張雪梅 姚文靜 趙 凱 姜廷波 周博如

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

小黑楊HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)及應(yīng)答鹽脅迫分析

張雪梅 姚文靜 趙 凱 姜廷波 周博如*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因是植物中特有的一類(lèi)蛋白家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因是由高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(HD)和亮氨酸拉鏈域(LZ)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)模型。楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族共有63個(gè)基因，可被分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ四個(gè)亞家族。本文利用RNA-Seq分析了鹽脅迫條件下HD-Zip基因家族在小黑楊根、莖、葉等不同組織的基因表達(dá)差異，從轉(zhuǎn)錄組水平揭示其應(yīng)答脅迫環(huán)境的分子機(jī)制，結(jié)果表明，鹽脅迫下在葉中有25個(gè)HD-Zip基因下調(diào)表達(dá)，21個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；莖中有42個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，11個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；根中有26個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，24個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。另外，本文根據(jù)擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族基因的已知功能，預(yù)測(cè)了楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子同源基因的功能，并利用生物信息學(xué)方法分析了楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸組成和理化性質(zhì)等，為進(jìn)一步研究楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因功能提供參考。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫；生長(zhǎng)發(fā)育；小黑楊；生物信息學(xué)

楊樹(shù)生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、分布范圍廣、材質(zhì)優(yōu)良，是重要的綠化、造林和用材樹(shù)種，主要應(yīng)用于四旁綠化、農(nóng)林防護(hù)、民用建筑、板料和紙漿制造方面。隨著楊樹(shù)全基因組測(cè)序的完成，楊樹(shù)成為研究植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)上的木本模式植物，在木本植物生長(zhǎng)發(fā)育和植物抗旱、耐鹽、抗低溫等非生物脅迫的研究和應(yīng)用中非常廣泛。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)也稱(chēng)反式作用因子，是能與真核生物啟動(dòng)子特定DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，或者是具有已知DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子[1]。轉(zhuǎn)錄因子能與基因5′端上游特定序列進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合，保證目的基因在特定的時(shí)間與空間表達(dá)。植物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能?chē)?yán)格控制生物表達(dá)過(guò)程，從而應(yīng)答環(huán)境脅迫，調(diào)節(jié)對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)。

同源異型域—亮氨酸拉鏈蛋白(Homeodomain-leucine Zipper,HD-Zip)是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，屬于Homeobox蛋白家族，具有高度保守的HD(Homeodomain,HD)結(jié)構(gòu)域，由61個(gè)氨基酸組成[2]，可折疊成典型的螺旋—環(huán)—螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋的結(jié)構(gòu)，能與DNA特異結(jié)合[3]，其末端與亮氨酸拉鏈域(LZ)緊密相連，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域主要是介導(dǎo)蛋白二聚體的形成[4]。根據(jù)氨基酸序列同源性的不同，植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因可分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ 4類(lèi)[5]，并且四大亞類(lèi)均有一定的結(jié)構(gòu)特征和相應(yīng)的功能特點(diǎn)，HD-ZipⅠ主要包括HD和LZ兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，在應(yīng)答非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用[6]；HD-ZipⅡ亞家族基因除了含有高度保守的HD和LZ序列外，在LZ下游緊挨著LZ結(jié)構(gòu)域還有一個(gè)以五個(gè)保守氨基酸半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)和谷氨酸(Glu)命名的N端共有序列，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞氧化還原傳感[7]，該亞家族的基因負(fù)責(zé)感應(yīng)光信號(hào)并能對(duì)植物激素產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)[8]；HD-ZipⅢ亞家族成員大多含有START(steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer)結(jié)構(gòu)域和與START相鄰的SAD(START-adjacent domain),除此以外，幾乎所有成員在C端均有一個(gè)可以結(jié)合信號(hào)分子來(lái)改變HD-ZipⅢ蛋白構(gòu)象的MEKHLA結(jié)構(gòu)域，該亞家族主要在胚胎形態(tài)發(fā)生、分生組織調(diào)控、側(cè)生器官形成、葉片的極性運(yùn)輸以及生長(zhǎng)素的運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用[9～10]；HD-ZipⅣ亞家族成員相較于HD-ZipⅢ亞家族缺少了MEKHLA結(jié)構(gòu)域，該亞家族成員主要參與表皮細(xì)胞的分化、花青素的積累、根的發(fā)育和毛狀體的形成[11～12]等。當(dāng)前已對(duì)擬南芥、水稻[13]、蘋(píng)果、紫花苜蓿等植物的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族有過(guò)相關(guān)研究，但對(duì)楊樹(shù)的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族介紹較少。

