楊 玲 劉虹男 張冬嚴(yán) 魏 騁 沈海龍

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚發(fā)生的影響

楊 玲 劉虹男 張冬嚴(yán) 魏 騁 沈海龍*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

以水曲柳成熟合子胚子葉為材料誘導(dǎo)體胚發(fā)生，通過(guò)改變誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)及濃度，分析二者對(duì)水曲柳體胚發(fā)生的影響。研究結(jié)果表明：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在水曲柳體胚發(fā)生過(guò)程中是必不可少的因素；高滲透壓有利于體胚誘導(dǎo)：在添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的條件下，添加75 g·L-1的蔗糖可提高體胚誘導(dǎo)率；通過(guò)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加100 g·L-1蔗糖產(chǎn)生的體胚在含有BA的分化培養(yǎng)基上分化率更高。研究結(jié)果為提高水曲柳體胚誘導(dǎo)率、改善體胚發(fā)生狀況和優(yōu)化體胚發(fā)生體系奠定了基礎(chǔ)。

水曲柳；體胚發(fā)生；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；滲透調(diào)節(jié)

水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr.)屬木犀科(Oleaceae )白蠟樹(shù)屬(Fraxinus)樹(shù)種，是我國(guó)重要的珍貴闊葉樹(shù)種，是寒溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)中最重要的構(gòu)成部分[1～2]。其分布范圍廣泛，在中國(guó)東北，朝鮮，日本和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)均有分布[3～4]。其材質(zhì)優(yōu)良，強(qiáng)度適中，紋理美觀(guān)，木材利用價(jià)值和園林應(yīng)用價(jià)值極高[5]。然而，水曲柳資源較為缺乏，加之不合理采伐和利用，已被列為我國(guó)瀕危樹(shù)種，迫切需要保護(hù)[6～7]。水曲柳以種子繁殖為主，但種子具有休眠的特性[8]，需要經(jīng)過(guò)240～270 d的層積處理，才能打破休眠?，F(xiàn)在，傳統(tǒng)的繁殖方法雖有所改善但并未取得突破性的進(jìn)展，通過(guò)離體無(wú)性繁殖與生物技術(shù)相結(jié)合可以大大縮短育種時(shí)間[5]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生(以下簡(jiǎn)稱(chēng)體胚發(fā)生)是離體培養(yǎng)條件下植物體細(xì)胞的一個(gè)基本發(fā)育途徑[9]。其作為研究植物胚胎發(fā)育過(guò)程中形態(tài)發(fā)生、生理生化及分子生物學(xué)變化的良好替代體系[2,10～11]，因其具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生頻率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[12]。

目前，以水曲柳幼胚[3]和成熟胚[4]為外植體通過(guò)體胚發(fā)生途徑誘導(dǎo)植株再生的培養(yǎng)體系已經(jīng)建立，但對(duì)水曲柳體細(xì)胞胚性獲得的機(jī)理尚不明確。前期研究中發(fā)現(xiàn)，水曲柳體胚多數(shù)發(fā)生在褐化的外植體上[4]，同時(shí)在高糖誘導(dǎo)的水曲柳體胚發(fā)生中檢測(cè)到了過(guò)氧化氫(H2O2)的顯著釋放，推測(cè)與體胚誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基中較高滲透壓產(chǎn)生滲透脅迫并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧積累有關(guān)。為了解生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基滲透壓在水曲柳體胚誘導(dǎo)和分化階段的確切作用，本文以水曲柳成熟胚的單片子葉為外植體，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，分析生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚發(fā)生的影響。研究結(jié)果為提高水曲柳體胚誘導(dǎo)率、改善水曲柳體胚發(fā)生狀況和優(yōu)化水曲柳體胚發(fā)生系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水曲柳成熟合子胚采自東北林業(yè)大學(xué)(哈爾濱市，中國(guó))校園內(nèi)10株生長(zhǎng)健壯的60 a生的母樹(shù)，于2015年10月中旬收集具有褐色果皮的成熟翅果備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

