姜 勇 胡尚連* 曹 穎 盧學琴 黃 艷 徐 剛

(1.西南科技大學生命科學與工程學院植物細胞工程實驗室，綿陽 621010； 2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心，綿陽 621010)

外源GA3對毛竹實生苗莖稈生長及CesA基因表達的影響

姜 勇1,2胡尚連1,2*曹 穎1,2盧學琴1,2黃 艷1,2徐 剛1,2

(1.西南科技大學生命科學與工程學院植物細胞工程實驗室，綿陽 621010；2.四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心，綿陽 621010)

以毛竹實生苗為試驗材料，研究不同濃度外源GA3(0，0.1，0.5，1 μmol·L-1)對毛竹生長及CesA基因表達的影響。結果表明，與未經GA3處理相比，施用外源GA3后，毛竹實生苗莖節(jié)間和纖維細胞顯著伸長，初生壁纖維素合成相關基因PeCesA2和PeCesA6相對表達量明顯上調，次生壁相關基因PeCESA4和PeCESA4-1顯著下調，傅里葉紅外光譜分析(FTIR)，發(fā)現毛竹莖稈纖維素特征峰強度(1 060，1 160及1 373 cm-1)隨著GA3濃度升高而逐漸增強，表明施用外源GA3能夠影響毛竹莖稈CesA基因表達，PeCesA2和PeCesA6的表達與外源GA3促進纖維細胞伸長的過程存在一定聯系。

毛竹實生苗；GA3；纖維細胞；CesA基因

纖維素是植物初生壁和次生壁的主要成分，是由CesA亞基構成的玫瑰花狀蛋白復合體合成的，該蛋白質復合體由六個玫瑰狀亞基組成一個較大的玫瑰花狀蛋白復合體[1]。但參與初生和次生細胞壁纖維合成的CesA基因并不相同，擬南芥中與初生壁合成相關的是AtCesA1、AtCesA6和AtCesA3；次生壁相關的是AtCesA8、AtCesA7和AtCesA4[2]。高粱中，SbCesA1、SbCesA6和SbCesA3與初生壁合成有關；SbCesA4、SbCesA7和SbCesA8與次生壁合成相關[3]。水稻中，與初生壁相關的是OsCesA1、OsCesA3和OsCesA6；次生壁相關的是OsCesA4、OsCesA7和OsCesA9[4]。

赤霉素(GA3)是調節(jié)植物生長和發(fā)育的雙萜植物激素，是在對水稻惡苗病的研究中首次發(fā)現的，當水稻感染Gibberellafujikuroi(一種病原霉菌)后，這種病原菌將會產生大量的GA3使得莖稈過度伸長[5～6]。研究表明，當高粱中GA20-氧化酶突變后，內源GA3缺失，與野生型相比，3種初生壁合成相關CesA基因(SbCesA1,3,6)表達下調，且株型矮小纖維含量降低，而這一突變可通過添加外源活性的GA3而得以恢復[3]。這暗示GA3與CesA基因之間可能存在一定關系。

毛竹(Phyllostachysedulis)纖維長寬比為115.8～172.5[7]，高于楊樹纖維的長寬比(45.3)[8]，但比棉纖維的低(1 000～3 000)[9]。研究表明，外源噴施GA3后，新分蘗竹株稈高、節(jié)間長和纖維細胞長均有極顯著增加，即外源GA3能顯著改善毛竹實生苗新分蘗竹株的竹材纖維質量[10]。但關于毛竹CesA基因表達調控研究還未見報道。鑒于此，本文以不同濃度外源GA3誘導處理毛竹實生苗植株，研究其對毛竹實生苗莖稈生長、纖維素特征吸收峰及CesA基因表達的影響，為毛竹遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

挑選約500粒飽滿的毛竹種子于50℃溫水中浸泡30 min[11]，然后將其放置在加有濾紙的平皿中，在其中加入5 mL純水，在25℃下培養(yǎng)2 d待其發(fā)芽，挑選200粒長勢一致萌發(fā)的毛竹種子為參試材料(圖1A)，移至帶濾紙的平皿中，每一平皿放置10粒種子，并向其中添加5 mL不同濃度的GA3(0，0.1，0.5，1 μmol·L-1)，以上處理均放置于光照培養(yǎng)箱中(25℃，2 000 lx，8 h光周期)培養(yǎng)。每處理5個重復，每個重復10粒萌發(fā)種子，每天換一次液體，每次5 mL，連續(xù)處理23 d。23 d后測量50株毛竹實生苗高度、節(jié)間長度和節(jié)數。取每一處理50株實生苗基部第二節(jié)間，將其分成5份，每份10根莖段，選取其中3份將其切割成1 cm長的莖段并分別混勻，放置于液氮中并保存在-80℃冰箱中，以供纖維含量測定及RNA提??；剩下的兩份將其切割成1 cm左右的莖段于離析液中離析，以供纖維細胞長度測定。