楊樹(shù)共有63個(gè)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因[14]，本文利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)法比較了楊樹(shù)在高鹽脅迫下分別在根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量，從而分析了HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在不同組織中的差異性表達(dá)；并利用生物信息學(xué)的方法對(duì)楊樹(shù)的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員進(jìn)行分析，為深度研究楊樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 非生物脅迫處理?xiàng)顦?shù)幼苗

從同一株楊樹(shù)上采集嫩枝，截成15 cm，25℃室溫14 h·d-1光照水培兩個(gè)月，新長(zhǎng)出根、莖(頂尖嫩莖處)、葉的楊樹(shù)苗即為本實(shí)驗(yàn)材料。然后分別用水(對(duì)照)和0.15 mol·L-1NaCl溶液處理24 h，收集根、莖、葉樣品(每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，液氮速凍、-70℃保存，然后送生物公司提取RNA并利用IlluminaHiSeq 2000基因分析系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，最后進(jìn)行RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理[15]。

1.2 楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析

從楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中獲得了63條轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中得到48條HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列。利用BioEdit對(duì)楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用ClustalX2.1和MEME(Version 4.10.0)對(duì)楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行基因保守元件(conserved motifs)的多元比較分析[16]。

將獲得的楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白氨基酸序列放入ExPaSy在線(xiàn)Protparam軟件(http://web/expasy/org/protparam/)進(jìn)行分析，獲得HD-Zip基因的蛋白分子量和等電點(diǎn)等理化屬性。用PBIL在線(xiàn)網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)對(duì)63條楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并用Swiss-Model程序從四個(gè)亞家族中隨機(jī)抽取3條蛋白序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)影響

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的鹽脅迫處理實(shí)驗(yàn)，用0.15 mol·L-1鹽溶液處理?xiàng)顦?shù)苗24 h后葉片出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，故以0.15 mol·L-1NaCl溶液作為脅迫處理?xiàng)顦?shù)的最大濃度。將楊樹(shù)苗浸泡在水和0.15 mol·L-1NaCl溶液中24 h，分別收集根、莖、葉樣品，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在葉中除了17個(gè)基因在鹽脅迫條件下沒(méi)有表達(dá)量變化以外，有25個(gè)HD-Zip基因下調(diào)表達(dá)，21個(gè)基因上調(diào)表達(dá)(表1)；莖中有10個(gè)基因沒(méi)有表達(dá)量變化，42個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，11個(gè)基因上調(diào)表達(dá)；根中有13個(gè)基因沒(méi)有表達(dá)量變化，26個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，24個(gè)基因上調(diào)表達(dá)(圖1A),其中，在葉中上調(diào)表達(dá)2倍以上的有5個(gè)，莖中上調(diào)表達(dá)2倍以上的有5個(gè)，最高為5.14倍，根中上調(diào)表達(dá)2倍以上的有7個(gè)，最高為8.25倍。除此以外，Potri.014G103000.1、Potri.001G083700.1和Potri.007G008200.1等5個(gè)基因在鹽脅迫條件下均在根、莖、葉中顯著上調(diào)表達(dá),Potri.017G081700.1、Potri.001G372300.1和Potri.008G148200.1等14個(gè)基因在根、莖、葉中均顯著下調(diào)表達(dá)(圖1B)，而在葉中上調(diào)4.55倍的Potri.007G029500.1基因在莖和根中表現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，還有的基因如Potri.009G023600.1、Potri.012G139300.1和Potri.001G229700.1在葉和根中表達(dá)量均顯著增加，在莖中卻呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。結(jié)果表明了，楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族各成員在不同的組織中參與植物的抗逆過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)高鹽應(yīng)答脅迫。