外植體處理方法參考Yang等的方法，采集到的種子混勻去翅后在流水下沖洗2 d，然后在75%(v/v)乙醇溶液中浸泡攪拌30 s，隨后在5%(v/v)次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，最后在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌蒸餾水沖洗5次。將消毒處理后的成熟種子擠出完整合子胚，切下單片子葉，將其近軸端接觸培養(yǎng)基表面放置。

1.2.2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)的影響

(1)培養(yǎng)基中添加NAA和BA時(shí)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用分析

(2)培養(yǎng)基中無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用分析

1.2.3生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚分化的影響

將上述方法(1)中所有處理的培養(yǎng)60 d的材料分別分成3份，分別繼代到含有不同生長(zhǎng)調(diào)劑的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。共3個(gè)處理，處理Ⅰ(對(duì)照)：不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；處理Ⅱ：添加5.0 mg·L-1NAA；處理Ⅲ：添加2.0 mg·L-1BA。培養(yǎng)基其余成分和制備方法同方法(1)，每個(gè)處理接種5個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種10個(gè)培養(yǎng)物。培養(yǎng)條件同方法(1)。培養(yǎng)60 d后觀(guān)察統(tǒng)計(jì)體胚發(fā)生數(shù)量和體胚分化率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用體視解剖鏡(OLYMPUS SZX7)進(jìn)行胚胎發(fā)育時(shí)期鑒定，拍照使用Moticam 3000C系統(tǒng)。采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯多重比較以及雙因素方差分析，平均數(shù)在P=0.05水平或P=0.01水平上進(jìn)行鄧肯多重比較，百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。使用Origin 8.0軟件進(jìn)行制圖，圖表中數(shù)據(jù)均為平均值，“±”之后為標(biāo)準(zhǔn)差。主要計(jì)算公式如下：

體胚誘導(dǎo)率(%)=有體胚發(fā)生的外植體數(shù)×100/接種的外植體數(shù)量

(1)

體胚分化率(%)=有體胚分化的培養(yǎng)物數(shù)量×100/繼代的培養(yǎng)物數(shù)量

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)的影響

2.1.1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)體胚誘導(dǎo)率的影響

不同滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)蔗糖和(或)甘露醇處理下，培養(yǎng)時(shí)間與濃度對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率影響均達(dá)到差異極顯著(P<0.01)(表1)。甘露醇處理下，培養(yǎng)時(shí)間與濃度的交互作用對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的影響均達(dá)到差異極顯著(P<0.01)；但蔗糖處理下，培養(yǎng)時(shí)間與濃度的交互作用對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的影響差異不顯著(P>0.05)。多重比較結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加不同濃度甘露醇和(或)蔗糖對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的影響差異顯著(誘導(dǎo)培養(yǎng)45 d時(shí)達(dá)到顯著水平，P<0.05；培養(yǎng)60 d時(shí)達(dá)到極顯著水平，P<0.01)。誘導(dǎo)培養(yǎng)45 d時(shí)(圖1:a,c)，75 g·L-1蔗糖濃度下的體胚誘導(dǎo)率達(dá)到最大(50.33%)(圖2)；25 g·L-1甘露醇濃度下的體胚誘導(dǎo)率達(dá)到最大(20.00%)，比75 g·L-1蔗糖濃度下的體胚誘導(dǎo)率低60.26%(圖3)。誘導(dǎo)培養(yǎng)60 d時(shí)(圖1:b，d)，100 g·L-1蔗糖濃度下的體胚誘導(dǎo)率達(dá)到最大(72.44%)，其發(fā)生在褐化子葉上的體胚誘導(dǎo)率達(dá)最大(67.11%)，占體胚誘導(dǎo)率的92.64%；85 g·L-1甘露醇濃度下的體胚誘導(dǎo)率達(dá)到最大(67.33%)，比75 g·L-1蔗糖濃度下的體胚誘導(dǎo)率低7.05%，其中發(fā)生在褐化子葉上的體胚誘導(dǎo)率最大(56.00%)，占體胚誘導(dǎo)率的83.17%。說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，體胚主要產(chǎn)生在褐化的外植體上，較高滲透壓促進(jìn)了外植體的褐化和體胚發(fā)生。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑存在的條件下，添加不同濃度的蔗糖和(或)甘露醇均可以誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生體胚。而在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑存在的條件下，沒(méi)有體胚產(chǎn)生。說(shuō)明生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是水曲柳體胚誘導(dǎo)過(guò)程中所必需的。