1.2 測定方法

1.2.1 纖維細胞長度測定

將各處理的毛竹第二節(jié)間切割成1 cm左右的小段，于離析液(10% HNO3，10% H2CrO4)中浸泡1 d左右，待其組織軟化，用清水沖洗至中性。吸取100 μL液體于載玻片上，蓋上蓋玻片于Leica DMI3000倒置熒光顯微鏡觀察纖維細胞并拍照，每個處理選擇完整的200個纖維細胞，使用Image-Pro Plus 6.0軟件處理圖片并測量纖維細胞長度。

1.2.2 纖維素含量測定

采用傅里葉紅外光譜分析法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)測量細胞壁中的纖維和木素含量，將莖稈由-80℃取出，加入液氮研磨至細粉狀，再用低溫的磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH7.2)漂洗5次，用70%酒精在70℃條件下孵育1 h，連續(xù)兩次。真空干燥后，將抽提出的細胞壁物質進行FTIR分析。

1.2.3 CesA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建

從毛竹數據庫(http://www.bamboogdb.org/page/download.jsp)搜索到毛竹CesA氨基酸序列(PeCesA4(PH01000746G0570)，PeCesA4-1(PH01000018G0380)，PeCesA5(PH01000040G0670)，PeCesA6(PH01000204G0350))，從NCBI搜索到毛竹CesA氨基酸序列(PeCesA1(ACZ82296.1)，PeCesA2(ACZ82297.1)，PeCesA3(ACZ82298.1))；水稻CesA氨基酸序列(OsCesA1(XP_015639380.1)，OsCesA3(XP_015646807.1)，OsCesA6(XP_015647044.1)，OsCesA4(XP_015621242.1)，OsCesA7(XP_015614140.1)，OsCesA9(XP_015612279.1))；高粱CesA氨基酸序列(SbCesA4(XP_002467109.1)，SbCesA7(XP_002460229)，SbCesA1(XP_002440694)，SbCesA3(XP_002463687.1)，SbCesA6(XP_002459635.1))。使用MEGA7.0軟件以擬合的最優(yōu)模型(JTT+G)[12～13]，選用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)，Bootstrap值定為1 000進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

1.2.4 CesA基因表達水平測定

參照OMEGA Plant RNA Kit說明書，提取毛竹莖稈總RNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。參照天根FastQuant RT Kit說明書，選取質優(yōu)量高的RNA用于cDNA的合成。在毛竹數據庫和GenBank數據庫中搜索毛竹CesA基因和毛竹內參基因Tublin(PH01001724G0160)，使用DNAMAN軟件對搜索到的序列進行比對分析，并以高度可變區(qū)域為模板使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，參照天根RealMasterMix(SYBR Green)說明書進行實時熒光定量分析。以內參基因Tubulin為對照，采用2-△△CT計算法計算其相對表達量。

1.2.5 數據分析

用SPSS 17.0軟件對毛竹實生苗高度、節(jié)間長度、纖維細胞長度進行方差分析。

表1CesA基因實時熒光定量引物

Table1TheprimersofCesAforquantitativeReal-timePCR

基因名稱Genename(ID)引物Primers5′—3′PeCesA1(GU176303．1)FRTCATCATCGGATTCCCCGGCCAGGTCTCCCCCTCCTCTAGPeCesA2(GU176304．1)FRGCATCATAGGATTCCACGTTGATATCCCCTTTCCCTTCTGPeCesA3(GU176305．1)FRGAGGATACATCCCTTCAGTCAATGTCACCAACTCCCCGACPeCesA5(PH01000040G0670)FRTCAGGCCATCCCCAATGTTCGCCGTCCCAGTCTTTACCGCPeCesA4?1(PH01000018G0380)FRCATTAGCGATCGCCAGGATGAGGCGGGGCTTGTGCTTTTGPeCesA4(PH01000746G0570)FRGGTGAAATTTCTTGATGCACAGGTGAGGCTTGTGCTTTTGPeCesA6(PH01000204G0350)FRCGCAGCCGTTCCAGCCCATCCCGTCCCAATCACCACCACCTublin(PH01001724G0160)FRATATCAAAGATCAGGGAGGAGTGAAACAGATGTCATAGAGGG

