陳丹丹，謝曉芳，萬峰，劉莟，趙石，陳秋伶，陳延清，彭成#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都637；2.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川雅安 625000；3.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 637；.成都第一制藥有限公司，成都 6003）

氫溴酸樟柳堿對(duì)急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及ERK1/2磷酸化水平的影響Δ

陳丹丹1，2＊，謝曉芳1，3，萬峰4，劉莟1，趙石1，陳秋伶1，陳延清4，彭成1，3#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137；2.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗(yàn)系，四川雅安 625000；3.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；4.成都第一制藥有限公司，成都 610031）

目的：研究氫溴酸樟柳堿對(duì)急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）磷酸化（p-ERK1/2）水平的影響。方法：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（尼莫地平1.0 mg/kg）和氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量組（1.2、0.6、0.3、0.15 mg/kg），每組8只，采用線栓法建立大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型。分別于腦缺血2 h和再灌注6 h時(shí)對(duì)各組大鼠尾iv給藥1次，再灌注22 h后檢測(cè)各組大鼠腦組織三磷酸腺苷（ATP）酶活性、Ca2+含量、細(xì)胞凋亡情況、腦組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)和p-ERK1/2/總ERK1/2（t-ERK1/2）比例。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織ATP酶活性明顯降低、Ca2+含量明顯增加、凋亡細(xì)胞密度明顯增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度均明顯減小，陽(yáng)性對(duì)照組和氫溴酸樟柳堿高、低劑量組大鼠腦組織Ca2+含量均明顯降低，氫溴酸樟柳堿高、低、極低劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例均明顯增加，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：氫溴酸樟柳堿能抑制急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與激活ERK1/2信號(hào)通路和調(diào)節(jié)ATP酶活性，進(jìn)而降低腦組織Ca2+含量有關(guān)。

氫溴酸樟柳堿；急性腦缺血再灌注；大鼠；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2

缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)生率的80%以上，是腦卒中死亡的主要原因[1-2]。因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上仍缺乏有效的防治措施。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中造成患者腦組織損傷的機(jī)制主要為腦缺血再灌注損傷（CI/R）。因此需要積極研究對(duì)CI/R有確切治療作用的藥物，明確其作用機(jī)制。已有研究表明，樟柳堿能降低急性CI/R模型大鼠腦內(nèi)異常升高的鈣離子（Ca2+）含量和伊文思藍(lán)含量，減少腦組織水腫[3]。但對(duì)其作用機(jī)制缺乏進(jìn)一步的后續(xù)研究，阻礙了該品種的開發(fā)和推廣應(yīng)用。

本研究擬采用線栓法建立大鼠急性CI/R模型，尾iv給予氫溴酸樟柳堿進(jìn)行干預(yù)，從腦組織中三磷酸腺苷（Triphosadenine，ATP）酶活性、Ca2+含量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2磷酸化（p-ERK1/2）水平等方面進(jìn)一步研究氫溴酸樟柳堿對(duì)CI/R大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制，為該藥的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Enspire多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀（珀金埃爾默新加坡有限公司）；TDZ4A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡（廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氫溴酸樟柳堿原料藥（成都第一藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140903，純度：99%）；尼莫地平注射液（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)：BXGVZ71，規(guī)格：50 mL∶10 mg）；ATP酶測(cè)試盒（包括Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase）、Ca2+含量測(cè)試盒、蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160402、20160405、20160407）；原位末端標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏公司，批號(hào)：10279600）；兔源p-ERK1/2、總ERK1/2（t-ERK1/2）抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR210921-2、GR197011-16）；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：14MA18）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：109525）。1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量為280～320 g，購(gòu)自四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-19。本研究嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)要求。

2 方法

2.1 急性CI/R模型的建立

[4]方法并加以改良：術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，ip給予10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，分離頸總動(dòng)脈（CCA），結(jié)扎CCA近心端，分離頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎ECA、CCA處切口，在近心端距分叉處4 mm切口插入直徑為0.285 mm、頭端打磨光滑的魚線，使其垂直進(jìn)入ICA，插入長(zhǎng)度約為20 mm，以完全阻斷大腦中動(dòng)脈（MCA）的供血。缺血2 h時(shí)輕柔回抽魚線約10 mm，再灌注22 h。假手術(shù)組大鼠除不插入魚線外，其余操作同模型組。

