趙寒梅 袁德成 楊逢建

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

響應面優(yōu)化塔拉種子多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究

趙寒梅 袁德成 楊逢建*

(東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

為獲得塔拉多糖超聲波提取的最佳工藝，利用中心組合實驗設計原理，采用四因素三水平的響應面分析法，獲得多元二次線性回歸方程，以多糖提取率為響應值做響應面。并考察塔拉多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：塔拉多糖的最佳提取工藝條件為，超聲輔助提取超聲功率363 W，超聲溫度56℃，超聲時間23 min，料液比1∶17(g·mL-1)，塔拉粗多糖的最大提取率(25.56%)與理論推測值(25.71%)相差較小。經(jīng)純化后塔拉多糖提取率為17.82%。以VC為陽性對照，對不同純度的塔拉多糖進行抗氧化性的研究，發(fā)現(xiàn)其純度越高，對ABTS自由基的清除能力越強。

塔拉多糖；提取；響應面法；抗氧化性

塔拉(Caesalpiniaspinosa)屬豆科(Leguminosae)植物。其豆莢富含沒食子單寧50%～60%(干基計)，是生產(chǎn)醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的重要原料[1]。它的種子即塔拉豆，其重量約占氣干果莢的35%，塔拉豆內(nèi)含一層較厚的內(nèi)胚乳層，又稱塔拉膠，其主要成分為雜多糖，主要作為乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、改性劑及醫(yī)藥佐劑，可廣泛用于紡織、醫(yī)藥、石油，尤其是食品工業(yè)中。是我國作為單寧植物資源從南美洲引種栽培的經(jīng)濟植物。塔拉干果殼經(jīng)粉碎制成的塔拉粉是重要的化工原料，可用于生產(chǎn)塔拉單寧酸、沒食子酸、焦性沒食子酸和抗菌素增效劑等多種化工、醫(yī)藥產(chǎn)品[2]。

目前，在塔拉多糖研究領域，文獻報道相對較少，塔拉多糖的分離純化是研究其理化性質(zhì)、生物活性和化學結(jié)構(gòu)的基礎，多糖的純化是其精制過程中非常重要的一步。本文采用超聲波法輔助提取[3～5]塔拉多糖，相較于熱水浸提和冷漬提取，提取率較高，也對其抗氧化性進行了相關實驗，希望為塔拉多糖的多領域充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

材料及試劑：塔拉豆，石油醚沸點(60～90℃)、無水乙醇、葡萄糖標準品、苯酚、濃硫酸、ABTS、過硫化鉀、VC等均為分析純。

儀器：臺式數(shù)控超聲波、電子天平、多功能粉碎機、電熱鼓風干燥箱、電子天平、冰箱、電熱恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、高速離心機、紫外可見分光光度計。

1.2 塔拉粗多糖的提取

1.2.1 塔拉種子的預處理

塔拉種子經(jīng)55℃烘箱烘干48 h，粉碎過40目篩，再55℃烘干48 h，以1∶14的比例經(jīng)石油醚脫脂，連續(xù)3次，每次24 h，讓脫脂的塔拉粉末自然干燥，然后置于55℃烘箱中備用。

1.2.2 繪制葡萄糖標準曲線

準確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補至2 mL，然后再加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL。搖勻，沸水浴加熱20 min后，在冷水中冷卻至室溫。在490 nm波長處測吸光度。同時用2.0 mL蒸餾水做空白對照。得標準曲線方程：y=14.986x-0.280 31，R2=0.994。

采用苯酚—硫酸法[6～8]，用紫外可見分光光度計測定吸光度，通過所得葡萄糖標準曲線[9～10]計算出多糖的含量，根據(jù)下式計算多糖得率：

多糖得率%=比色皿測定濃度×樣品稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積/試驗樣品質(zhì)量×100

(1)

實驗樣品質(zhì)量式中：比色皿測定的多糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；樣品溶液稀釋倍數(shù)為125；樣品溶液體積為25 mL；實驗樣品質(zhì)量為4.0 g。

