劉曙光，章思思，鄒振寧，馬紅梅，周有儉

(1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518033；2.南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.廣東醫(yī)科大學(xué)病理教研室，廣東 湛江 524023)

FOXC2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及組織中的表達(dá)及意義

劉曙光1，章思思2，鄒振寧3，馬紅梅1，周有儉1

(1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518033；2.南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.廣東醫(yī)科大學(xué)病理教研室，廣東 湛江 524023)

目的研究叉頭框C2(Forkhead box c2,FOXC2)在人非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞株和組織中的表達(dá)水平，并探討FOXC2與臨床病理因素的相關(guān)性。方法應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)FOXC2在人肺癌細(xì)胞株A549和H460中mRNA水平的表達(dá)情況，并與永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE進(jìn)行比較；應(yīng)用免疫組化(IHC)方法檢測(cè)FOXC2蛋白在66例NSCLC組織和8例癌旁肺組織中的表達(dá)情況，并分析FOXC2表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果肺癌細(xì)胞株A549和H460中FOXC2的mRNA表達(dá)水平高于永生化人肺上皮細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； FOXC2蛋白在NSCLC組織中表達(dá)高于癌旁組織，與肺癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、吸煙、組織學(xué)類型、分化程度和TNM分期無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論FOXC2可能在促進(jìn)NSCLC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，有望作為評(píng)估臨床肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

非小細(xì)胞肺癌；FOXC2；細(xì)胞株；免疫組織化學(xué)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率均占首位，其中非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%。NSCLC發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，涉及眾多癌基因和抑癌基因。叉頭框C2(Forkhead box c2,FOXC2)與多種惡性腫瘤相關(guān)，但與肺癌關(guān)系的研究仍處于起步階段。本實(shí)驗(yàn)初步探討了FOXC2在NSCLC癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H460和永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)病理系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS 及胰蛋白酶(HyClone公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒(全式金公司)。肺癌組織學(xué)標(biāo)本來(lái)自2008 年6 月至2014 年8 月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科和廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室共66例患者，術(shù)前均未接受放療或化療。病例包括男性48例，女性18例；年齡<60歲35例，≥60歲31例；有吸煙史40例，無(wú)吸煙史26例；鱗癌21例、腺癌45例；高中分化34例，低分化32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；TNM分期I期15例，II+Ⅲ51例。選取同期8例癌旁肺組織作對(duì)照。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞選用PRIM 1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3 d換液培養(yǎng)1次，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底壁大部分表面時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞株中FOXC2表達(dá)

采用RNA 抽提試劑盒抽提16HBE、A549和H460細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA保存于-80 ℃冰箱中備用。FOXC2定量PCR上游引物： CCTCCTGGTATCTCAACCACA；下游引物：GAGGGTCGAGTTCTCAATCCC。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括PCR primers 2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，RTproduct 2.0 μL，Rox 0.1 μL，蒸餾水5.9 μL。以U6為內(nèi)參，所測(cè)定的FOXC2的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

1.4免疫組化方法

所有組織均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm 連續(xù)切片，每例均行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)組織中FOXC2表達(dá)。FOXC2單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司，抗體稀釋比例1∶100。以PBS替代一抗做陰性對(duì)照，按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.5染色結(jié)果判斷

FOXC2為胞漿或細(xì)胞核著色。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(400 倍)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比對(duì)每例染片進(jìn)行綜合評(píng)分，染色強(qiáng)度判分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未著色為0 分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比判分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0分；5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分；>75% 為4分。以染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分之和作為染色結(jié)果的判定，陰性或低表達(dá)：0～3分；高表達(dá)：≧4分[1]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FOXC2在肺細(xì)胞株中的表達(dá)情況

Real-time PCR 檢測(cè)兩種肺癌細(xì)胞株及永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE FOXC2的表達(dá)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXC2在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯高于16HBE(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 FOXC2在肺癌組織中的表達(dá)與肺癌病理因素相關(guān)性

癌旁肺組織中FOXC2蛋白不表達(dá)或僅有少量表達(dá)(圖2A)。在NSCLC組織中的主要顯示胞漿陽(yáng)性(圖2B、2C)，其陽(yáng)性表達(dá)率為31.82%；FOXC2蛋白表達(dá)水平與肺癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、吸煙、組織學(xué)類型、分化程度和TNM分期無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 FOXC2表達(dá)與肺癌各項(xiàng)病理因素相關(guān)性(例)

3 討論

肺癌是腫瘤所致死亡的首要原因，NSCLC約占總數(shù)的85%。盡管在治療策略上有了很大的進(jìn)展，但肺癌患者的預(yù)后仍然很差，5年生存率小于15%。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段和多基因參與的過(guò)程，在此過(guò)程中常常伴有癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因改變以及端粒酶活性的增加。肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制也十分復(fù)雜，涉及癌細(xì)胞和宿主兩方面之間的相互作用，細(xì)胞黏附下降、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、細(xì)胞骨架改變、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤微環(huán)境的變化等在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。雖然現(xiàn)階段已知有很多癌基因和抑癌基因如Kras、EGFR、P53等參與了NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展，但針對(duì)NSCLC的異常信號(hào)通路研究及靶向治療還處于初始階段，這就提示我們尋找新的有意義的分子標(biāo)記物，對(duì)預(yù)測(cè)患者預(yù)后，開(kāi)發(fā)有效的治療措施、提高NSCLC的生存率具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)效益。