2.2 楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析

利用BioEdit對(duì)63條楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域和48條擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì),根據(jù)擬南芥HD-Zip基因家族的分類(lèi)[17]， 將楊樹(shù)的63個(gè)HD-Zip基因同樣分成四個(gè)亞家族HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ(表2)，從表中可以看出，楊樹(shù)有22個(gè)HD-Zip基因?qū)儆贖D-ZipⅠ亞家族，17個(gè)基因?qū)儆贖D-ZipⅡ亞家族，8個(gè)基因?qū)儆贖D-ZipⅢ亞家族，16個(gè)基因?qū)儆贖D-ZipⅣ亞家族。

表1HD-Zip家族基因應(yīng)答鹽脅迫的相對(duì)表達(dá)量

Table1RelativeexpressionofHD-Zipfamilygenesundersaltstress

基因IDGeneID葉中相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressioninleaves莖中相對(duì)表達(dá)量Relativeexpressioninstems根中相對(duì)表達(dá)量RelativeexpressioninrootsPotri．006G071600．10．022±0．001-1．383±0．0048．246±0．686Potri．004G020400．10．048±0．007-0．438±0．0170．048±0．003Potri．008G129500．10．108±0．022-0．403±0．0110．912±0．037Potri．018G045100．10．228±0．0010-1．826±0．144Potri．003G052400．10．250±0．0201．045±0．017-0．282±0．025Potri．002G113400．10．336±0．040-1．502±0．069-1．185±0．064Potri．010G112600．10．403±0．0142．912±0．2060．699±0．101Potri．014G045100．10．445±0．016-0．716±0．0321．212±0．026Potri．015G065400．10．477±0．0960．350±0．013-2．969±0．098Potri．007G135100．10．481±0．021-2．785±0．036-1．293±0．132Potri．001G229700．10．606±0．129-0．103±0．0331．791±0．709Potri．007G008200．10．733±0．0480．365±0．0380．357±0．025Potri．012G139300．10．794±0．014-0．355±0．0244．411±0．315Potri．012G070900．11．078±0．0380．845±0．107-1．408±0．521Potri．009G023600．11．420±0．269-0．022±0．0012．389±0．510Potri．002G136400．11．488±0．0330．993±0．0211．488±0．016Potri．012G023700．12．199±0．1892．547±0．0113．805±0．102Potri．002G176300．12．870±0．1052．089±0．195-1．191±0．976Potri．007G029500．14．555±0．138-0．020±0．004-0．144±0．061Potri．001G083700．14．642±0．1313．847±0．5321．209±0．121Potri．014G103000．14．843±0．0595．143±0．3821．116±0．143

圖1 鹽脅迫條件下楊樹(shù)HD-Zip家族基因表達(dá) A.HD-Zip家族基因在不同組織中的表達(dá)；B.上調(diào)表達(dá)基因和下調(diào)表達(dá)基因Fig.1 Expression of HD-Zip family genes in poplar by salt stress A.Expression of HD-Zip family genes in different tissues; B.Up-regulated and down-regulated genes

