何懿菡 韓立敏 劉玉萍 田 娜 蘇 旭 王喆之*

(1.陜西師范大學生命科學學院，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，西安 710119； 2.青海師范大學生命與地理科學學院，西寧 810008； 3.陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院，西安 710061)

鼠尾草葉綠體基因組序列分析

何懿菡1,2韓立敏3劉玉萍2田 娜1蘇 旭2王喆之1*

(1.陜西師范大學生命科學學院，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，西安 710119；2.青海師范大學生命與地理科學學院，西寧 810008；3.陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院，西安 710061)

鼠尾草(Salviajaponica)是唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)的一種多年生草本植物，具有十分重要的藥用和經(jīng)濟價值。本文采用第二代測序技術Illumina Hiseq平臺對鼠尾草的葉綠體基因組進行測序，同時以鼠尾草近緣物種丹參葉綠體基因組作為參考，組裝得到完整葉綠體基因組序列。結果表明，鼠尾草葉綠體基因組序列全長153 995 bp，呈典型的四段式結構，其中LSC區(qū)長84 573 bp，SSC區(qū)長19 874 bp，兩個IR區(qū)分別長24 774 bp；鼠尾草葉綠體基因組成功注釋13組葉綠體基因，基因的種類、數(shù)目及GC含量等與唇形科中其它物種較為類似。這些研究結果豐富了鼠尾草屬的葉綠體基因組數(shù)據(jù)，為今后鼠尾草屬植物系統(tǒng)發(fā)育關系重建積累了基礎性數(shù)據(jù)。

鼠尾草屬；鼠尾草；葉綠體基因組；基因結構；系統(tǒng)進化

鼠尾草(Salviajaponica)是唇形科(Labiatae)、鼠尾草屬(Salvia)中的一種多年生草本植物，在我國主要分布于橫斷山區(qū)，占鼠尾草屬物種總數(shù)的52.8%，尤其是特有種數(shù)目較多，高達23種[1]。鼠尾草藥材基原為全草，具有清熱利濕、活血調經(jīng)解毒消腫之功效[2]，同時含有三萜、類固醇、酚類化合物等多種代謝產物[3]，其根和葉含有咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等8種水溶性成分，此外根中還含有丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等脂溶性成分[4]。

鼠尾草屬植物因雄蕊形成具活動關節(jié)的杠桿狀結構，與昆蟲或蜂鳥的傳粉行為高度適應，因而它們在唇形科有較為重要的系統(tǒng)地位[5]，并且Bentham[6]還曾利用這一特征將其劃分為四個亞屬，至今這種分類系統(tǒng)仍被廣泛采用。隨著植物分子生物學測序技術和分析手段的迅速發(fā)展，葉綠體基因的psbA-trnH、matK和rbcL等多個片段被廣泛用于鼠尾草屬植物的DNA分子鑒定[7]。然而，先前鼠尾草屬植物系統(tǒng)發(fā)育的分析均是基于葉綠體基因和核基因序列信息，DNA片段長度通常介于300～800 bp，信息位點較少，片段信息常常存在測定序列的分子進化速率與物種水平上的進化速率存在差異，以檢測序列位點的多樣性來代替物種的多樣性，未能真實反映物種間的系統(tǒng)發(fā)育關系[8]；加之，鼠尾草屬種類繁多，種間變異復雜多樣，從而導致對該屬絕大部分物種的界定存在較多不足乃至張冠李戴。當前，隨著高通量測序技術的發(fā)展，葉綠體基因組序列呈現(xiàn)出具有更強分辨率且適用于不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育分析[9～10]，可為藥用植物物種鑒定和混偽品鑒別提供較為準確的方法。鼠尾草屬細胞器基因組數(shù)據(jù)匱乏，進而限制了葉綠體基因組在物種鑒定和進化關系研究中的應用。藥用植物丹參(Salviamiltiorrhiza)是鼠尾草屬第一個獲得完整葉綠體基因組的物種，通過與唇形目(Lamiales)已知葉綠體基因組數(shù)據(jù)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)它與芝麻(Sesamumindicum)親緣關系最近[11]。鼠尾草和丹參均隸屬于鼠尾草屬，是該屬的一個廣布種，并且具有復雜的遺傳多樣性[12]，加之它的物種起源及系統(tǒng)進化等諸多科學問題至今未見報道，尤其是目前鼠尾草葉綠體基因組研究尚屬空白，據(jù)此本文以鼠尾草為研究對象，以丹參葉綠體基因組作為參考，通過對其葉綠體基因組的組裝和分析，探討鼠尾草葉綠體基因組的結構信息，旨在為鼠尾草種質資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)，同時也可為今后鼠尾草屬植物系統(tǒng)進化地位的確立及種質資源的鑒定提供基礎性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 測序材料