FOXC2屬叉頭框(Forkhead box,Fox)蛋白家族的一員。FOX蛋白家族是一類DNA 結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，至少有34個(gè)家族成員，其功能涉及發(fā)育、細(xì)胞周期、脂類代謝等生物學(xué)特性[2]。文獻(xiàn)報(bào)道FOXC2可通過(guò)激活起動(dòng)子直接誘導(dǎo)CXCR4和integrin-β3轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管和淋巴管生成[3]。FOXC2還可通過(guò)誘導(dǎo)Wnt5a基因調(diào)節(jié)骨母細(xì)胞分化[4]。多項(xiàng)研究顯示，F(xiàn)OXC2在胃癌[1]、乳腺癌[5]、食管癌[6]等多種腫瘤中表達(dá)異常，F(xiàn)OXC2高表達(dá)與肝外膽管癌[7]、胃癌[1]和乳腺基底樣細(xì)胞癌[8]臨床進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。近年來(lái)的研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移中被激活的關(guān)鍵過(guò)程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2是EMT的重要調(diào)節(jié)者，在乳腺基底細(xì)胞癌中，F(xiàn)OXC2可誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Twist，Snail，Goosecoid和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)，F(xiàn)OXC2的過(guò)表達(dá)還能促進(jìn)間質(zhì)分化，并誘導(dǎo)MMP2和MMP9的表達(dá)[8-9]。EMT也在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中扮演著重要角色，其中FOXC2參與了這一重要的過(guò)程[10]。Mortazavi 等[11]證明FOXC2 在NSCLC細(xì)胞直接下調(diào)p120-catenin 的表達(dá)量來(lái)影響E-cad 的作用，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附穩(wěn)定性缺失，上皮細(xì)胞極性喪失，EMT 發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2在肺癌細(xì)胞株A549和H460中mRNA的表達(dá)水平明顯高于永生化人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE，提示FOXC2基因可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。免疫組化則顯示，F(xiàn)OXC2 在肺癌組織伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中表達(dá)率增高，推測(cè)與其兩作用機(jī)制有關(guān)：(1)FOXC2可促進(jìn)血管和淋巴管生成，有助于肺癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；(2)FOXC2參與EMT的發(fā)生，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道FOXC2蛋白表達(dá)與TNM分期、吸煙史和患者生存期相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)受樣本量少、缺少隨訪資料等條件限制，未能觀察到上述結(jié)論，但根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果初步推斷過(guò)表達(dá)的FOXC2很有可能參與了肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)示患者有不良預(yù)后。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)OXC2可能參與NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移；檢測(cè)FOXC2 表達(dá)有助于判斷患者的病情進(jìn)展，也為尋找NSCLC的預(yù)后指標(biāo)提供了新方向。

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ExpressionofFOXC2incelllinesandtissuesofnonsmallcelllungcanceranditsclinicalsignificance

LIU Shu-guang1,ZHANG Si-si2,ZOU Zhen-ning3,MA Hong-mei1,ZHOU You-jian1

(DepartmentofPathology,1.TheEighthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity，Shenzhen518033;2.SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515;3.DepartmentofPathology,GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang524023,Guangdong,China)

Objective：To explore the expression of FOXC2 in NSCLC cell lines and tissues,and analyze the correlation between FOXC2 protein expression and clinicopathological factors.MethodsThe expressions of FOXC2 mRNA in NSCLC cell lines A549 and H460 were detection by RT-PCR,and 16HBE cell line were compared,Then,the expression of FOXC2 proteins in 66 non small cell lung cancer tissues and 8 paracancerous tissues were determined with immunohistochemical study,and the relationship between the expression of FOXC2 and clinical pathological factors in NSCLC patients was analyzed.ResultsThe expression levels of FOXC2 mRNA in A549 and H460 cell lines were significantly higher than that in 16HBE cell line,and the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of FOXC2 protein in NSCLC was higher than that in paracancerous tissues,and was closely related to lymph node metastasis in lung cancer tissues (P<0.05),but was not related to age,gender,smoke history,histological type,differentiation and TNM stage.ConclusionFOXC2 overexpression may play an important role in the malignant progression of NSCLC,and may be used as an index to evaluate the prognosis of patients with lung cancer.

Non small cell lung cancer;FOXC2;Cell line;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.002

深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項(xiàng)目(FTWS2015017)

2017-05-28

劉曙光(1971-)，男，博士，副主任醫(yī)師。E-mail:SGL3016@163.com

時(shí)間： 2017-10-10 02∶27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0227.006.html

1005-3697(2017)05-0656-03

R734.2

A

(學(xué)術(shù)編輯何欣蓉)

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