodarawas extracted by water-steam distillation and analyzed by GC-MS. The antioxidant activity of volatile oil was evaluated by DPPH·, ABTS· and ·OH scavenging capacity with VCas the positive control. Thirty-seven components, accounting for 95.10% of total components, were identified. Olefin hydrocarbon and alcohols were found to be dominant components in the volatile oil. The volatile oil exhibited significant scavenging capacity against DPPH·, ABTS· and ·OH in a concentration fashion. When the scavenging rate against DPPH·, ABTS· and ·OH of volatile oil was 50%, the contents of volatile were 0.30, 0.22 and 0.96 μg·mL-1, respectively. The volatile oil from pine needles ofC.deodaracontains a variety of chemical composition of application value with a certain antioxidant activity.

Cedrusdeodara;volatile oil;chemical components;GC-MS;antioxidant activity

江蘇省自然基金(BK20151278)；江蘇省蘇北科技項目(BN2014029)

胡文杰(1974—)，男，博士，主要從事天然產物化學研究。

* 通信作者：E-mail:1040411985@qq.com

2017-02-21

* Corresponding author：E-mail:1040411985@qq.com

S682.31；Q945.6+4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.019