表1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的方差分析

Table1VarianceanalysisofosmoregulationsubstancesonsomaticembryogenesispercentageofF.mandshurica

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Osmoregulationsubstances源Variations平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareSig．蔗糖Sucrose誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime2313．88112313．8810濃度Concentration2718．044679．510誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間×濃度Culturetime×Concentration403．5884100．8970．216誤差Error1270．3422063．517總計(jì)Total47435．4230甘露醇Mannitol誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime4845．05214845．0520濃度Concentration1167．9864291．9960誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間×濃度Culturetime×Concentration590．654147．6630．009誤差Error643．2082032．16總計(jì)Total38722．20230

圖1 水曲柳成熟合子胚的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng) a.培養(yǎng)45 d時(shí)以蔗糖為滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上的體胚；b.培養(yǎng)60 d時(shí)以蔗糖為滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上的體胚；c.培養(yǎng)45 d時(shí)以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上的體胚；d.培養(yǎng)60 d時(shí)以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上的體胚Fig.1 Somatic embryogenesis from zygotic embryo of F.mandshurica on induction medium a. Somatic embryogenesis on culture medium with sucrose as osmotic stress regulator after 45 d; b. Somatic embryogenesis on culture medium with sucrose as osmotic stress regulator after 60 d; c. Somatic embryogenesis on culture medium with mannitol as osmotic stress regulator after 45 d; d. Somatic embryogenesis on culture medium with mannitol as osmotic stress regulator after 60 d

圖2 不同濃度蔗糖對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的影響 字母表示方差分析和鄧肯多重比較結(jié)果，不同大寫(xiě)字母表示在P=0.01水平上差異極顯著； 不同小寫(xiě)字母表示在P=0.05水平上差異顯著，相同字母表示在P=0.05水平上差異不顯著，下同。Fig.2 Effects of sucrose concentrations on somatic embryogenesis percentage of F.mandshurica Different letter indicate that the values are significantly different from each other at P=0.05 and P=0.01 with capital letters and the same letters aren’t significantly from each other at P=0.05 using Duncan’s Multiple Range Test.The same as below.

圖3 不同濃度甘露醇對(duì)水曲柳體胚誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of mannitol concentrations on somatic embryogenesis percentage of F.mandshurica

2.1.2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)平均體胚發(fā)生數(shù)量的影響

培養(yǎng)時(shí)間和蔗糖濃度對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量的影響達(dá)到極顯著差異(P<0.01)，且二者交互作用對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量影響差異顯著(P<0.05)；甘露醇處理下， 甘露醇濃度對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量的影響不顯著(P>0.05)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量有極顯著影響(P<0.01)，培養(yǎng)時(shí)間和甘露醇濃度的交互作用對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)(表2)。培養(yǎng)45和60 d時(shí)，不同濃度蔗糖對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量的影響均差異極顯著(P<0.01)。誘導(dǎo)培養(yǎng)45 d時(shí)，當(dāng)蔗糖濃度為125 g·L-1時(shí)，平均體胚發(fā)生數(shù)量達(dá)到最大(每外植體13個(gè))，比85 g·L-1甘露醇處理的平均體胚發(fā)生數(shù)量(每外植體9個(gè))高出53.00%。誘導(dǎo)培養(yǎng)60 d時(shí)，100 g·L-1蔗糖濃度處理的平均體胚發(fā)生數(shù)量最高(每外植體13個(gè))，比110 g·L-1甘露醇處理(每外植體11個(gè))高出20.50%。此外，隨培養(yǎng)基中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的增加，體胚發(fā)育進(jìn)程也隨之加快，較高滲透壓條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)60 d時(shí)外植體上已有子葉形體胚出現(xiàn)(表3～4)。