1.2.3 多糖提取率

以多糖提取率為指標，用葡萄糖作為標準物，采用苯酚—硫酸法，在490 nm處測吸光度，得回歸方程y=14.986x-0.280 31，R2=0.994，通過回歸方程及測得的吸光度計算多糖得率。

1.2.4 超聲輔助提取塔拉粗多糖

準確稱取塔拉粉末1.0 g，置于50 mL具蓋離心管中，在不同提取功率、提取溫度、提取時間、料液比的條件下進行單次提取實驗，提取完成后在5 000 r·min-1的高速離心機中離心10 min，取上清，以4倍體積的無水乙醇醇沉24 h，再5 000 r·min-1，離心5 min，取上清，棄沉淀，用苯酚—硫酸法測定粗多糖得率，選擇得率較高的3個水平進行優(yōu)化實驗。

1.2.5 響應面優(yōu)化

為了更進一步研究塔拉粗多糖提取過程中諸多因素之間的關系，根據(jù)超聲輔助提取的4組單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理選取超聲功率、超聲溫度、超聲時間、液料比4個因素3個水平應用響應面[11～12]分析方法進行單次工藝參數(shù)的優(yōu)化實驗，最大程度的對塔拉籽粉進行粗多糖提取。

表1塔拉多糖提取實驗因素與水平

Table1Variablesandlevelsinresponsesurfacedesign

因素ElementA提取功率Extractionpower(W)B提取溫度Extractiontemperature(℃)C提取時間Extractiontime(min)D料液比Materialliquidratio(g·mL-1)水平Level-130050151∶10035055201∶15140060251∶20

1.2.6 塔拉多糖對ABTS自由基的清除作用

塔拉多糖可以通過捕捉脂質(zhì)過氧化鏈式反應中產(chǎn)生的ROS，減少脂質(zhì)過氧化反應鏈長度、阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進行，達到對ROS的直接清除作用；通過與產(chǎn)生ROS所必需的金屬離子發(fā)生絡合作用，對ROS起間接清除作用，多糖環(huán)上的OH可與產(chǎn)生OH·等所必需的金屬離子絡合，使其不能產(chǎn)生啟動脂質(zhì)過氧化的OH·或使其不能分解脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂過氧化物，從而抑制ROS的產(chǎn)生；塔拉多糖還可通過提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化的作用。

取30 mg ABTS用7.35 mL蒸餾水溶解，配成濃度為7.4 mmol·L-1的ABTS儲備液。取10 mg K2S2O2用14.3 mL蒸餾水溶解，配成濃度為2.6 mmol·L-1的K2S2O2儲備液。取0.2 mL ABTS儲備液和0.2 mL K2S2O2儲備液混合，室溫條件下避光放置12 h，用蒸餾水稀釋40～50倍，在734 nm處測吸光度為0.7左右，即為ABTS+工作液。

取4 mL ABTS+工作液和1 mL無水乙醇混合均勻，振搖10 s，靜置5 min后在734 nm處測吸光值A0。取4 mL ABTS+工作液和1 mL多糖樣品混合均勻，振搖10 s，靜置5 min后在734 nm處測吸光值A。

純化前和純化后的多糖樣品的質(zhì)量濃度都分別4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1，以VC為陽性對照，測定塔拉多糖對ABTS自由基的清除能力。

Y(%)=[(A0-A)/A0〗×100%

(2)

式中：Y為ABTS自由基清除率(%)；A0為空白樣品的吸光度；A為不同質(zhì)量濃度的被測混合物的吸光度。

50%抑制濃度IC50可通過自由基清除活性—樣品濃度的線性關系求出。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔拉多糖得率回歸模型的建立及顯著性檢驗

按照Box-Behnken試驗方案進行四因素三水平試驗，結(jié)果見表2。將所得的實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件進行多元回歸擬合[13]，得到以多糖得率(Y)為目標。

表2 塔拉多糖Box-Behnken提取試驗設計與結(jié)果

函數(shù)的二次回歸方程：多糖得率對超聲功率A、超聲溫度B、超聲時間C和水料比D的二次多項回歸方程：

Y(%)=25.06+1.97A+0.72B-0.13C-1.02D+2.17AB-3.01AC+1.27AD+1.56BC-1.51BD+2.47CD-4.51A2-4.21B2-2.45C2-2.46D2

(3)