圖1 萌發(fā)的毛竹種子和不同濃度GA3處理毛竹實生苗生長狀況 A.處理前萌發(fā)的毛竹種子；B～C.不同濃度GA3處理23 d后的毛竹幼苗Fig.1 The germinating seed of P.edulis and the growth status of P.edulis seedlings treated by the different concentration of GA3 A.The germinating seed of P.edulis before treatment; B,C.The P.edulis seedlings treated by the different concentration of GA3 for 23 days

GA3濃度ConcentrationofGA3(μmol·L-1)基部第一節(jié)間長度Thelengthoffirstinternodefromthebottom(cm)基部第二節(jié)間長度Thelengthofsecondinternodefromthebottom(cm)基部第三節(jié)間長度Thelengthofthirdinternodefromthebottom(cm)幼苗高度Theheightofseedings(cm)0．00．45±0．20D1．57±0．22C0．90±0．19B2．92±0．13C0．11．22±0．20C2．24±0．35B1．65±0．37A5．11±0．26B0．51．90±0．40B2．73±0．53B1．82±0．08A5．54±0．25B1．02．81±0．46A3．77±0．55A1．94±0．30A8．52±0．36A

注：表中數值為平均值±標準差 不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著(P<0.01)，下同。

Note:Data are mean±SD.The different capital letters in the same group respect the significance at the 0. 01 level(P<0.01).The same as below.

2 結果與分析

2.1GA3對毛竹實生苗莖節(jié)間伸長的作用

每一處理實生苗的表型特征(圖1:B～C)。與未經GA3處理相比，不同濃度外源GA3處理后，毛竹實生苗平均株高、平均節(jié)長都達到了差異極顯著水平；經0.1、0.5、1.0 μmol·L-1外源GA3處理后，基部第一節(jié)間長度分別增加171%、322%、524%；基部第二節(jié)間長度分別增加43%、74%、140%；基部第三節(jié)間分別增加83%、102%、116%；株高分別增加75%、90%、192%(表2)。表明在毛竹實生苗生長期間施用GA3能顯著促進毛竹實生苗株高的增加，而竹株高度的增加主要來自于各節(jié)間伸長。

2.2GA3對纖維細胞伸長和纖維素特征峰的影響

施用外源GA3后，毛竹實生苗莖稈纖維細胞長度顯著增加(P<0.01)，與未經GA3處理的相比，0.1、0.5、1.0 μmol·L-1處理分別伸長了48%、56%、82%(圖2，圖3A)，表明GA3可促進纖維細胞伸長。

圖2 不同濃度GA3處理毛竹實生苗莖桿纖維細胞 A. 0 μmol·L-1；B. 0.1 μmol·L-1；C. 0.5 μmol·L-1；D. 1 μmol·L-1Fig.2 The fiber cells of stem from the seedling in P.edulis treated by the different concentration of GA3 A. 0 μmol·L-1; B. 0.1 μmol·L-1; C. 0.5 μmol·L-1; D. 1μmol·L-1

圖3 不同濃度GA3處理纖維細胞長度(A)和毛竹莖稈細胞壁物質的傅里葉紅外光譜分析(FTIR)(B) 箭頭指示纖維素特征吸收峰。Fig.3 The length of fiber cell(A) and fourier transform infrared spectroscopy(FTIR) analysis of cell wall material(B) from the stem of seedling in P.edulis treated by the different concentration of GA3 The arrow indicates the characteristic absorption peak of cellulose.

孫柏玲等[14]采用紅外光譜法和二維相關紅外光譜分析技術對慈竹單根纖維進行研究，發(fā)現在1 248～1 032 cm-1，1 373 cm-1處存在纖維素特征吸收峰，分別代表C—O伸縮振動和C—H彎曲振動。采用傅里葉紅外光譜分析技術對毛竹實生苗莖稈細胞壁物質進行分析，發(fā)現4種GA3處理的FTIR光譜中均出現纖維素的特征吸收峰(1 060，1 160及1 373 cm-1)。與未經GA3處理的相比，0.1、0.5、1.0 μmol·L-1GA3處理后，上述三個纖維素特征吸收峰的吸收強度逐漸增強(圖3B)。