表2滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量的方差分析

Table2VarianceanalysisofosmoregulationsubstancesonsomaticembryogenesisnumberofF.mandshurica

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Osmoregulationsubstances源Variations平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareSig．蔗糖Sucrose誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime70．717170．7170．001濃度Concentration201．378450．3440誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間×濃度Culturetime×Concentration65．854416．4630．017誤差Error85．091204．255總計(jì)Total2761．04830甘露醇Mannitol誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime92．647192．6470．001濃度Concentration31．88247．9710．299誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間×濃度Culturetime×Concentration71．424417．8560．046誤差Error121．251206．063總計(jì)Total2106．08230

表3蔗糖濃度對(duì)水曲柳體胚發(fā)生數(shù)量的影響

Table3EffectsofsucroseconcentrationsonsomaticembryogenesisnumberofF.mandshurica

誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime(d)蔗糖濃度Concentrationofsucrose(g·L-1)體胚發(fā)生情況SituationofSSEs體胚數(shù)量SEinduction(ind．)單個(gè)外植體上的體胚數(shù)SSEs/explant(ind．)體胚發(fā)生階段SEstage45253．06±2．68C1～14球形Globular504．64±1．12BC1～14球形Globular757．15±1．59BC1～26球形、心形Globular，Heart?shaped1008．65±3．00B1～40球形、心形、魚(yú)雷形Globular，Heart?shaped，Torpedo12512．96±2．59A2～26球形、心形、魚(yú)雷形Globular，Heart?shaped，Torpedo60256．06±0．80B1～41球形Globular509．94±1．53A1～45球形Globular7512．42±2．10A1～54球形、心形、魚(yú)雷形Globular，Heart?shaped，Torpedo10013．05±2．71A1～39球形、心形、魚(yú)雷形、子葉形Globular，Heart?shaped，Torpedo，Cotyledonary12510．35±1．07A1～38球形、心形、魚(yú)雷形、子葉形Globular，Heart?shaped，Torpedo，Cotyledonary

表4甘露醇濃度對(duì)水曲柳體胚發(fā)生數(shù)量的影響

Table4EffectsofmannitolconcentrationsonsomaticembryogenesisnumberofF.mandshurica

誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間Culturetime(d)甘露醇濃度Concentrationofmannitol(g·L-1)體胚發(fā)生情況SituationofSSEs體胚數(shù)量SEinduction(ind．)單個(gè)外植體上的體胚數(shù)SSEs/explant(ind．)體胚發(fā)生階段SEstage45257．84±2．822～23球形、心形Globular，Heart?shaped557．14±2．582～19球形、心形Globular，Heart?shaped858．47±3．821～32球形Globular1103．00±3．001～10球形、心形Globular，Heart?shaped1353．38±2．291～11球形、心形Globular，Heart?shaped60258．31±0．591～36球形、心形、魚(yú)雷形、子葉形Globular，Heart?shaped，Torpedo，Cotyledonary557．71±2．271～33球形、魚(yú)雷形Globular，Torpedo8510．61±0．541～43魚(yú)雷形Torpedo11010．83±1．971～34球形、心形、魚(yú)雷形Globular，Heart?shaped，Torpedo1359．92±2．741～31球形、子葉形Globular，Cotyledonary

2.2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水曲柳體胚分化的影響

經(jīng)過(guò)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的體胚在不同分化培養(yǎng)基上的體胚分化率不同(圖4～6)。經(jīng)過(guò)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加100 g·L-1蔗糖誘導(dǎo)出的體胚在含有BA的分化培養(yǎng)基上分化率最高(71.67%)。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加125或75 g·L-1蔗糖誘導(dǎo)出的體胚在不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基中分化率均可達(dá)70.00%。

