羅紅，王春花，趙玲璐，楊宇，陳世平，徐旖旎，楊紅宇，沈祥春#（.貴州醫(yī)科大學貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室，貴陽 55005；.貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴陽 55005）

·實驗研究·

丹酚酸B抗心肌纖維化的機制研究Δ

羅紅1，2＊，王春花1，趙玲璐1，楊宇1，陳世平1，徐旖旎1，楊紅宇2，沈祥春1#（1.貴州醫(yī)科大學貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴陽 550025）

目的：研究丹酚酸B（Sal B）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌成纖維細胞增殖、Ⅲ型膠原分泌及基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響，探討其抗心肌纖維化的作用機制。方法：將細胞分為空白對照組（培養(yǎng)液）、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組（12.5、25、50 μmol/L），用空白或含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞1 h后，除空白對照組外的其余各組均加入1 μmol/L的AngⅡ誘導細胞增殖，共同作用24 h。分別采用MTT法和蘇木精-伊紅染色法考察Sal B對細胞增殖的影響；采用Western blot法檢測Sal B對細胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響。結果：與空白對照組比較，AngⅡ模型組細胞明顯增殖，Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達明顯增強，Smad7蛋白表達明顯減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ模型組比較，Sal B各濃度組細胞的增殖均受到抑制，Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達均減弱，Smad7蛋白表達均增強，除Sal B低、中濃度組細胞Ⅲ型膠原與Sal B高濃度組細胞Smad2/3蛋白表達變化不顯著外，其余各指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：Sal B抗心肌纖維化的作用可能與抑制心肌成纖維細胞的增殖，下調Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白表達和上調Smad7蛋白表達有關。

丹酚酸B；心肌成纖維細胞；Ⅲ型膠原；基質金屬蛋白酶9；轉化生長因子β1信號通路

心肌纖維化所導致的心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴重并發(fā)癥已逐漸成為心血管疾病死亡的主要原因。而心肌成纖維細胞是心肌纖維化的主要效應細胞，當心臟受到損傷時，心肌成纖維細胞的數(shù)目增多，表型分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞又通過分泌更多的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和上調基質金屬蛋白酶（MMP）的表達等方式抑制細胞外基質降解，使心肌膠原纖維成分不成比例地增多、排列紊亂，心肌間質膠原合成和降解比例失調，導致心室壁的僵硬度增加、心室壁的順應性降低，從而嚴重影響心臟正常的生理功能[1]。丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）為丹參的主要水溶性成分，具有很強的抗氧化活性。本課題組前期研究表明，Sal B能顯著抑制轉化因子β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）誘導的心肌成纖維細胞的增殖[2-3]，但目前對于其抗心肌纖維化的作用機制尚不清楚。因此，本研究主要從Sal B對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導心肌成纖維細胞增殖活性，細胞Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白表達以及TGF-β1信號通路這3個方面的影響來探索其抗心肌纖維化的作用及機制。

1 材料

1.1 儀器

ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀（美國GE公司）；TDL-4ZB臺式自動平衡離心機（湖南星科科學儀器有限公司）；BS223S電子天平（北京賽多利斯儀器系列有限公司）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；CFX凝膠成像系統(tǒng)儀、電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

Sal B原料藥（上海阿拉丁試劑有限公司，批號：46595，純度：＞98%）；AngⅡ（美國Sigma公司，批號：1401558214，純度：＞97%）；SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：PV-6002）；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、增強化學發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術公司，批號：P0012AC-1、P0018A）；兔源Ⅲ型膠原、Smad2/3多克隆抗體（美國ImmunoWay公司，批號：B3201、B3201）；兔源波形蛋白、MMP-9、Smad7多克隆抗體（武漢博士德有限公司，批號：BM0135、2844710、12F81）；山羊抗兔二抗（上海拜力生物科技有限公司，批號：2000-0003）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab9485）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠10只，鼠齡1～3 d，♀♂不限，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK-（黔）2012-001。