式中的超聲功率A、超聲溫度B、超聲時間C和料液比D在設計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，因此方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標值的影響程度，系數(shù)的正負反映了影響的方向。

表3 方差分析

注：*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)

Note: *significant difference(P<0.05); **extremely significant difference(P<0.01)

2.2 響應面優(yōu)化的交互作用

通過響應面優(yōu)化實驗得到各因素之間交互作用的三維立體圖，提取功率、溫度、時間、料液比的交互作用如圖1所示。

從圖1a可知多糖得率隨超聲溫度和超聲功率的提高呈先上升后下降的趨勢，二者交互作用明顯，溫度越高分子解附和擴散運動速度越快，多糖的析出速度越快，但當溫度過高時多糖分子解構(gòu)，從而得率降低，超聲功率越大對細胞壁及細胞膜的破壞作用越強，隨著溫度的升高，多糖的析出越快，當多糖完全從細胞中溶出后超聲功率越大對多糖的結(jié)構(gòu)的破壞力也隨之越大，從而降低了多糖得率。

從圖1b可知多糖得率隨超聲功率和超聲時間的增大成先上升后下降的趨勢，二者有交互作用，水料比一定時，在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低，主要是因為溫度的升高使得分子解附和擴散運動速度加快，從而提高了多糖的析出速率和得率，水料比的增大，使得多糖的濃度更低，更容易從細胞中溶出。

圖1 塔拉多糖超聲提取的響應曲面圖 a.溫度和功率的交互作用；b.時間和功率的交互作用；c.料液比和溫度的交互作用；d.時間和溫度的交互作用Fig.1 Tarapolysaccharide response surface mapping for ultrasonic extraction a. Temperature and power; b. Time power interaction; c. Material liquid than and temperature interaction; d. Time and temperature interactions

從圖1c可知多糖得率隨料液比和超聲溫度的提高成先上升后下降的趨勢，且二者有明顯的交互作用。水料比一定時，在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低，這主要是因為溫度的升高使得分子解附和擴散運動速度加快，從而提高了多糖的析出速率和得率，而溫度過高可能會影響破壞多糖結(jié)構(gòu)，降低得率。水料比的增大，使得多糖的濃度更低，更容易從細胞中溶出。

從圖1d可知，多糖得率隨超聲時間的延長和溫度的提高呈先上升后下降的趨勢，且二者有明顯的交互作用。根據(jù)提取動力學理論，時間的延長有助于多糖的充分擴散析出，同時溫度的升高使得分子解附和擴散運動速度加快，多糖的析出速率和得率提高，因此適當延長時間和提高溫度有助于提高多糖得率。而溫度過高可能會影響破壞多糖結(jié)構(gòu)，降低得率。

2.3 塔拉多糖最佳提取條件的確定和驗證實驗

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Design Expert軟件分析得出，塔拉多糖最佳提取條件為超聲功率363.94 W、超聲溫度56.27℃、超聲時間23.26 min、料液比1∶16.93，多糖的率的預測值為25.71%，考慮到實際操作會出現(xiàn)誤差影響,確定塔拉多糖的超聲提取條件為超聲功率363 W、超聲溫度56℃、超聲時間23 min、料液比1∶17，結(jié)果塔拉多糖的得率為25.56%，與預測值相差很小說明該方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應曲面法適用于對塔拉多糖的超聲波提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.4 塔拉多糖對ABTS自由基的清除作用

由圖2可以看出，以VC為陽性對照，塔拉多糖對ABTS自由基有較強的清除能力。當提純后的塔拉多糖質(zhì)量濃度0.125 mg·mL-1時，對ABTS自由基的清除率為17.76%，而提純前的僅為12.11%，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對ABTS自由基的清除作用增加，當多糖質(zhì)量濃度在0.125～4 mg·mL-1范圍內(nèi)增加時，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應[14～15]，當提純后塔拉多糖質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時，對ABTS自由基的清除率達到96.98%，而提純前的僅為52.09%。同時，塔拉多糖對ABTS自由基清除能力IC50為3.25 mg·mL-1。由此可見，塔拉多糖可以做抗氧化劑，且多糖純度越高，對ABTS自由基的清除作用越顯著[16～17]。