2.2 分組與給藥

按照Longa EZ等[4]建立的五分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)于缺血2 h后對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分：0分為無明顯神經(jīng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走、意識(shí)喪失。選取評(píng)分為1～3分的大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)將其分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（尼莫地平1.0 mg/kg）和氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量組（1.2、0.6、0.3、0.15 mg/kg），每組8只；另設(shè)8只大鼠為假手術(shù)組。尼莫地平和氫溴酸樟柳堿的給藥劑量是在文獻(xiàn)[3，5]的基礎(chǔ)上結(jié)合藥物的臨床給藥劑量設(shè)計(jì)而成；氫溴酸樟柳堿原料藥使用前用超純水充分溶解并過0.22 μm微孔濾膜后備用。分別于大鼠腦缺血2 h和再灌注6 h時(shí)尾iv給予各組大鼠相應(yīng)藥物1次，共計(jì)給藥2次；模型組和假手術(shù)組大鼠尾iv給予超純水。

2.3 腦組織中ATP酶活性、Ca2+含量的測(cè)定

各組大鼠再灌注22 h后，麻醉，斷頭處死，取缺血側(cè)視交叉前冠狀切片腦組織約100 mg，按1∶9（m/V）加入冰冷生理鹽水，制成10%的腦組織勻漿，3 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心15 min，取上清液，按測(cè)試盒說明書操作測(cè)定ATP酶活性和Ca2+含量。

2.4 腦組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定

各組大鼠斷頭處死后，迅速選取缺血側(cè)視交叉附近約1 mm厚度的冠狀切片腦組織，10%甲醛溶液固定。每組隨機(jī)選取4只采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，每張切片選取3個(gè)典型區(qū)域采用BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡于400倍鏡下進(jìn)行圖像采集，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，取3個(gè)視野的平均值作為該樣本的凋亡細(xì)胞密度。

2.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)

每組隨機(jī)選取6只大鼠，取固定的腦組織脫水、包埋、切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，在3%甲醇雙氧水中室溫下放置10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，滴加山羊血清封閉液，室溫放置20 min，加入一抗兔源p-ERK1/2抗體，4℃下過夜；PBS漂洗，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃下放置30 min；PBS漂洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。于大鼠腦組織陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)隨機(jī)選擇3個(gè)不重復(fù)的200倍視野，采用Image Pro Plus 6.0成像分析系統(tǒng)分析計(jì)算其灰度值，每一樣本取3個(gè)視野計(jì)算平均值。其灰度值與p-ERK1/2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

2.6 Western blot法檢測(cè)腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例

每組隨機(jī)選取3只大鼠，取缺血側(cè)半暗帶附近固定解剖部位腦組織約50 mg，按1∶10（m/V）加入蛋白裂解液，提取腦組織蛋白，測(cè)定蛋白含量并定量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育后加入兔源p-ERK1/2、t-ERK1/2、GAPDH抗體，4℃封閉過夜，TBST緩沖液洗膜；然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG中，37℃孵育1 h；TBST緩沖液洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影液，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶成像。應(yīng)用Image-lab圖像處理軟件，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值評(píng)定目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，并計(jì)算p-ERK1/2/t-ERK1/2比例。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中3種ATP酶活性均降低、Ca2+含量增加（P＜0.01）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組大鼠均能在一定程度上提高3種ATP酶活性，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；氫溴酸樟柳堿高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織中Ca2+含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 Determination results of ATP enzyme activity and Ca2+content in brain tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表1 各組大鼠腦組織中ATP酶活性和Ca2+含量的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1 Determination results of ATP enzyme activity and Ca2+content in brain tissue of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

Ca2+，mmol/g prot 0.028 0±0.002 8 0.047 4±0.011 7＊＊0.034 3±0.015 4#0.029 5±0.016 4##0.038 1±0.009 6 0.035 2±0.014 6#0.035 6±0.011 4組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組氫溴酸樟柳堿高劑量組氫溴酸樟柳堿中劑量組氫溴酸樟柳堿低劑量組氫溴酸樟柳堿極低劑量組ATP酶，μmolPi/（mg prot·h）Na+-K+-ATPase 4.12±0.73 2.96±0.32＊＊3.26±0.36 3.02±0.74 3.34±0.53 3.65±0.69 3.34±1.34 Ca2+-Mg2+-ATPase 2.16±0.56 1.47±0.25＊＊1.58±0.26 1.66±0.54 1.84±0.25 1.92±0.23 1.84±0.78 Ca2+-ATPase 1.87±0.65 1.19±0.17＊＊1.41±0.27 1.33±0.46 1.45±0.20 1.64±0.75 1.27±0.49

3.2 腦組織細(xì)胞凋亡情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度明顯減?。≒＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的顯微鏡圖見圖1，凋亡細(xì)胞密度測(cè)定結(jié)果見表2。

圖1 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的顯微鏡圖（×400）Fig 1 Microscope figure of cell apoptosis in brain tissue of rats in each group（×400）