鼠尾草種子撒播于室溫大棚，覆膜待出芽培養(yǎng)3個月后，取幼嫩葉片作為提取DNA的材料。DNA的提取參照Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Bioer，杭州)說明書進行。

1.2 測序

將檢測合格后的DNA，隨機打斷成1～2 kB的片段，富集大小一致的片段，連接至建庫載體中構建DNA文庫(DNA文庫制備試劑盒，利用Illumina公司產品)，然后利用Illumina HiSeq 2500基因組測序平臺測序。

1.3 葉綠體基因組的組裝與注釋

測序獲得的raw reads數(shù)據(jù)利用CLC Genomics Workbench 9.0(CLC Bio，Aarhus，Denmark)軟件中Trim過濾去除低質量序列，過濾條件為Ambiguous limit=2、Quality limit=0.05；然后，以先前提交至NCBI的丹參葉綠體基因組(HF586694)作為參照序列，將Trim過濾后的8,877,028 reads用MITObim 1.7重建葉綠體基因組；最終得到由無gap的717 586條葉綠體序列，平均覆蓋702個堿基，長度為157 839 bp的葉綠體基因組，應用Geneious 8.0.3首先進行丹參與鼠尾草序列的CLUSTAL比對，然后進行堿基修正，修改蛋白質和tRNA等注釋，完成鼠尾草葉綠體基因組的分區(qū)，利用OGDraw 1.2(http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/index.shtml)軟件對鼠尾草葉綠體基因組序列進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 鼠尾草葉綠體基因組基本特征

使用Illumina Hiseq平臺對鼠尾草葉綠體DNA提取樣本進行測序，測序數(shù)據(jù)達2.4 G，目前基因組序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號KY646163)。鼠尾草葉綠體基因組序列全長153,995 bp，呈典型的四段式結構(圖1)，其中LSC區(qū)(large single copy region，大的單拷貝區(qū))長84 573 bp，SSC區(qū)(small single copy region，小的單拷貝區(qū))長19 874 bp，兩個IR區(qū)(inverted repeat，反向重復區(qū))分別長24 774 bp(表1)?？傮w看來A+T含量為62%，有明顯的AT偏向性。IR區(qū)的GC含量(43.4%)明顯高于LSC區(qū)(36.2%)和SSC區(qū)(32.0%)，這主要由IR區(qū)包含的四個高GC含量的rRNA基因。

2.2 鼠尾草葉綠體基因組各分區(qū)基因組成

整條葉綠體基因組序列共編碼135個基因，去除重復后為118個，包括89(去除重復83)個蛋白編碼基因、37(去除重復30)個tRNA、8(去除重復4)個rRNA(表2)。6個蛋白編碼基因、7個tRNA基因及4個rRNA基因在兩個IR區(qū)各有一個拷貝。LSC區(qū)包含63個蛋白編碼基因、22個tRNA基因，而SSC區(qū)只含有12個蛋白編碼基因和1個tRNA基因(圖1)。

表1鼠尾草葉綠體基因組堿基組成

Table1BasecompositionofchloroplastgenomeinS.japonica

T(U)(%)C(%)A(%)G(%)長Length(bp)GC(%)LSC32．618．531．217．78457336．2SSC33．916．734．115．31987432．0Ira28．222．628．320．82477443．4Irb28．320．828．322．62477443．4合計Total31．419．330．618．715399538．0CDS31．619．330．418．67828437．9

注：CDS.蛋白編碼區(qū) 下同。

Note:CDS.Protein-coding regions The same as below.