Phytozome登錄號(hào)PhytozomeID類(lèi)型Type染色體Chromosome大小Size(aa)分子量Molecularweight等電點(diǎn)TheoreticalPI脂肪系數(shù)Aliphaticindex疏水性平均系數(shù)Grandaverageofhydropathicityα?螺旋Alphahelix(%)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Secondarystructureprediction延伸鏈Extendedstrand(%)無(wú)規(guī)則鏈Randomcoil(%)Potri．007G097100．1Ⅰ732836845．64．8665．46-0．76742．389．4548．17Potri．010G093400．1Ⅰ1031135250．56．2269．07-0．78136．0111．5852．41Potri．005G071900．1Ⅰ532936971．74．8266．41-0．78536．4713．9849．54Potri．008G148200．1Ⅰ828932985．85．9464．19-0．86233．918．3057．79Potri．001G155100．1Ⅱ130233642．98．7464．3-0．78227．4811．5960．93Potri．017G081700．1Ⅰ1730634748．86．2764．12-0．84338．246．5455．23Potri．015G065400．1Ⅰ15314354934．6766．82-0．81840．4510．8348．73Potri．012G070900．1Ⅰ12317354944．762．81-0．79840．387．5752．05Potri．016G059000．1Ⅱ1634438311．98．9861．89-0．79722．3814．8362．79Potri．009G023600．1Ⅱ938342234．56．0356．37-0．8423．5024．8051．70Potri．001G229700．1Ⅱ137441439．77．6551．23-0．90122．1920．3257．49Potri．006G193700．1Ⅱ632636355．99．2863．19-0．7924．8515．6459．51Potri．007G008200．1Ⅱ727330530．58．6865．19-0．70934．8015．3849．82Potri．014G045100．1Ⅱ14298331458．463．89-0．82830．5410．4059．06Potri．002G136400．1Ⅱ232035667．18．8865．59-0．83530．639．3860．00Potri．005G147100．1Ⅱ529032480．77．5370．31-0．6828．9713．4557．59Potri．002G100600．1Ⅰ226530733．16．2368．45-0．95549．817．1743．02Potri．008G194400．1Ⅰ830235004．25．0463．61-0．828．4814．9056．62Potri．012G023700．1Ⅰ12275313985．6163．16-0．79153．8210．9135．27Potri．018G133100．1Ⅱ18207239258．7959．37-1．10532．8511．1156．04Potri．014G103000．1Ⅰ1423827160．24．9759．87-0．91637．399．6652．94Potri．016G058600．1Ⅱ1620323012．19．7762．07-0．88735．4714．7849．75Potri．002G176300．1Ⅰ223827282．45．0459．87-0．93836．978．4054．62Potri．006G071600．1Ⅱ621424587．58．3254．72-1．18632．2411．2156．54Potri．002G113400．1Ⅱ2269300706．1675．39-0．64228．2517．1054．65Potri．005G161500．1Ⅰ526530781．15．6769．58-0．91148．3010．1941．51Potri．005G126100．1Ⅰ520423701．99．0270．74-0．87533．8214．2251．96Potri．003G079800．1Ⅱ335439484．56．6868．08-0．66723．7313．5662．71Potri．006G117700．1Ⅰ623227132．48．4563．92-0．9547．846．9045．26Potri．007G029500．1Ⅰ720423834．16．0469．8-0．89850．988．3340．69Potri．008G129500．1Ⅱ8232255738．4867．28-0．62128．4517．6753．88Potri．010G112600．1Ⅱ1022525185．49．1665．91-0．7332．8916．0051．11Potri．001G083700．1Ⅰ119623014．48．9458．21-1．24552．553．0644．39Potri．011G114500．1Ⅰ1121324526．36．4569．15-0．86846．484．6948．83Potri．001G395100．1Ⅰ120523745．78．7776．59-0．64947．809．7642．44Potri．007G135100．1Ⅰ717920311．78．5576．87-0．74549．169．5041．34Potri．017G016900．1Ⅰ1717920296．97．8376．87-0．70453．073．9143．02Potri．016G058400．1Ⅱ1614416280．69．9262．36-0．75131．9420．8347．22Potri．003G147200．1Ⅰ39511456．29．3492．42-0．39466．3214．7418．95Potri．003G052400．1Ⅳ375984384．36．1174．91-0．50837．0217．9245．06Potri．001G184100．1Ⅳ176485053．26．0374．54-0．47938．0916．1045．81Potri．002G230200．1Ⅳ276583840．85．677．88-0．31830．4617．6551．90Potri．014G152000．1Ⅳ1476283224．45．5679．23-0．29237．2714．9647．77Potri．004G020400．1Ⅳ472579870．55．5479．89-0．31834．7617．1048．14Potri．011G025000．1Ⅳ1172078975．55．5680．29-0．29732．6418．4748．89Potri．014G075200．1Ⅳ1482389393．45．8981．41-0．27434．5116．7748．72Potri．002G154700．1Ⅳ282089297．25．9381．35-0．26935．8518．0546．10Potri．015G034100．1Ⅳ1572579739．56．3381．46-0．25730．0719．1750．76Potri．012G038500．1Ⅳ1271178026．46．0883．5-0．2935．5815．6148．80Potri．006G237500．1Ⅲ684492883．35．9783．58-0．13142．5416．1141．35Potri．015G141800．1Ⅳ1575383020．35．7183．84-0．2935．8618．0646．08Potri．018G045100．1Ⅲ1884392805．26．0785．41-0．14240．3317．9141．76Potri．011G098300．1Ⅲ1184392739．85．9585．99-0．1442．7017．0840．21Potri．012G139300．1Ⅳ1274882431．45．5684．81-0．32433．4218．8547．73Potri．001G188800．1Ⅲ185293855．36．0687．14-0．13740．4917．0242．49Potri．001G372300．1Ⅲ184492675．75．9684．62-0．15242．7716．1141．11Potri．003G050100．1Ⅲ383792230．46．0386．71-0．16142．1715．4142．41Potri．003G096000．1Ⅳ380889791．85．4380．82-0．31128．7119．9351．36Potri．001G137800．1Ⅳ180489190．15．3580．63-0．31528．1119．1552．74Potri．009G014500．1Ⅲ985593554．55．990．51-0．07343．9816．3739．65Potri．004G211300．1Ⅲ4846928415．8691．82-0．04648．2314．8936．88Potri．017G144600．1Ⅳ1764875924．36．3882．54-0．28130．2619．0150．73Potri．T120700．1ⅣScaffold?20164170604．86．4681．86-0．39935．1016．85 48．05