在3種分化培養(yǎng)基上的平均體胚數(shù)量隨著前期誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖濃度的增加而增加(表5)。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為125 g·L-1時(shí)，均可獲得較高的體胚發(fā)生數(shù)量，其中對(duì)照組平均體胚發(fā)生數(shù)量最高(每外植體11個(gè))，其次是添加BA處理(每外植體9個(gè))，最后是添加NAA處理(每外植體8個(gè))。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中甘露醇濃度為110 g·L-1時(shí)，含有NAA的分化培養(yǎng)基中平均體胚數(shù)量最多(每外植體10個(gè))，顯著高于對(duì)照和BA處理(P<0.05)。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)蔗糖(或甘露醇)濃度和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)水曲柳體胚分化率和平均體胚分化數(shù)量的影響均差異不顯著(P>0.05)，并且二者不存在顯著交互作用(P>0.05)。說(shuō)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)蔗糖(或甘露醇)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)水曲柳體胚分化的影響不顯著(表6～7)。

圖4 培養(yǎng)60 d時(shí)分化培養(yǎng)基上不同來(lái)源水曲柳體胚分化率Fig.4 Differentiationrate of SSEs with different sources on proliferation medium of F.mandshurica after 60 d culture

圖5 培養(yǎng)60 d時(shí)分化培養(yǎng)基上不同來(lái)源水曲柳體胚分化率Fig.5 Differentiation rate of SSEs with different mannitol on proliferation medium of F.mandshurica after 60 d culture

圖6 水曲柳成熟合子胚的體胚分化培養(yǎng) a.在含有NAA的分化培養(yǎng)基上的子葉期體胚；b.在含有BA分化培養(yǎng)基上的子葉期體胚；c.不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基上的子葉期體胚Fig.6 Somatic embryogenesis from zygotic embryo of F.mandshurica on proliferation medium a. The SSEs of cotyledon stage on proliferation medium with NAA; b. The SSEs of cotyledon stage on proliferation medium with BA; c. The SSEs of cotyledon stage on proliferation medium with free-PGRs

表5生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)分化培養(yǎng)中水曲柳體胚數(shù)量的影響

Table5EffectsofosmoregulationsubstancesandPGRsofsomaticembryogenesisnumberonproliferationmediumofF.mandshurica

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Osmoregulationsubstances種類(lèi)Type濃度Concentration(g·L-1)分化培養(yǎng)方法Culturemethod體胚發(fā)生數(shù)量SSEsformation(ind．)平均體胚發(fā)生數(shù)量AverageofSSEsinduction(ind．)單個(gè)外植體上的體胚數(shù)SSEs/explant(ind．)蔗糖Sucrose75100125無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑Free?PGRs6．99±1．167．16±2．1010．98±0．492～172～183～1775100125添加NAAAdditionofNAA4．57±0．477．11±2．198．32±2．631～151～181～2275100125添加BAAdditionofBA6．77±1．708．34±0．769．28±1．701～222～193～23甘露醇Mannitol85110135無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑Free?PGRs7．14±0．907．03±1．08b7．56±3．212～183～171～3285110135添加NAAAdditionofNAA6．65±1．769．88±0．18a5．09±1．531～181～221～1285110135添加BAAdditionofBA7．38±2．317．12±1．03b6．40±1．532～193～231～17

3 討論

體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的一個(gè)重要前提是這些細(xì)胞必須脫離整體的束縛[13]。僅離體培養(yǎng)并非是胚性細(xì)胞發(fā)生的充分條件，因?yàn)檫@一轉(zhuǎn)化過(guò)程是在相應(yīng)誘導(dǎo)因子的作用下基因差別表達(dá)的結(jié)果。誘導(dǎo)植物體胚發(fā)生是一個(gè)多因素事件，其發(fā)生機(jī)理的研究也是多層次多方面的。到目前為止，還沒(méi)有統(tǒng)一的誘導(dǎo)各種植物體胚發(fā)生模式[14]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和滲透脅迫等脅迫因子對(duì)植物體胚發(fā)生和胚性細(xì)胞感受態(tài)的獲得起著重要作用[14]。

表6滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)分化培養(yǎng)中水曲柳分化率的方差分析

Table6VarianceanalysisofosmoregulationsubstancesofdifferentiationrateofSSEsonproliferationmediumofF.mandshurica