2 方法

2.1 心肌成纖維細胞的分離純化

將大鼠用75%乙醇進行皮膚消毒后，固定四肢，胸部向上，用75%乙醇分別消毒胸腹部皮膚，用虹膜剪剪開胸部皮膚及肋骨，暴露心臟；取下正在搏動的心尖部份，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈殘留血污，將組織放入含有青霉素和鏈霉素的PBS的安瓿小瓶中，轉入超凈臺，用虹膜剪剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的碎塊，PBS洗3次；加入0.125%的胰酶，放入4℃冰箱進行冷消化6 h，取出吸棄胰酶；再加入0.125%的胰酶后放入培養(yǎng)箱進行熱消化5 min，重復4次，每次都收集消化的細胞懸液。終止消化后，以離心半徑為9.6 cm、1 000 r/min離心10 min，收集細胞沉淀。采用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，然后接種于細胞培養(yǎng)瓶中，90 min后進行差速貼壁，以純化心肌成纖維細胞。

2.2 心肌成纖維細胞的鑒定

用3～5代的心肌成纖維細胞制備細胞爬片，然后以4%多聚甲醛固定，采用0.5%Triton X-100試劑破膜20 min；3%過氧化氫孵育，山羊血清封閉，依次用1∶200稀釋的兔源波形蛋白多克隆抗體、山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶孵育后，二氨基聯(lián)苯胺顯色至棕黃色；乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照，若胞漿染成棕黃色則判定為陽性；并于顯微鏡下進行細胞計數(shù)，計算陽性細胞率。

2.3 Sal B對AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖的影響

2.3.1 MTT法測定細胞增殖活性 將細胞接種于96孔板中，用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，加入新鮮DMEM對細胞進行同步12 h。將細胞分為AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組，并另設只加DMEM培養(yǎng)液不加藥物的空白對照組和只加培養(yǎng)液不加細胞的調零孔，每組設6個復孔。Sal B低、中、高濃度組細胞分別加入12.5、25、50 μmol/L的Sal B預處理1 h后，加入AngⅡ（終濃度為1 μmol/L）；AngⅡ模型組細胞不加Sal B預處理，直接加入AngⅡ（終濃度為1 μmol/L）。培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗細胞3次，每孔加入200 μL的二甲基亞砜（DMSO）和 20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)后，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，以OD值的大小表示細胞的增殖活性。

2.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察細胞增殖情況 制備細胞爬片，試驗設置空白對照組、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組。Sal B低、中、高濃度組加入12.5、25、50 μmol/L的Sal B預處理1 h后，加入AngⅡ（1 μmol/L）；AngⅡ模型組細胞不加Sal B預處理，直接加入AngⅡ（1 μmol/L）誘導細胞增殖。作用24 h后，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗細胞3次，然后加入4%多聚甲醛固定，蘇木精染色15～20 min，95%的乙醇潤洗5 s，伊紅染色20 min。鏡檢，著色滿意后拍照觀察細胞增殖情況。

2.4 Western blot法檢測細胞中蛋白的表達

將處于對數(shù)生長期的同一批細胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，按“2.3”項下方法分組和給藥處理。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)上清液，用預冷的PBS漂洗細胞3次，加入裂解液和苯甲基磺酰氟裂解細胞并提取總蛋白。蛋白定量后，取總蛋白50 μg加入上樣緩沖液中煮沸3 min變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉至聚偏二氟乙烯膜上，3%牛血清白蛋白封閉后與兔源Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7多克隆抗體（1∶200～1∶1 000）4℃孵育過夜，然后加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育90 min。增強化學發(fā)光液作用1 min后曝光，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對所有選擇的目標條帶灰度值進行分析，最后用內參GAPDH對各目標條帶進行均一化處理，試驗重復3次。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 心肌成纖維細胞的鑒定結果

免疫化學染色后，光鏡下可見細胞呈梭形或多角形，細胞質被染成棕黃色，呈陽性反應，符合成纖維細胞的染色特征，且其純度大于99%，結果見圖1。

圖1 心肌成纖維細胞的鑒定結果（×200）Fig 1 Identification results of cardiac fibroblasts（ ×200）

3.2 Sal B對AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖的影響結果

3.2.1 MTT試驗結果 與空白對照組比較，AngⅡ模型組細胞的OD值明顯升高（P＜0.01），提示加入AngⅡ后可促進細胞增殖；與AngⅡ模型組比較，Sal B低、中、高濃度組細胞的OD值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示Sal B預處理可抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞的增殖。空白對照組、AngⅡ模型組和Sal B低、中、高濃度組細胞的OD值分別為0.49±0.03、0.64±0.04、0.55±0.01、0.54±0.01、0.51±0.04（n＝6）。