表2鼠尾草葉綠體基因組各分區(qū)的基因組成

Table2GenecompositionofLSC,SSC,IRintheS.japonicachloroplastgenome

基因GeneCDStRNArRNA假基因PseudogeneLSC8563220SSC131210IRa197741psbaIRb19874合計Total135893781psba

2.3 鼠尾草葉綠體基因組中的基因歸類

鼠尾草葉綠體基因組全部基因功能分類如表3所示，它共含有18個基因內含子，其中3個基因(clpP、rpsl2、ycf3)含有2個內含子。rpsl2是一個反式剪接基因，5′端位于LSC區(qū)，3′端在兩個IR區(qū)各有一個拷貝。

圖1 鼠尾草葉綠體基因組環(huán)形基因圖 內側基因順時針；外側基因逆時針轉錄；不同功能的基因以不同顏色表示。Fig.1 Gene map of chloroplast genome in S.japonica Genes drawn inside the circle are transcribed clockwise,and those outsides are counter clockwise.Genes belonging to different functional groups are color-coded.

基因分組Groupofgene基因名稱Genename1光系統(tǒng)ⅠPhotosysteinⅠpsaA，psaB，psaC，pasalI，psalJ2光系統(tǒng)ⅡPhotosystemⅡpsbA，psbB，psbC，psbD，psbE，psbF，psbH，psbl，psbJ，psbK，psbL，psbM，psbN，psbT，psbZ3細胞色素b/f復合體Cytochromeb/fcomplexpetA，petB?，petD?，petG，petL，petN4ATP合酶ATPsynthaseatpA，atpB，atpE，atpF?，atpH，atpI5NADH脫氫酶NADHdehydrogenasendhA?，ndhB(x2)，ndhC，ndhD，ndhE，ndhF，ndhG，ndhH，ndhI，ndhJ，ndhK6二磷酸核酮糖羧化酶大亞基RubisCOlargesubunitrbcL7核糖核酸聚合酶RNApolymeraserpoA，rpoB，rpoC1?，rpoC28核糖體蛋白小亞基Ribosomalproteins(SSU)rps2，rps3，rps4，rps7(x2)，rps8，rps11，rpsl2??(x2)，rpsl4，rps15，rpsl16?，rpsl8，rpsl99核糖體蛋白小亞基Ribosomalproteins(LSU)rpl2?(x2)，rpll4，rpl16?，rpl20，rpl22，rpl23(x2)，rpl32，rpl33，rpl3610其他基因OthergenesclpP??，matK，accD，ccsA，infA，cemA11未知蛋白Proteinsofunknownfunctionycfl，ycf2(x2)，ycf3??，ycf4，ycf15(x2)12轉運RNATransferRNAs37tRNAs(6containanintron，7intheIRs)13核糖體RNARibosomalRNAsrrn4．5(x2)，rrn5(x2)，rrn16(x2)，rrn23(x2)

注：*基因中有1或2個內含子

Note:*gene contains one or two introns.

表4鼠尾草葉綠體基因組內含子基因及外顯子、內含子長度

Table4CharacterizationanalysisofgeneswithintronsinchloroplastgenomeofS.japonica

基因Gene位置Location外顯子Exon(bp)內含子Intron(bp)ⅠⅡⅢⅠⅡatpFLSC411144704clpPLSC22829271612689ndhASSC5395531005ndhBIR756777675petBLSC6642730petDLSC8475708rpU6LSC19542863rpl2IR434391663rpoClLSC1620456755rps12?LSC11426232—539rpsl6LSC3399922trnA?UGCIR3835805trnG?UCCLSC1948688trnl?GAUIR3735948trnK?UUULSC35374390tmL?UAALSC3750483tmV?UACLSC3736593ycf3LSC153228129749699

注：*rps12是一個反式剪接基因；5′端位于LSC區(qū)；3′端位于兩個IR區(qū)

Note:*therps12 is a trans-spliced gene with the 5′ end located in the LSC region and the duplicated 3′ end in the IR regions.