表2 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度、p-ERK1/2表達(dá)及p-ERK1/2/t-ERK1/2水平的測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 2 Determination results of density of cell apoptosis，p-ERK1/2 expression，p-ERK1/2/t-ERK1/2 level in brain tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度、p-ERK1/2表達(dá)及p-ERK1/2/t-ERK1/2水平的測(cè)定結(jié)果（±s）Tab 2 Determination results of density of cell apoptosis，p-ERK1/2 expression，p-ERK1/2/t-ERK1/2 level in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

p-ERK1/2/t-ERK1/2（n=3）0.195 3±0.021 8 0.219 4±0.038 3 0.240 0±0.020 4 0.528 4±0.039 2##0.230 4±0.012 8 0.275 2±0.006 6#0.379 8±0.037 3##組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組氫溴酸樟柳堿高劑量組氫溴酸樟柳堿中劑量組氫溴酸樟柳堿低劑量組氫溴酸樟柳堿極低劑量組凋亡細(xì)胞密度，個(gè)/視野（n=4）5.75±2.50 22.25±5.19＊＊10.50±3.87##7.75±2.75##16.25±3.20#15.50±3.51#12.75±1.50##p-ERK1/2灰度值（n=6）0.326 5±0.046 7 0.332 8±0.031 7 0.335 2±0.066 8 0.348 3±0.060 2 0.344 2±0.023 6 0.340 1±0.043 1 0.343 2±0.037 6

3.3 腦組織中p-ERK1/2蛋白表達(dá)變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中p-ERK1/2表達(dá)輕微增強(qiáng)（P＞0.05）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腦組織中p-ERK1/2表達(dá)均輕微增強(qiáng)（P＞0.05）。各組大鼠腦組織中p-ERK1/2灰度值的測(cè)定結(jié)果見表2。

3.4 腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例輕微增加（P＞0.05）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿高、低、極低劑量組大鼠腦組織中p-ERK1/2/t-ERK1/2比例均明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠腦組織中p-ERK1/2、t-ERK1/2蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，p-ERK1/2/t-ERK1/2比例的測(cè)定結(jié)果見表2。

圖2 各組大鼠腦組織p-ERK1/2、t-ERK1/2蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of p-ERK1/2 protein expression，t-ERK1/2 protein expression in brain tissue of rats in each group

4 討論

Ca2+超載是CI/R重要的發(fā)病機(jī)制。腦缺血時(shí)細(xì)胞膜去極化引起Ca2+內(nèi)流，加之膜磷脂降解及其產(chǎn)物均可引起ATP酶活性降低，進(jìn)而可能影響細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+的聚積、K+的流失，從而加速細(xì)胞的損傷，故提高ATP酶的活性可能有助于腦保護(hù)[6]。本研究中，各劑量氫溴酸樟柳堿均表現(xiàn)出一定的提高腦組織ATP酶活性的作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；氫溴酸樟柳堿在1.2、0.3 mg/kg劑量時(shí)能顯著降低腦組織Ca2+含量（P＜0.05或P＜0.01），表明其對(duì)抗CI/R的機(jī)制可能與提高腦組織ATP酶活性和降低腦組織Ca2+含量有關(guān)。

細(xì)胞的凋亡和壞死所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡幾乎是所有神經(jīng)退化性疾病的顯著特征。缺血神經(jīng)元凋亡具有延遲性，且呈可逆過程，這就為腦缺血的治療提供了時(shí)間[7]。盡管目前關(guān)于ERK信號(hào)通路在CI/R中的作用存在爭(zhēng)議，但一般認(rèn)為ERK是生存通路，其在神經(jīng)元的增殖分化以及抑制神經(jīng)元凋亡中起著重要作用[8]。本研究中各劑量氫溴酸樟柳堿均可顯著減少CI/R模型大鼠腦組織凋亡細(xì)胞密度（P＜0.05或P＜0.01），除0.6 mg/kg劑量外均能顯著提高腦組織p-ERK1/2/t-ERK1/2水平（P＜0.05或P＜0.01），提示氫溴酸樟柳堿能對(duì)抗腦組織細(xì)胞凋亡，ERK1/2信號(hào)通路的激活可能是其作用的分子機(jī)制之一。

同時(shí)有研究提示，ERK激活后可降低N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體活性，抑制Ca2+內(nèi)流，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[9]。本研究中氫溴酸樟柳堿高、低劑量組p-ERK1/2/t-ERK1/2顯著升高，而腦組織Ca2+含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），該結(jié)果與文獻(xiàn)[9]報(bào)道吻合。

綜上，氫溴酸樟柳堿能抑制急性CI/R模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與激活ERK1/2信號(hào)通路和調(diào)節(jié)ATP酶活性，進(jìn)而降低腦組織Ca2+含量有關(guān)。