3.2.2 HE染色結果 HE染色后，可見細胞的胞核被染成藍色或淡藍色，胞漿為淡紅色，細胞形態(tài)飽滿，細胞膜完整。與空白對照組比較，AngⅡ模型組細胞增生活躍，胞體稍微增大，數(shù)量明顯增多；與AngⅡ模型組比較，Sal B各濃度組細胞的數(shù)量明顯減少，結果見圖2。

圖2 各組細胞的HE染色觀察結果（×200）Fig 2 Results of HE staining of cells in each group（ ×200）

3.3 Sal B對AngⅡ誘導心肌成纖維細胞中蛋白表達的影響結果

與空白對照組比較，AngⅡ模型組細胞中Ⅲ型膠原、MMP-9和Smad2/3蛋白表達均顯著增強（P＜0.05），Smad7蛋白表達顯著減弱（P＜0.05）；與AngⅡ模型組比較，Sal B低、中濃度組細胞中MMP-9、Smad2/3蛋白表達和Sal B高濃度組細胞中Ⅲ型膠原、MMP-9蛋白表達均顯著減弱（P＜0.05），Sal B各濃度組細胞中Smad7蛋白表達均顯著增強（P＜0.05）。蛋白電泳結果見圖3，測定結果見表1。

圖3 各組細胞中Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達電泳圖Fig 3 Electrophoresis chart of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group

表1 各組細胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group（±s，n＝3）

表1 各組細胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表達測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7 of cells in each group（±s，n＝3）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與AngⅡ模型組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.AngⅡ model group，#P＜0.05

組別空白對照組AngⅡ模型組Sal B低濃度組Sal B中濃度組Sal B高濃度組Smad7 1.00±0.00 0.44±0.01＊0.52±0.22#0.95±0.01#1.40±0.04#濃度，μmol/L 1 12.5 25 50Ⅲ型膠原1.00±0.00 2.19±0.48＊1.19±0.30 1.10±0.35 0.91±0.30#MMP-9 1.00±0.00 1.35±0.040＊0.72±0.01#0.70±0.01#0.59±0.02#Smad2/3 1.00±0.00 1.70±0.16＊0.42±0.01#0.76±0.15#1.69±0.28

4 討論

心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)生發(fā)展中心臟組織的共同病理改變，心肌纖維化導致的并發(fā)癥已成為心血管疾病死亡的主要原因。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展都與心肌成纖維細胞增殖、過度分泌膠原及MMP有著十分緊密的聯(lián)系[3]。Sal B抗心肌纖維化的作用在一些動物實驗中已被證實[4]，但是其對心肌成纖維細胞的作用目前報道較少。過度的膠原沉積是心肌纖維化最主要也是最重要的特點，減少膠原蛋白的表達也是評價抗纖維化藥物最直觀的指標之一[5]。本研究結果顯示，Sal B可以明顯減少細胞中Ⅲ型膠原的產生，從而發(fā)揮其抗心肌纖維化的作用。

MMP及其抑制劑維持著心臟組織中細胞外基質的動態(tài)平衡，當MMP活性增高、MMP抑制劑活性降低時，細胞外基質降解減少，最終造成膠原的過度沉積[6]。因此，抑制MMP-9的活性可以改善心肌纖維化的程度。本研究結果顯示，低、中、高濃度的Sal B均可降低細胞中MMP-9蛋白的表達。