2.3 CesA基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建

施加GA3后毛竹實生苗纖維細胞伸長，研究表明，細胞的各向異性膨脹與初生壁纖維合成的纖維合酶基因(CesA)相關[15]，同時水稻中次生壁纖維合成相關的CesA4突變后導致水稻矮化[16]，由此表明，CesA可能參與GA3促進纖維細胞及莖節(jié)伸長的過程。

根據系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，PeCesA4、PeCesA4-1和OsCesA4聚為一個類群，有研究表明，OsCesA4,7,9、SbCesA4,7與次生壁纖維素合成相關[3～4]，由此推斷PeCesA4、PeCesA4-1可能與次生壁纖維素合成相關。PeCesA1、PeCesA2、SbCesA1、OsCesA1處于同一分支；PeCesA3、SbCesA3聚為一類；PeCesA6、OsCesA6、SbCesA6、PeCesA5處于同一支。PeCesA2、SbCesA1、PeCesA1和OsCesA1處于同一分支。研究表明，OsCesA1,3,6、SbCesA1,3,6與初生壁纖維素合成相關[3～4]，由此推斷PeCesA1,2,3,5,6可能與初生壁纖維素合成相關。

圖4 毛竹、水稻及高粱CesA氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹 ■.與次生壁纖維素合成相關；●.與初生壁纖維素合成相關Fig.4 The phylogenetic tree of CesA amino acid of P.edulis, rice and sorghum ■.Respects secondary wall cellulose biosynthesis; ●.Respects primary wall cellulose biosynthesis

2.4GA3對CesA基因表達的影響

與未經GA3處理相比，施用不同濃度GA3后，毛竹實生苗莖稈中PeCesA2和PeCesA6基因相對表達量顯著上調，隨著GA3濃度提高，其相對表達量逐漸增加；PeCesA3、PeCesA4、PeCesA4-1和PeCesA5基因相對表達量均顯著下調，但不同濃度GA3處理間差異不明顯；PeCesA1無明顯變化(圖5)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，PeCesA2、PeCesA6分別與SbCesA1、SbCesA6聚為一類，這與高粱內源GA3缺失造成SbCesA1,3,6基因表達下調一致[3]，SbCesA1、SbCesA3還分別與PeCesA1、PeCesA3聚為一類，而PeCesA1在施用外源GA3后，其相對表達量無顯著變化；PeCesA3基因表達顯著下調。表明GA3能夠促進毛竹實生苗莖稈特定CesA基因的上調(PeCesA2和PeCesA6)或下調(PeCesA3、PeCesA4、PeCesA4-1和PeCesA5)。

圖5 不同濃度GA3處理毛竹莖稈CesA基因相對表達水平 *.與對照相比相對表達量2倍以上或0.5倍以下Fig.5 The relative expression level of CesA gene in stem of P.edulis treated by the different concentrations of GA3 *. Respects the relative expression level of 2-fold or more or 0.5-fold or less as compared with control

3 討論

本研究結果表明，外源赤霉素(GA3)顯著促進了毛竹實生苗株高和莖節(jié)間伸長，說明毛竹實生苗高度的變化主要是由節(jié)間伸長所致。江雪等[10]曾報道，在外源GA3作用下，毛竹新分蘗竹株節(jié)間伸長與莖部纖維細胞長度增加具有顯著的相關性。有研究表明，當高粱GA20-氧化酶發(fā)生突變后，造成高粱內源活性GA3缺失，進而導致高粱矮化[3]。官鳳英等[17]也曾報道，對綠竹施用矮狀素后，明顯抑制了綠竹株高生長，而矮狀素的主要作用是抑制內源GA3生物合成。因此，這也證明GA3對于禾本科植物株高生長具有重要作用。另外，對毛竹實生苗莖稈節(jié)間長度進行測量發(fā)現，隨著外源GA3濃度提高，基部第一節(jié)間伸長較明顯，基部第二節(jié)間次之，說明外源GA3對同一植株不同節(jié)間伸長生長的影響存在差異。這可能與竹類植物特殊的生長方式有關。研究表明，筍在出土之前，其節(jié)間數已確定，其株高主要是由每一節(jié)間的伸長生長來決定，且每一節(jié)間的伸長都是一個相對獨立的過程[18]。