圖2 塔拉多糖對ABTS自由基的清除作用Fig.2 Tara polysaccharide scavenging effect on ABTSfree radical

3 結(jié)論

利用軟件Design Expert進行試驗設計，采用響應曲面法建立塔拉多糖提取工藝條件的二次多項式數(shù)學模型，對各因素對響應值的影響進行分析。結(jié)果表明，模型擬合程度高，實驗誤差小，最佳的提取工藝條件為超聲功率363 W，超聲溫度56℃，超聲時間23 min，料液比1∶17(g·mL-1)，此工藝條件的多糖得率為25.56%，與預測值相差較小。經(jīng)純化后塔拉多糖提取率為17.82%，純度為69.72%。以VC為陽性對照，對不同純度的塔拉多糖進行抗氧化性的研究，發(fā)現(xiàn)其純度越高，對ABTS自由基的清除能力越強。因此，塔拉多糖作為一種天然的具有抗氧化活性的物質(zhì)，可進一步開發(fā)為天然無副作用的保健品、藥物，還可廣泛用于紡織、醫(yī)藥、石油，尤其是食品工業(yè)中。

1.馬文秀,羅慶云,尚征賢,等.塔拉豆多糖研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),1999,19(4):29-34.

Ma W X,Luo Q Y,Shang Z X,et al.Study on polysaccharide in Tara seed[J].Chemistry and Industry of Forest Products,1999,19(4):29-34.

2.張建云,李志國,夏定久,等.塔拉單寧和塔拉多糖研究現(xiàn)狀[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,22(1):183-188.

Zhang J Y,Li Z G,Xia D J,et al.Investigating actuality and the vista of Tara tannin and Tara polysaccharide[J].Natural ProductResearch and Development,2009,22(1):183-188.

3.翟旭峰,胡明華,馮夢瑩,等.超聲提取靈芝多糖的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(12):1704-1708,1773.

Zhai X F,Hu M H,Feng M Y,et al.Optimization of ultrasonic extraction ofGanodermalucidumpolysaccharides by response surface methodology[J].Modern Food Science and Technology,2012,28(12):1704-1708,1773.

4.何先元,許晉芳,王秋霜,等.當歸多糖的超聲提取及含量測定[J].中國藥業(yè),2010,19(19):34-35.

He X Y,Xu J F,Wang Q S,et al.Ultrasonic extraction and determination of polysaccharide in radixAngelicasinensis[J].China Pharmaceuticals,2010,19(19):34-35.

5.孟憲軍,李冬男,汪艷群,等.五味子多糖超聲波提取條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(4):313-315,319.

Meng X J,Li D N,Wang Y Q,et al.Study on ultrasound-assisted extraction polysaccharides fromSchisandrachinensisTurcz. Bail[J].Science and Technology of Food Industry,2010,31(4):313-315,319.

6.鐘巖,潘浦群,王艷紅,等.苯酚—硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(8):1957-1958.

Zhong Y,Pan P Q,Wang Y H,et al.Determination of the content of polysaccharides in fresh root ofPanaxginsengby the method of phenol vitril[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2008,19(8):1957-1958.

7.邸明磊,單曉菊,馬麗娜,等.苯酚—硫酸法測定苦豆子多糖含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2012,26(1):59-61.

Di M L,Shan X J,Ma L N,et al.Determination of polysaccharides inSophoraalopecuroidesL.by the method of phenol-vitriol[J].Research and Practice on Chinese Medicines,2012,26(1):59-61.

8.胡聰聰,楊永芳,丁國芳,等.青蛤多糖提取的條件優(yōu)化及其抗腫瘤活性研究[J].中國民族民間醫(yī)藥,2010,19(10):28-29.

Hu C C,Yang Y F,Ding G F,et al.The extraction conditions of polysaccharides of Cyclina sinensis optimization and antitumor activity of[J].Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy,2010,19(10):28-29.