TGF-β1信號通路是目前已知的最強的促纖維化信號通路之一。該信號通路上調可以促進心肌成纖維細胞增殖，并促進其分化為心肌成纖維細胞，從而促進膠原的合成、抑制膠原的降解，最終導致細胞外基質的積聚，并可介導炎癥因子白細胞介素6產生，促進心肌纖維化的發(fā)展[7]。在TGF-β1信號通路中，TGF-β1受體主要是通過磷酸化Smads蛋白調節(jié)纖維化基因的表達，促進纖維化發(fā)展[8]。Smads蛋白可以分為3種，即受體調節(jié)Smads蛋白、共同介質型Smads蛋白和抑制性Smads蛋白。Smad2/3是受體調節(jié)Smads蛋白，與受體結合后，可上調TGF-β1信號通路相關蛋白的表達；Smad7是抑制性Smads蛋白，可競爭性地結合TGF-β1受體，阻止受體調節(jié)Smads蛋白磷酸化，從而阻斷TGF-β1信號通路效應[9]。本研究結果顯示，Sal B可以明顯下調Smad2/3蛋白的表達、上調Smad7的表達，抑制心肌成纖維細胞的異常增殖，減少Ⅲ型膠原和MMP-9的表達，從而發(fā)揮其抗心肌纖維化的作用。在本研究中，關于加入AngⅡ后細胞中Smad2/3、Smad7的變化規(guī)律與文獻[10]報道基本相符，但是加入Sal B后Smad2/3的變化趨勢卻是隨著Sal B濃度的增加而增強。筆者猜測可能由于低濃度是Sal B抑制細胞中Smad2/3蛋白表達的最佳濃度，在此濃度下Smad2/3蛋白的表達水平最低。關于Sal B抑制AngⅡ誘導細胞增殖后細胞中Smad2/3蛋白表達的變化規(guī)律還需要設計更多的試驗進行驗證。

綜上所述，Sal B抗心肌纖維化的作用機制可能與其抑制心肌成纖維細胞的增殖，下調細胞Ⅲ型膠原、MMP-9、Smad2/3蛋白的表達及上調Smad7蛋白的表達有關，但其更多的作用機制有待進一步證實。

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Study on the Mechanism of Anti-myocardial Fibrosis of Salvianolic Acid B

LUO Hong1，2，WANG Chunhua1，ZHAO Linglu1，YANG Yu1，CHEN Shiping1，XU Yini1，YANG Hongyu2，SHEN Xiangchun1（1.The High Educational Key Laboratory of Guizhou Province for Natural Medicinal Pharmacology and Druggability，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.The Laboratory Animal Center of Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To study the effects of salvianolic acid B（Sal B）on angiotensinⅡ（AngⅡ）-induced cardiac fibroblast proliferation，secretion of type Ⅲ collagen，protein expressions of matrix metalloproteinase 9（MMP-9），Smad2/3，Smad7，and explore its mechanism of anti-myocardial fibrosis.METHODS：Cells were divided into blank control group（culture medium）Ang Ⅱ model group，Sal B low-dose，medium-dose，high-dose groups（12.5，25，50 μmol/L）.After cultured 1 h by blank or drug-containing culture，except for blank control group，cells in other groups were added 1 μmol/L Ang Ⅱ to induce proliferation.for 24 h.MTT method and hematoxylin-eosin staining method were adopted investigate the effect of Sal B on proliferation.Western blot method was adopted to detect the effects of Sal B on protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3，Smad7.RESULTS：Compared with blank control group，cells in AngⅡ model group were significantly proliferated，protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 were obviously enhanced，protein expression of Smad7 was obviously weakened，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with Ang Ⅱ model group，the cell proliferation in Sal B groups were inhibited，protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 were weakened，while protein expression of Smad7 was enhanced.Except the pro-tein expression of typeⅢ collagen in Sal B low-dose and medium-dose groups，the protein expression of Smad2/3 in Sal B high-dose group did not change significantly，other indexes had statistical significances（P＜0.05）.CONCLUSIONS：The anti-myocardial fibrosis effect of Sal B may be associated with inhibiting the proliferation of cardiac fibroblasts，down-regulating protein expressions of typeⅢ collagen，MMP-9，Smad2/3 and up-regulating protein expression of Smad7.

Salvianolic acid B；Cardiac fibroblasts；TypeⅢ collagen；Matrix metalloproteinase 9；Transforming growth factor β1signaling pathway

R541

A

1001-0408（2017）28-3900-04

2017-02-23

2017-08-12）

（編輯：林 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81560588）；貴州省科技合作計劃項目（No.黔科合LH字〔2016〕7356號）；貴州省科學技術基金項目（No.黔科合JZ字〔2015〕2002號）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目（No.黔科合人才〔2015〕4029號）；貴州醫(yī)科大學2015年高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No.201510660007）

＊實驗師，碩士。研究方向：心血管藥理學。電話：0851-86908928。E-mail：luohong1011@163.com

#通信作者：教授，博士生導師，博士。研究方向：心血管藥理學。電話：0851-88416149。E-mail：shenxiangchun@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.04