2.4 鼠尾草葉綠體基因組內含子特征分析

52.3%、1.8%、6.0%的基因組序列分別編碼蛋白、tRNA和rRNA基因，其余序列則歸為非編碼序列，包括內含子、基因間區(qū)及假基因。葉綠體基因組中內含子的基因特性如見表4所示，其中trnK-UUU內含子最長，多達4 390 bp，tmL-UAA內含子最短，為483 bp。

2.5 鼠尾草葉綠體基因組密碼子使用情況

分析整個葉綠體基因組的密碼子使用情況后發(fā)現(xiàn)共有2,797(10.6%)個密碼子編碼亮氨酸Leu，是編碼率最髙的氨基酸；而只有292(1.1%)個密碼子編碼半胱氨酸Cys，是編碼率最低的氨基酸(表5)。在所有密碼子中，相對同義密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage,RSCU)最高的為UGG，其次為UAU、GAU，最低的為ATA、CTG和GTG。

3 討論

自地錢(Marchantiapolymorpha)完整葉綠體基因組發(fā)表以來[13]，植物葉綠體基因組的研究得到國外內諸多學者的普遍關注，現(xiàn)成為葉綠體轉化技術和植物親緣關系鑒定的一個重要手段[14～15]。從先前的研究報道看，葉綠體基因組片段和核基因組序列已經(jīng)普遍用于鼠尾草屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關系分析，并取得斐然成績。

表5 鼠尾草葉綠體基因組密碼子使用情況

注：相對同義密碼子使用頻率

Note:Rrelative synonymous codon usage,RSCU

譬如，Will等[16]通過ITS和ETS序列及葉綠體rpl32-trnL片段對非洲鼠尾草屬41個類群系統(tǒng)發(fā)育的分析，認為非洲鼠尾草屬物種并非單系起源(non-monophyletic)；同樣，Walker等[17]利用葉綠體rbcL和trnL-F片段對美洲鼠尾草屬植物的研究，將其劃分為3個獨立的遺傳譜系分支。在中國，李虔全[18]通過ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，認為中國鼠尾草屬植物與日本鼠尾草屬植物具有共同的祖先，新疆鼠尾草(S.deserta)與歐洲引進藥鼠尾草(S.officinalis)具有較近的親緣關系；然而，胡國雄[19]分子系統(tǒng)學的研究結果則表明鼠尾草屬是一個包含了4個獨立分支的多系類群，與Will等[20]的研究結果一致。盡管已有的分子系統(tǒng)學研究結果表明東亞鼠尾草屬為單系類群，但不支持國產鼠尾草屬的分類系統(tǒng)，國產鼠尾草屬的分類系統(tǒng)不能通過合理地調整而與東亞鼠尾草的分子系統(tǒng)學研究結果相吻合，這可能與選取的研究樣本和所選片段有關[19]。鼠尾草是鼠尾草屬的一個廣布種和具有重要經(jīng)濟及藥用價值的物種，同時具有豐富的遺傳多樣性[12]，因而加快對鼠尾草葉綠體基因組的分析，勢必可為今后利用基因遺傳標記、構建葉綠體超級條形碼，揭示亞洲地區(qū)乃至世界范圍內鼠尾草屬的進化歷史提供重要依據(jù)。目前，所有鼠尾草屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析都是基于核基因和葉綠體基因序列片段信息，然而因片段信息常常存在測定序列的分子進化速率與物種水平上的進化速率存在差異，以檢測序列位點的多樣性來代替物種的多樣性，這在一定程度上造成結果的不可靠性，基于基因組水平多態(tài)位點的檢測結果更能真實反映物種系統(tǒng)發(fā)育關系[8]。我們以丹參葉綠體基因組序列作為參考，對鼠尾草葉綠體基因組的研究表明，它的全長為153 995 bp，同多數(shù)已公布的被子植物葉綠體基因組大小范圍一樣[21]，由一對反向重復區(qū)(Inverted repeat,IR)分隔一個大的單拷貝區(qū)(Large single copy region,LSC)和一個小的單拷貝區(qū)(Small single copy region,SSC)，呈典型的四段式結構[6]，鼠尾草葉綠體的GC含量為38.0%，這與先前報道的丹參的研究結果一致[11]。同時，鼠尾草葉綠體基因組大小同丹參葉綠體基因組相似，隸屬于是唇形目中較小的一族，葉綠體基因組大小的差異主要是因為LSC區(qū)的長度變異較大而導致的[11]。葉綠體基因組在基因組成及排列順序上具有高度保守性，根據(jù)功能可將葉綠體基因分為三大類[22]，第一類與轉錄、轉譯有關；第二類與光合作用系統(tǒng)有關；第三類是與氨基酸、脂肪酸、色素等其它生物合成相關，鼠尾草基因組成與之類似。通常，葉綠體基因組中往往具有假基因現(xiàn)象，本研究所測的鼠尾草葉綠體基因組也不例外，同樣存在一些未知功能的基因，如ycf1基因，先前研究認為IRb/SSC邊界往往可以擴張到y(tǒng)cf1基因中，從而導致ycf1假基因的發(fā)生[23～25]。此外，先前研究還發(fā)現(xiàn)，香豌豆屬(Lathyrus)[26]和棉屬(Gossypium)[27]植物的IR區(qū)都存在結構的變異，在進化過程中IR區(qū)部分的基因存在著丟失或萎縮現(xiàn)象，這些均有可能導致基因序列的變異，并極有可能致使物種進化事件的發(fā)生，因而我們推測它們很可能是鼠尾草葉綠體基因組中假基因產生的另一個重要原因之一?？傊狙芯坷枚鷾y序技術對鼠尾草的葉綠體基因組進行測序，并組裝得到完整的葉綠體基因組序列，是繼丹參后第二個鼠尾草屬植物葉綠體基因組的建成，不僅可為今后鼠尾草種質資源的綜合評價奠定了基礎，而且也豐富了鼠尾草屬的葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫，為種質資源的合理開發(fā)利用提供基礎性數(shù)據(jù)。