分析楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族的理化性質(zhì)可知，楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族的氨基酸個(gè)數(shù)在95～855，分布在HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族的基因氨基酸個(gè)數(shù)較少，一般在100～400個(gè)，而HD-ZipⅠ亞家族中的Potri.003G147200.1僅有95個(gè)氨基酸。分布在HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族中的基因氨基酸個(gè)數(shù)在641～855，氨基酸個(gè)數(shù)最多的是HD-ZipⅢ中的Potri.009G014500.1，多達(dá)855個(gè)。楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族蛋白的等電點(diǎn)大多在酸性范圍內(nèi)，脂肪系數(shù)均在51.23以上，最高達(dá)到92.42，這表明了HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白熱穩(wěn)定性較高。其疏水性平均系數(shù)均為負(fù)數(shù)，說(shuō)明HD-Zip蛋白均表現(xiàn)為親水性。63個(gè)楊樹(shù)HD-Zip蛋白序列中主要有α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)且三種結(jié)構(gòu)交錯(cuò)排列。利用planttfdb數(shù)據(jù)庫(kù)找到63個(gè)楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，根據(jù)popgenie在線(xiàn)網(wǎng)站上Chromosome Diagram功能，進(jìn)行染色體定位發(fā)現(xiàn)，HD-Zip基因在楊樹(shù)染色體上呈不均勻分布，在第1、2、3號(hào)染色體上分布較多，分別有8、6、5條基因，在其它染色體上分布較少，第4、9、10、16和18號(hào)染色體上均只存在2條HD-Zip基因，并且在第13和第19號(hào)染色體上不存在HD-Zip基因。HD-Zip基因在染色體上的這種不均衡分布可能跟楊樹(shù)進(jìn)化過(guò)程中基因的功能特性相關(guān)。

利用MEME在線(xiàn)軟件確定了20個(gè)保守序列(表3)，根據(jù)20個(gè)氨基酸保守序列可將63個(gè)楊樹(shù)HD-Zip基因分成四類(lèi)，與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分類(lèi)一致。對(duì)63條HD-Zip基因分析得到，基序1和基序2編碼高度保守的HD結(jié)構(gòu)域，基序17編碼亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(LZ)，而基序3、7、8、9、11、12、13、14、16、18可能與HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ中的START結(jié)構(gòu)域的形成有關(guān)，基序4、5、6、10、13、15、19、20則可能與僅存在與HD-ZipⅢ中的MEKHLA結(jié)構(gòu)域的編碼有關(guān)。不同的亞家族包含有不同的保守結(jié)構(gòu)域，這可能與HD-Zip基因蛋白特殊的生物學(xué)功能相關(guān)。

利用Swiss-Model分別HD-Zip 4個(gè)亞家族中的各個(gè)成員進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模，結(jié)果表明，HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ和HD-ZipⅣ亞家族中蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)大體相同，而HD-ZipⅢ亞家族中的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象之間略有不同，這可能與HD-ZipⅢ中基因的特殊保守域MEKHLA相關(guān)，從而使HD-ZipⅢ中不同的成員具有不同的功能[18]，而且四個(gè)亞家族之間的蛋白構(gòu)型也存在一定的差異。分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，HD-ZipⅠ亞家族中蛋白的α-螺旋所占比例偏大，HD-ZipⅡ亞家族中蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例偏大，而HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ亞家族中蛋白的延伸鏈的含量較HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ偏大，因此不同亞家族之間蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可能與蛋白中的α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量有關(guān)。

