姚旺林，劉理金，徐訓(xùn)安，叢波，張加廷，張仲文

（武警總醫(yī)院 骨科，北京 100039）

損傷軟骨的細(xì)胞提取、鑒定及生物學(xué)活性研究*

姚旺林，劉理金，徐訓(xùn)安，叢波，張加廷，張仲文

（武警總醫(yī)院 骨科，北京 100039）

目的 對(duì)從膝關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)分離出的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)活性進(jìn)行研究，以解決自體軟骨細(xì)胞移植中軟骨細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題。方法 通過(guò)膝關(guān)節(jié)鏡，在軟骨損傷區(qū)取少量損傷軟骨組織，不含正常軟骨及軟骨下骨為實(shí)驗(yàn)組；取正常軟骨組織為對(duì)照組。在胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶作用下從實(shí)驗(yàn)組中提取細(xì)胞，對(duì)照組中提取正常軟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)是否與對(duì)照組軟骨細(xì)胞一致。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞行甲苯胺藍(lán)染色鑒定，與對(duì)照組對(duì)比；噻唑藍(lán)（MTT）法比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)活性；以具有專(zhuān)利知識(shí)產(chǎn)權(quán)的Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜為生長(zhǎng)載體，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第3代軟骨細(xì)胞，在電鏡下觀察兩組生長(zhǎng)活性。結(jié)果 從少量損傷的軟骨組織中提取的細(xì)胞為活性正常的軟骨細(xì)胞，其特征及生長(zhǎng)活性與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 軟骨損傷過(guò)程中軟骨細(xì)胞未發(fā)生變性，少量損傷的軟骨組織仍可獲得適量軟骨細(xì)胞，MTT法和電鏡掃描表明，其生長(zhǎng)活性符合自體軟骨細(xì)胞移植的要求，無(wú)需取正常軟骨組織作為細(xì)胞來(lái)源。

損傷軟骨；軟骨細(xì)胞；自體軟骨細(xì)胞移植

Abstract:Objective To identify the cells isolated from injured cartilage tissue and study their growth activity,in order to provide adequate cells for autologous chondrocyte transplantation.Methods Through the knee arthroscope,a small amount of injured cartilage tissue was taken in the cartilage damage zone as experimental group,which did not include the normal cartilage or the subchondral bone.The normal cartilage wastaken ascontrolgroup.The cellswere extracted from the experimentalgroup,and the normal chondrocytes were extracted from the control group by trypsin and typeⅡ collagenase.The cells of the experimental group were observed under inverted phase contrast microscope to dentify whether the cell morphology was consistent with the chondrocytes of the control group.The cells of the experimental group were identified with toluidine blue staining,and compared with the chondrocytes of the control group.Cell growth activity of the two groups was compared by MTT method.The third generation chondrocytes of the two groups were cultured on type Ⅰ/Ⅱ composite collagen membrane with patent intellectual property,and their growth activity was observed under electron microscope.Results The cells extracted from injured cartilage tissue were normal chondrocytes,and their characteristics and growth activity were not different from those of the control group (P＜0.05).Conclusions In the process of cartilage injury,the cartilage cells do not degenerate.Appropriate amount of chondrocytes can be obtained from a small amount of injured cartilagetissue,it is proved that the growth activity is in accordance with the requirements of autologous chondrocyte transplantation by MTT method and electron microscopy.As a result,we do not need the normal cartilage tissue as a cell source.

Keywords:injured cartilage;chondrocyte;autologous chondrocyte transplantation

軟骨損傷是一種常見(jiàn)的疾病，軟骨損傷后不能自我修復(fù)[1-2]，傳統(tǒng)的治療方法效果并不滿意。自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)受到醫(yī)療界的青睞[3-5]，但軟骨細(xì)胞來(lái)源卻不豐富。正常、非負(fù)重膝關(guān)節(jié)區(qū)作為獲得細(xì)胞重要來(lái)源[6]，使患者受2次創(chuàng)傷。本研究在胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶作用下，從少量損傷軟骨組織中提取軟骨細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和生物活性觀察，驗(yàn)證軟骨損傷區(qū)獲得的細(xì)胞是否為正常軟骨細(xì)胞，及其作為細(xì)胞移植種子細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)室制備的Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜（武警實(shí)驗(yàn)中心自備，專(zhuān)利號(hào)：201310234061.X），改良Eagle培養(yǎng)液達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（北京雷根生物技術(shù)有限公司），0.2%Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素-鏈霉素混合液、臺(tái)盼藍(lán)染液、1%甲苯胺藍(lán)染液、4%多聚甲醛（購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索萊寶公司），無(wú)水乙醇（北京化工廠），2.5%戊二醛（濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司），1%鋨酸（成都艾科達(dá)化學(xué)技術(shù)有限公司），噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]法（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 損傷軟骨的獲取 關(guān)節(jié)鏡下對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行探查，找到軟骨損傷區(qū)，且選取未傷及軟骨下骨區(qū)域?yàn)槿〔狞c(diǎn)，明確后對(duì)損傷區(qū)域表面以刨刀處理，去除表面毛絮，以確保獲得的組織中軟骨組織量。將獲得的軟骨組織放置于含PBS緩沖液的無(wú)菌離心管中，轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。見(jiàn)圖1。