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Osmoregulationsubstances源Variations平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareSig．蔗糖Sucrose分化培養(yǎng)方法Culturemethod189．694294．8470．587濃度Concentration608．4622304．2310．2分化培養(yǎng)方法×濃度Culturemethod×Concentration434．1744108．5430．648誤差Error3106．98218172．61總計(jì)Total68597．2127甘露醇Mannitol分化培養(yǎng)方法Culturemethod295．3192147．6590．382濃度Concentration252．6662126．3330．436分化培養(yǎng)方法×濃度Culturemethod×Concentration996．0134249．0030．191誤差Error2614．66218145．259總計(jì)Total61510．7527

表7滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)分化培養(yǎng)中水曲柳平均體胚發(fā)生數(shù)量的方差分析

Table7VarianceanalysisofosmoregulationsubstancesofsomaticembryogenesisnumberonproliferationmediumofF.mandshurica

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Osmoregulationsubstances源Variations平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareSig．蔗糖Sucrose分化培養(yǎng)方法Culturemethod9．74924．8750．384濃度Concentration29．841214．920．07分化培養(yǎng)方法×濃度Culturemethod×Concentration5．56241．390．882誤差Error86．964184．831總計(jì)Total1627．85327甘露醇Mannitol分化培養(yǎng)方法Culturemethod0．40320．2010．938濃度Concentration11．47525．7370．189分化培養(yǎng)方法×濃度Culturemethod×Concentration21．26545．3160．195誤差Error52．908173．112總計(jì)Total1369．62826

糖類(lèi)對(duì)誘導(dǎo)植物體胚發(fā)生是不可缺少的重要成分，其作用主要有兩個(gè)：一是作為碳源，二是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)滲透壓[15]。細(xì)胞是通過(guò)培養(yǎng)基的滲透壓來(lái)吸取營(yíng)養(yǎng)的，只有培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基之間處于等滲或略低于培養(yǎng)基的滲透壓時(shí)，培養(yǎng)材料才有可能從培養(yǎng)基汲取養(yǎng)分和水分，常用的脅迫劑主要有蔗糖、甘露醇、聚乙二醇(PEG)、NaCl等。通常脅迫劑的類(lèi)型和濃度影響體胚形成。在植物組織培養(yǎng)中，蔗糖是最常用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑。有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加多種碳源可以提高體胚誘導(dǎo)率[16]。在美國(guó)白松(Pinusstrobus)成熟體胚的研究中發(fā)現(xiàn)，提高蔗糖濃度，或者添加蔗糖的同時(shí)用甘露醇或山梨糖醇替代部分蔗糖，更有利于體胚形成[17]。這與本研究的研究結(jié)果相似。在維持25 g·L-1的蔗糖濃度基礎(chǔ)上添加85 g·L-1甘露醇使得外植體的體胚發(fā)生能力增強(qiáng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)水曲柳體胚發(fā)生的蔗糖濃度為100 g·L-1，體胚誘導(dǎo)率達(dá)72.44%，比Yang等2013研究中，篩選出的最佳蔗糖濃度為75 g·L-1，所獲得的最高體胚誘導(dǎo)率(67.50%)高7.31%。因此認(rèn)為，水曲柳體胚誘導(dǎo)的適宜蔗糖濃度還可以略微提高，如使用100 g·L-1，但從經(jīng)濟(jì)效益考慮，可選用75 g·L-1。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是體胚發(fā)生過(guò)程中最重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)[18]。體胚發(fā)生過(guò)程通常分為誘導(dǎo)和分化兩個(gè)階段，在胚胎發(fā)育的早期階段，建立一個(gè)有效的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度梯度，對(duì)合子胚和體胚的不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的建成是必不可少的條件[19]。不同的植物所使用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類(lèi)也大不相同，在苜蓿(Medicagosativa)體胚分化過(guò)程中，必須同時(shí)使用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，而對(duì)紅豆草(Onobrychisviciaefolia)則只在附加一定量BA的情況下才能分化，且分化率較高[20]。糖和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中的復(fù)雜相互作用已經(jīng)被廣泛研究[21]，在龍膽(Gentianalutea)體胚發(fā)生的長(zhǎng)期培養(yǎng)中[22]，適度的甘露醇和山梨糖醇產(chǎn)生滲透脅迫比添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑所獲得的體胚誘導(dǎo)率高。在樟樹(shù)(Cinnamomumcamphora)未成熟胚外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生中[23]，0.5 mol·L-1蔗糖4℃預(yù)處理72 h后再轉(zhuǎn)移到無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所獲得的體胚誘導(dǎo)率最高。本研究中，在水曲柳體胚誘導(dǎo)階段，只有當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑存在的條件下，在適宜的高滲透壓下才能誘導(dǎo)出體胚。在體胚分化階段，當(dāng)培養(yǎng)基中存在BA時(shí)，高滲透壓(100 g·L-1蔗糖)下產(chǎn)生的體胚分化率更高。但當(dāng)分化培養(yǎng)基中不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，125 g·L-1蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚分化率最大。由此認(rèn)為，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在水曲柳誘導(dǎo)階段其決定性作用，但在體胚分化階段，高滲透壓下植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)水曲柳體胚分化的影響不顯著。低滲透壓誘導(dǎo)下，水曲柳體胚分化率亦較低。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的添加低濃度的蔗糖(25和50 g·L-1)或甘露醇(25和55 g·L-1)時(shí)，在含有NAA的分化培養(yǎng)基中，水曲柳體胚誘導(dǎo)分化率較低，分別為30.00%、16.67%、16.67%和46.67%(數(shù)據(jù)未在文中列出)。