表3HD-Zip基序的長(zhǎng)度和保守氨基酸序列

Table3ThelengthandconservedaminoacidsequenceofHD-Zipmotifs

基序Motif長(zhǎng)度Length保守氨基酸序列ConservedaminoacidsequenceMotif150LGLRPRQVEVWFQNRRARTKLKQTEVDCEFLKRCCENLTAENRRLQKEVQMotif229RYHRHTARQIQEMEAMFKECPHPDDKQRMMotif329GVAGNYNGALQVMTAEFQVPSPLVPTRENYFVRYCKQMotif450IEPKQIKVWFQNRRCREKQRKEASRLQTVNRKLTAMNKLLMEENDRLQKQMotif541KATGTAVEWVQMPGMKPGPDSIGIVAISHGCTGVAARACGLMotif650PVFTFANQAGLDMLETTLVALQDITLEKIFDDHGRKTLCSEFPQIMQQGFMotif724THQLYRPLISSGMGFGAQRWIATLMotif841TSFWLPVPPKRVFDFLRDENTRNEWDILSNGGVVQEMAHIAMotif941QESCTDSTGSYVIYAPVDISAMNIVLSGGDPDYVALLPSGFMotif1050DVFLLQLCCGMDENAVGTCAELIFAPIDATFADDAPLLPSGFRIIPLDSGMotif1115LPSGCLIQDMPNGYSMotif1229RMVISFCAGVSASTAHTWTTLSGTGADDVMotif1332SLLTVAFQILVNSLPTAKLTVESVETVNNLISMotif1441RSEASRESAVVIMNHVNLVEILMDANQWSTIFCGIVSRAMTMotif1550VLCAKASMLLQNVPPAILLRFLREHRSEWADSGIDAYAAAAVKAGPCSLPMotif1630DKPMIIELAVAAMEELVRMAQMDEPLWMGSMotif1721PATTLTMCPSCERVATTTTSSMotif1841FDEQKLRIENAQLKEELDRVSSIAAKYIGRPISQLPPVQPVMotif1929CLPGGICLSSMGRPVSYERAVAWKVLNEEMotif2029VGLEPTRVAEILKDRPSWFRDCRAVDVLN

3 討論

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能，不同的亞家族轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮不同的功能，如HD-ZipⅠ蛋白在番茄的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與果實(shí)成熟的調(diào)控[19]，HD-ZipⅡ亞家族中基因的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)擬南芥的早花表型[20]，HD-ZipⅢ中的成員調(diào)控木質(zhì)部維管束形成[21]、頂端分生組織的發(fā)生[22],HD-ZipⅣ亞家族中的基因成員在玉米中過(guò)表達(dá)后抑制表皮毛的形成[23]等。本文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了鹽脅迫條件下楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因在根、莖、葉中的差異性表達(dá)，找到了鹽脅迫下在葉中高表達(dá)的21個(gè)HD-Zip基因，莖中11個(gè)高表達(dá)的HD-Zip基因以及根中24個(gè)高表達(dá)的HD-Zip基因，分析發(fā)現(xiàn)Potri.014G103000.1等5個(gè)基因經(jīng)過(guò)高鹽處理后均顯著上調(diào)表達(dá)，Potri.017G081700.1等14個(gè)基因在根、莖、葉中均下調(diào)表達(dá)，而有的基因則選擇性地在不同的組織中高表達(dá)，表明了楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族各成員在不同的組織中參與植物的抗逆過(guò)程，從而發(fā)揮鹽脅迫應(yīng)答作用。