圖1 關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷區(qū)

1.2.2 原代細(xì)胞的分離 將手術(shù)室取出的少量損傷軟骨組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌生物安全操作臺(tái)。取10ml離心加PBS緩沖液至5 ml，放置天平稱(chēng)重，其重量計(jì)為W1；將取下的軟骨組織放入離心管中，再次稱(chēng)重，其重量記為W2，軟骨組織重量=W2-W1。步驟：①含雙抗的PBS液漂洗3次后吸出PBS液，加入等體積的0.25%胰蛋白酶，放入震蕩器，37℃、205 r/min震蕩30 min；②向離心管內(nèi)加入等體積培養(yǎng)基終止胰酶消化，1 300 r/min離心5 min，吸走液體獲得沉淀的軟骨組織；③離心管中加入2倍軟骨體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，放入震蕩器，37℃、205 r/min 震蕩 1 h，1 300 r/min離心5 min，將含細(xì)胞的上清液吸入另一10 ml離心管中，并加入等體積的培養(yǎng)基終止消化備用；④原有含軟骨沉淀的離心管（B管）再加入2倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，重復(fù)第3步直至軟骨組織消化結(jié)束；⑤所有含細(xì)胞的上清液移至B管，1 800 r/min離心5 min，吸除液體獲得沉淀的細(xì)胞，加10ml培養(yǎng)基，移液槍均勻吹打后取2滴液體用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。存活率測(cè)定：取2滴液體至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，加臺(tái)盼藍(lán)染液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，死亡細(xì)胞為藍(lán)色，活細(xì)胞無(wú)色，存活率=4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格細(xì)胞總數(shù)×100%；⑥將細(xì)胞按8 000 cm2接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、0.5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組正常的軟骨組織重量、提取方法、時(shí)間應(yīng)控制與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.2.3 細(xì)胞的傳代 當(dāng)細(xì)胞成密集集落生長(zhǎng)或融合至＜80%時(shí)，將細(xì)胞傳代。移液槍吸除培養(yǎng)液，PBS液漂洗3次，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，消化約3 min，在顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞是否脫落。細(xì)胞從瓶壁脫落后加入2 ml培養(yǎng)基終止消化，移液槍吹打瓶壁，液體吸入10 ml離心管后，1 800 r/min離心5 min，吸除液體，保留細(xì)胞沉淀物。重復(fù)原代細(xì)胞分離第5、6步。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 兩組原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h后和傳代貼壁后，均放倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比較是否符合軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)特性,實(shí)驗(yàn)組應(yīng)注意觀察有無(wú)長(zhǎng)梭形的纖維樣細(xì)胞。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色鑒定 將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)至第2代的細(xì)胞傳代后，放入含蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。PBS緩沖液清洗爬片2次，4%多聚甲醛溶液固定15～20 min、0.1%甲苯胺藍(lán)染液浸泡2 h，90%無(wú)水乙醇漂洗，鏡下觀察。

1.2.6 MTT法 為保證足夠數(shù)量的細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞第2、3代測(cè)吸光度值（optical density，OD），每代細(xì)胞均按2×104個(gè)/ml接種至6塊96孔板，100 μg/（ml.孔），每板分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組接種6孔。每隔2天換液，每隔1天取1塊96孔板分別測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔OD值,測(cè)1次/（板.孔），共測(cè)6次。加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl/孔，培養(yǎng)箱孵育4 h后加入100 μl DMSO，在搖床上低速震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)儀490 nm處測(cè)各孔吸光度值，取每組平均值。