9.謝建華,申明月,劉昕,等.苦瓜中多糖含量測定方法的研究[J].中國食品添加劑,2009(6):209-213.

Xie J H,Shen M Y,Liu X,et al.Study on the determination method of polysaccharide content inMomordicacharantiaL.[J].China Food Additives,2009(6):209-213.

10.孟凡欣,蔣朝軍,于笑坤,等.刺五加多糖的提取及含量測定[J].食品工業(yè)科技,2005,26(7):110-112.

Meng F X,Jiang Z J,Yu X K,et al.Extraction of polysaccharides fromAcanthopanaxsenticosusand determination of polysaccharides content[J].Science and Technology of Food Industry,2005,26(7):110-112.

11.Palanivel R,Mathews P K.Prediction and optimization of process parameter of friction stir welded AA5083-H111 aluminum alloy using response surface methodology[J].Journal of Central South University,2012,19(1):1-8.

12.Bai G C,Fei C W.Distributed collaborative response surface method for mechanical dynamic assembly reliability design[J].Chinese Journal of Mechanical Engineering,2013,26(6):1160-1168.

13.蔣水星,陳雪峰,趙天殊.響應面法優(yōu)化大棗多糖的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(6):3652-3654.

Jiang S X,Chen X F,Zhao T S.Study of optimization of extraction technology of jujube polysaccharides by response surface methodology[J].Journal ofAnhui Agricultural Sciences,2011,39(6):3652-3654.

14.Yang L,Huang J D.Study on antioxidant characteristic of microencapsulated anthocyanins fromBerberiskaschgaricaRupr.[J].Medicinal Plant,2010,1(12):51-53,57.

15.Nassourou M A,Njintang Y N,Noubissiét J B,et al.Genetics of seed flavonoid content and antioxidant activity in cowpea(VignaunguiculataL.Walp.)[J].The Crop Journal,2016,4(5):391-397.

16.孟慶煥,王化,王洪政,等.牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J].植物研究,2013,33(4):504-507.

Meng Q H,Wang H,Wang H Z,et al.Extraction of total flavonoids from peony episperm and ABTS radical scavenging activity[J].Bulletin of Botanical Research,2013,33(4):504-507.

17.白海娜,王振宇,劉瑞海,等.白藜蘆醇與黑木耳多糖協(xié)同清除ABTS自由基活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(3):64-68.

Bai H N,Wang Z Y,Liu R H,et al.Synergistic ABTS radical scavenging activity of resveratrol withAuriculariaauricularpolysaccharides[J].Modern Food Science and Technology,2014,30(3):64-68.

Forestry Public Welfare Industry Research Special(201404616)

introduction：ZHAO Han-Mei(1992—),female,graduate student,Study on plant resources.

date:2017-02-05

OptimizationofUltrasonicExtractionofPolysaccharidesfromTaraSeedandItsAntioxidantActivity

ZHAO Han-Mei YUAN De-Cheng YANG Feng-Jian*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

For the optimum ultrasonic extraction of Tara polysaccharide,a multiple quadratic regression was stablished using a 4-factor, 3-level Box-Behnken statistical design, and the response surface with the extraction rate of polysaccharides as the response were drawn. The antioxidant activities of Tara polysaccharide invitrowere tested. Theoptimumextractionconditions of Tara polysaccharide were: ultrasonic treatment at 56℃ for 23 min with ultrasonic power 363 W, and material to liquid ratio of 1∶17 g·mL-1. The maximum extraction rate of Tara crude polysaccharides was 25.56%, less than the theoretical deduced value of 25.71%.The purified Tara polysaccharide extraction rate was 17.82%.Using VC as a positive control, the antioxidant activity of different purity Tara polysaccharide was measured, and it was found that its purity was high, and the ABTS radical scavenging ability was stronger.

Tara polysaccharide；extraction；response surface analysis methodology(RSM)；antioxidant activity

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404616)

趙寒梅(1992—)，女，碩士研究生，主要從事植物資源學的研究。

* 通信作者：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

2017-02-05

* Corresponding author：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

Q949.751.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.021