此外，施用外源GA3顯著促進毛竹實生苗莖稈纖維細胞伸長。研究表明，細胞伸長生長是在膨壓的驅使下，初生壁纖維素發(fā)生重排，由垂直于生長軸到與生長軸平行，最終導致細胞伸長[15]。擬南芥CesA1基因磷酸化位點發(fā)生突變后，導致其根尖發(fā)生徑向膨脹。表明，外源GA3可能影響到初生壁纖維素合成或重排，還有待進一步的研究證實。

采用qRT-PCR技術檢測了毛竹實生苗莖稈中CesA基因的相對表達水平。與對照相比，施用外源GA3顯著促進了毛竹實生苗初生壁纖維素合成相關的PeCesA2,6，顯著抑制了次生壁纖維素合成相關的PeCesA4,4-1及初生壁相關基因PeCesA3,5，而PeCesA1沒有明顯變化，這與高粱中GA3正調控初生壁相關基因SbCesA1,3,6的研究結果一致[3]，但毛竹實生苗莖稈中并不是所有初生壁相關CesA基因表達都上調，其原因可能是不同物種之間存在差異或初生壁相關CesA基因具有組織表達特異性且具有不同功能[19]。PeCesA2,6可能在毛竹實生苗莖稈纖維細胞伸長過程中具有重要作用，還有待進一步研究。此外，本試驗表明，隨著外源GA3濃度提高，纖維素特征吸收峰1 060，1 160及1 373 cm-1的吸收強度增加。CesA是纖維素合成的關鍵基因[20～21]，通常纖維含量主要由次生壁纖維素含量決定。但是本研究表明，施用外源GA3后，次生壁纖維素合成相關基因PeCesA4,4-1顯著下調，這可能是因為取樣時毛竹實生苗還處于幼苗階段，此時細胞可能還處于伸長生長階段，莖稈中的纖維主要由初生壁纖維素提供。研究表明，在細胞膨脹過程中纖維素會不斷合成并組裝到初生壁中[22]，說明在毛竹實生苗莖稈中初生壁纖維素合成可能主要由PeCesA2,6負責。關于這一點有待下一步更充分的研究證實。因此，外源GA3對毛竹CesA基因表達、莖節(jié)間長度、纖維細胞長度和纖維素合成起到了調控作用。CesA基因是纖維素合成及植物生長發(fā)育的關鍵基因，施用GA3可以調控CesA基因表達，對研究竹類植物CesA基因的調控機制提供了理論依據，為毛竹遺傳改良研究提供理論依據。

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National Natural Science Foundation of China(31400257，31400333)；Breeding Program Fund project by the 13th Five-year plan of Sichuan province(2016NYZ0038)；Fund of Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan province(12zxsk07，13zxsk01)；Graduate innovation fund of Southwest University of Science and Technology(16ycx068)

introduction：JIANG Yong(1991—)，male，master，research mainly focus on plant genetics and variety improvement.

date:2017-02-21

EffectsofExogenousGA3ontheGrowthofStemandCesAGeneExpressioninPhyllostachysedulisSeedling

JIANG Yong1,2HU Shang-Lian1,2*CAO Ying1,2LU Xue-Qin1,2HUANG Yan1,2XU Gang1,2

(1.Lab of Plant Cell Engineering,School of life science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010)

We studied the growth of stem andCesAgene expression from the seedling inPhyllostachysedulisunder the different concentration of exogenous GA3(0, 0.1, 0.5, 1 μmol·L-1). Compared with without GA3treatment, the internode and fiber cells of stem from the seedling elongated significantly, after treated by exogenous GA3. The relative expression of primary wall-relatedPeCesA2 andPeCesA6 genes were significantly up-regulated, while that of secondary wall-relatedPeCesA4 andPeCesA4-1 genes were significantly down-regulated. By Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR), the absorption intensity of characteristic cellulose peak(1 060, 1 160 and 1 373 cm-1) from the stems enhanced with the increase of GA3concentration. Signifying the expression ofCesAgene could be affected by the exogenous GA3. The expression ofPeCesA2 andPeCesA6 genes could be related to the process of fiber cells elongation.

Phyllostachysedulisseedling;GA3;fiber cell;CesAgene

國家自然科學基金(31400257，31400333)；四川省“十三五”重點公關項目(2016NYZ0038)；四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心基金(12zxsk07，13zxsk01)；西南科技大學研究生創(chuàng)新基金(16ycx068)

姜勇(1991—)，男，碩士研究生，從事植物遺傳與品種改良研究。

* 通信作者：E-mail：hushanglian@126.com

2017-02-21

* Corresponding author：E-mail：hushanglian@126.com

S795.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.015