本研究中，不同劑量氫溴酸樟柳堿對(duì)各指標(biāo)的影響存在差異，指標(biāo)變化與給藥劑量變化趨勢(shì)不完全一致。結(jié)合本模型和藥物本身的特點(diǎn)分析其原因可能有以下幾方面：（1）腦缺血是一個(gè)復(fù)雜的快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)的病理過程，涉及Ca2+超載、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、氮化應(yīng)激、能量代謝障礙、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等諸多環(huán)節(jié)[10]。本研究是在不確定氫溴酸樟柳堿作用靶點(diǎn)和劑量的情況下從Ca2+超載和細(xì)胞凋亡方面進(jìn)行了初步探討，可能無法很好體現(xiàn)其量效相關(guān)性。（2）氫溴酸樟柳堿屬于莨菪烷類生物堿，目前的研究報(bào)道顯示，莨菪烷類生物堿尚可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、保護(hù)線粒體、調(diào)節(jié)血管與血流等諸多方面對(duì)抗CI/R，由此筆者推測(cè)氫溴酸樟柳堿對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖饔冒悬c(diǎn)可能也不是單一的而是多機(jī)制的。但其在不同的機(jī)制方面的藥效劑量存在差異，而對(duì)模型的治療結(jié)果是這多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，從而導(dǎo)致本研究結(jié)果的量效正相關(guān)不典型。再則，樟柳堿對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力也呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用，即在大于2.5 mg/kg時(shí)會(huì)損傷記憶，但在0.5 mg/kg以下則能促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶，表明樟柳堿的量效關(guān)系可能非傳統(tǒng)的量效正相關(guān)。但上述猜測(cè)還有待進(jìn)一步研究以證實(shí)。

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Effects of Anisodine Hydrobromide on Cell Apoptosis and ERK1/2 Phosphorylation Level in Brain Tissue of Model Rats with Acute Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

CHEN Dandan1，2，XIE Xiaofang1，3，WAN Feng4，LIU Han1，ZHAO Shi1，CHEN Qiuling1，CHEN Yanqing4，PENG Cheng1，3（1.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.Dept.of Pharmacy and Examination，Ya’an Polytechnical College，Sichuan Ya’an 625000，China；3.State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Education，Chengdu 611137，China；4.Chengdu No.1 Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 610031，China）

OBJECTIVE：To study the effects of anisodine hydrobromide on cell apoptosis and extracellular signal-regulated protein kinase 1/2（ERK1/2）phosphorylation（p-ERK1/2）level in brain tissue of model rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury.METHODS：Rats were randomly divided into sham operation group，model group，positive control group（nimodipine 1.0 mg/kg），anisodine hydrobromide high-dose，medium-dose，low-dose，extreme low-dose groups（1.2，0.6，0.3，0.15 mg/kg），8 in each group.Suture method was used to establish the rat models with acute cerebral ischemia-reperfusion injury.Rats were intravenously injected once in tail at 2nd of ischemia and 6th of reperfusion.Then adenosine triphosphate（ATP）enzyme activity，Ca2+content，cell apoptosis in brain tissue，p-ERK1/2 protein expression in brain tissue，and p-ERK1/2/total ERK1/2（t-ERK1/2）proportion in brain tissue of rats were detected after 22 h of reperfusion.RESULTS：Compared with sham operation group，ATP enzyme activity in brain tissue of rats in model group was obviously decreased，Ca2+content was obviously increased，density of cell apoptosis in brain tissue was obviously increased，with statistical significances（P＜0.01）.Compared with model group，density of cell apoptosis in brain tissue was obviously decreased in each administration group；Ca2+contents in brain tissue of rats in positive control group，anisodine hydrobromide high-dose，low-dose groups were obviously decreased；and p-ERK1/2/t-ERK1/2 proportion in brain tissue of rats in anisodine hydrobromide high-dose，low-dose，extreme low-dose groups were obviously increased，with statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）；the other differences were not statistically significant（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Anisodine hydrobromide can inhibit the cell apoptosis in brain tissue of model rats with acute cerebral ischemia-reperfusion injury，and the mechanism may be related with activating ERK1/2 signal pathway and regulating ATP enzyme activity to decrease the Ca2+content in the brain tissue.

Anisodine hydrobromide；Acute cerebral ischemia-reperfusion； Rats； Cellapoptosis； Extracellularsignal-regulated protein kinase 1/2

R965

A

1001-0408（2017）28-3907-04

2016-12-01

2017-04-24）

（編輯：鄒麗娟）

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目（No.J1310034）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.16ZC1731）

＊講師，博士。研究方向：疾病動(dòng)物模型與中藥復(fù)方藥理。電話：028-61800231。E-mail：chendandan619@126.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：疾病動(dòng)物模型與中藥復(fù)方藥理。電話：028-61800231。E-mail：pengchengchengdu@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.06