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Under the auspices of the National Natural Science Foundation of China(32170338);The Key Project of Natural Science Foundation of Shaanxi Preschool Normal College(2015ZDKJ005)

introduction：HE Yi-Han(1987—),female,Ph.D Candidates,engaged in research of medicinal plant secondary metabolic and molecular regulation.

date:2017-03-06

CompleteSequenceAnalysisofChloroplastGenomeofSalviajaponica

HE Yi-Han1,2HAN Li-Min3LIU Yu-Ping3TIAN Na3SU Xu2WANG Zhe-Zhi1*

(1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry,National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China,College of Life Sciences,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119；2.College of Geography and Life Science,Qinghai Normal University,Xining 810008；3.College of Life Sciences and Food Engineering,Shaanxi Xueqian Normal University,Xi’an 710061)

Salviajaponicais a perennial herb of the genusSalvia(Lamiaceae), which is of great medicinal and economic value. The chloroplast genome ofS.japonicawas sequenced using Illumina Hiseq platform. The complete chloroplast genome sequence was obtained bySalviamiltiorrhizachloroplast genome as a reference. The full-length chloroplast genome ofS.japonicawas 153 995 bp. The LSC was 84 573 bp and 19 874 bp in SSC, and the length of IR region was 24 774 bp. The chloroplast genome ofS.japonicasuccessfully annotated 13 groups of genes. The gene types, number and GC content were similar with other species of Lamiaceae. These results enrich the chloroplast data and also provide some valuable molecular data for reconstructing evolutionary history ofSalvia.

Salvia;Salviajaponica;Chloroplast genome;gene structure;phylogenetics and evolution

國家自然科學基金項目(32170338)資助；陜西學前師范學院自然科學基金重點項目(2015ZDKJ005)資助

何懿菡(1987—)，女，博士研究生，主要研究方向為藥用植物次生代謝及分子調控。

* 通信作者：E-mail:zhezhiwang@outlook.com

2017-03-06

* Corresponding author：E-mail:zhezhiwang@outlook.com

Q949.777.6

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.013