本文利用生物信息學(xué)的方法分析了63個(gè)楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因的結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息，通過(guò)與擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族中的48個(gè)基因進(jìn)行比較以及對(duì)其包含的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析將其分為四個(gè)亞家族，并分析了整個(gè)家族中63個(gè)基因的理化性質(zhì)和染色體定位，得到分布在17條染色體上的63個(gè)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子蛋白大多處于酸性范圍內(nèi)，而等電點(diǎn)值較大的基因蛋白大多含有較多的亮氨酸等堿性氨基酸，有助于形成亮氨酸拉鏈保守結(jié)構(gòu)域，從而介導(dǎo)蛋白二聚體的形成；通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ和HD-ZipⅣ亞家族中各成員蛋白結(jié)構(gòu)相似，而HD-ZipⅢ中各成員蛋白結(jié)構(gòu)略有不同，可能與其特殊的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。統(tǒng)計(jì)得到，鹽脅迫條件下表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)的21個(gè)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因除Potri.018G045100.1屬于HD-ZipⅢ亞家族外，有3個(gè)基因?qū)儆贖D-ZipⅣ亞家族，而屬于HD-ZipⅠ和HD-ZipⅡ亞家族的分別有8個(gè)和9個(gè)；在根、莖、葉中應(yīng)答鹽脅迫均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)的基因除Potri.007G008200.1屬于HD-ZipⅡ亞家族外，其余都屬于HD-ZipⅠ亞家族。這些基因在染色體上呈不均勻分布，其氨基酸個(gè)數(shù)與其分子量不大，除了Potri.001G083700.1基因的等電點(diǎn)處于堿性范圍外，其它基因均處于酸性范圍內(nèi)，其脂肪系數(shù)均在58.21以上，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較高，疏水性平均值在-0.791～-1.245，是親水性極強(qiáng)的蛋白，這些基因所表現(xiàn)出的較強(qiáng)的脅迫應(yīng)答能力可能與其特殊的理化性質(zhì)以及HD-ZipⅠ亞家族中轉(zhuǎn)錄因子的HD和LZ結(jié)構(gòu)域有關(guān)，而HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ中的START和MEKHLA結(jié)構(gòu)域在脅迫處理環(huán)境中可能抑制基因的表達(dá)?？傊?，通過(guò)RNA-Seq和生物信息學(xué)方法的分析，將進(jìn)一步為研究楊樹(shù)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白在應(yīng)答逆境脅迫方面提供有效依據(jù)。

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National 863 project(2013AA102701)

introduction：ZHANG Xue-Mei(1991—),female,master,mainly engaged in the forestry research of stress resistance.

date:2017-07-14

BioinformaticsandResponsetoSaltStressAnalysisoftheHD-ZipTranscriptionFactorFamilyinPopulussimonii×P.nigra

ZHANG Xue-Mei YAO Wen-Jing ZHAO Kai JIANG Ting-Bo ZHOU Bo-Ru*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

The HD-Zip transcription factor family is a kind of special protein in plant, playing crucial roles in plant development processes and abiotic stresses response. The protein family includes a highly conserved homeodomain(HD) and a leucine zipper domain(LZ), forming a special structural model. The HD-Zip transcription factor family, including 63 members, can be classified into 4 subfamilies HD-Zip Ⅰ, HD-Zip Ⅱ, HD-Zip Ⅲ and HD-Zip Ⅳ. RNA-Seq analysis of poplar roots, stems and leaves under salt stress was conducted for the differentially expressed genes in different tissues, and reveal the molecular mechanism of the response to stress environment. Therewere 25 HD-Zip genes down-regulated and 21 HD-Zip genes up-regulated in leaves under salt treatment, 42 genes down-regulated and 11 genes up-regulated in stems, and 26 genes down-regulated and 24 genes up-regulated in roots. According to gene annotations in Arabidopsis thaliana, the functions of HD-Zip transcription factor in poplarwere predicted.The conserved domains, structural characteristics and chemical properties of HD-Zip family members were also studied by bioinformatics, providing reference for gene functions of HD-Zip family in poplar.

HD-Zip transcription factor;abiotic stresses;growth and development;Populussimonii×P.nigra;bioinformatics

國(guó)家863課題資助(2013AA102701)

張雪梅(1991—)，女，碩士研究生，主要從事林木抗逆機(jī)理方面研究。

* 通信作者：E-mail:boruzhou@yahoo.com

2017-07-14

* Corresponding author：E-mail:boruzhou@yahoo.com

S722.3+6

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.011