褐化現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)的建立過(guò)程中是必須消除的因素[24]。在水曲柳成熟和未成熟子葉誘導(dǎo)體胚的研究中發(fā)現(xiàn)[25]，體胚大部分直接發(fā)生在褐化的外植體上，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)抗氧化劑(Vc；PVP；L-谷氨酸)添加到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中雖然抑制了外植體的褐化，但體胚誘導(dǎo)率也減小。因此認(rèn)為褐化現(xiàn)象在水曲柳體胚發(fā)生中扮演著重要的角色[4]。在本研究中也同樣發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，當(dāng)蔗糖濃度為100 g·L-1或者甘露醇濃度為85 g·L-1時(shí)，褐化外植體上的體胚誘導(dǎo)率最高。體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中較高的滲透壓是造成外植體褐化的主要原因。高滲透壓對(duì)于水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生感受性的獲得是必需的，但其細(xì)胞學(xué)機(jī)理還需進(jìn)一步揭示。

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The National Natural Science Foundation of China(31400535)

introduction：YANG Ling(1977—),female,PhD,mainly engaged in plant physiology research work.

date:2017-05-05

EffectofPlantGrowthRegulatorsandOsmoticumsonSomaticEmbryogenesisofFraxinusmandshuricaRupr.

YANG Ling LIU Hong-Nan ZHANG Dong-Yan WEI Cheng SHEN Hai-Long*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

An experiment was conducted to study the effects of plant growth regulators (PGRs) and osmotic adjustment substances on somatic embryogenesis ofFraxinusmandshuricaRupr. by changing the kinds and concentrations of them, which was taken cotyledon of mature zygotic as explants. PGRs were the essential factors for somatic embryogenesis ofF.mandshuricaon the induction medium. The induction medium higher osmotic stress was beneficial to induce somatic embryos. Under PGRs, the induction medium of highest SSEs induction rate was added with 75 g·L-1sucrose. The somatic embryo was induced by the induction medium was added with 100 g·L-1sucrose had higher differentiation rate on the differential medium contained BA. This study laid the foundation in increasing SE induction rate and improving the status of somatic embryogenesis and optimizing the somatic embryogenesis system ofF.mandshurica.

Fraxinusmandshurica;somatic embryogenesis;plant growth regulator;osmoticums

國(guó)家自然科學(xué)基金(31400535)

楊玲(1977—)，女，博士，主要從事植物生理學(xué)研究。

* 通信作者：E-mial:shenhl-cf@nefu.edu.cn

2017-05-05

* Corresponding author：E-mial:shenhl-cf@nefu.edu.cn

Q949.776.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.007