1.2.7 電鏡 電鏡觀察比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。兩組細(xì)胞分別取第3代細(xì)胞，接種至含有Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d[7]，細(xì)胞懸液鋪滿培養(yǎng)皿底。3 d后，將復(fù)合膠原膜從培養(yǎng)皿中取出，PBS緩沖液漂洗，2.5%戊二醛、1%鋨酸雙固定，濃度逐級(jí)增高的乙醇脫水、臨界點(diǎn)干燥，噴金導(dǎo)電后掃描電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率

實(shí)驗(yàn)組軟骨重量約為85 mg，細(xì)胞濃度約為2.7136×104個(gè)/ml；對(duì)照組軟骨重量約為85 mg，細(xì)胞濃度約為3.5248×104個(gè)/ml；從軟骨組織中獲得細(xì)胞比率：實(shí)驗(yàn)組∶對(duì)照組的細(xì)胞提取比率1.0000∶1.2989。實(shí)驗(yàn)組臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率約為90%，對(duì)照組約為93%。

2.2 兩組細(xì)胞形態(tài)觀察

兩組原代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察均呈球形，大小無(wú)明顯差異，均懸浮于培養(yǎng)基中，具有折光性。培養(yǎng)48 h后，兩組細(xì)胞均呈三角形或多角形，實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)長(zhǎng)梭形纖維樣細(xì)胞；兩組細(xì)胞均表現(xiàn)為集落生長(zhǎng)，原代約8 d后出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，成“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，達(dá)到傳代條件。兩組傳代的細(xì)胞均于24 h內(nèi)貼壁，時(shí)間較原代細(xì)胞縮短，細(xì)胞形態(tài)仍呈三角形或多角形，未見(jiàn)去分化；增殖速度加快，兩組第1代培養(yǎng)周期約5 d，2、3代約3、4 d，即可達(dá)傳代條件。見(jiàn)圖2。

2.3 兩組細(xì)胞染色結(jié)果比較

兩組細(xì)胞均被染成同一色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)顏色則較淺，細(xì)胞界限清楚，輪廓清晰，呈多邊形，提示為軟骨細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

2.4 兩組細(xì)胞生長(zhǎng)活性比較

通過(guò)以相同的濃度種植，實(shí)驗(yàn)組第2、3代細(xì)胞相對(duì)原代細(xì)胞均表現(xiàn)為增殖速度加快，2代生長(zhǎng)活性分別保持一致，活性無(wú)明顯減低，與對(duì)照組第2、3代細(xì)胞生長(zhǎng)活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表1、2）。實(shí)驗(yàn)組第2代與第3代細(xì)胞生長(zhǎng)活性結(jié)果比較：第2天比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在第3、4天細(xì)胞增殖加快期，第3代活性較第2代好（P＜0.05）；到達(dá)平臺(tái)接觸抑制期后，第5、6天活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在傳代過(guò)程中同樣表現(xiàn)出第3代較第2代增殖速度加快的現(xiàn)象，即其增殖能力在第3代比較好（見(jiàn)表3）?？烧J(rèn)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生長(zhǎng)活性無(wú)明顯差異，且實(shí)驗(yàn)組在傳代過(guò)程中活性未減低，第3代活性較好。

圖2 軟骨細(xì)胞形態(tài) （倒置顯微鏡）

圖3 兩組第3代細(xì)胞 （甲苯胺藍(lán)染色×400）

表1 兩組第2代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

表1 兩組第2代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

組別 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天實(shí)驗(yàn)組 0.1724±0.0176 0.3558±0.320 0.8043±0.0823 0.8173±0.0310 0.8015±0.0077 0.8167±0.0603對(duì)照組 0.1596±0.0077 0.3854±0.0103 0.8135±0.0144 0.8112±0.0121 0.7982±0.0074 0.8213±0.0083t值 1.634 2.155 1.359 0.449 0.757 1.101P值 0.133 0.057 0.204 0.663 0.467 0.297

表2 兩組第3代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

表2 兩組第3代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

組別 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天實(shí)驗(yàn)組 0.1657±0.0046 0.4047±0.0079 0.8195±0.0067 0.7932±0.0072 0.8062±0.0010 0.7945±0.0166對(duì)照組 0.1733±0.0081 0.3923±0.0155 0.8241±0.0094 0.8052±0.0157 0.7951±0.0114 0.8027±0.0145t值 2.000 1.745 0.929 1.706 1.715 0.913P值 0.073 0.112 0.375 0.119 0.117 0.383

表3 實(shí)驗(yàn)組第2、3代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

表3 實(shí)驗(yàn)組第2、3代細(xì)胞O D值比較 （n=6，±s）

代次 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天第 2 代 0.1724±0.0176 0.3558±0.3200 0.8043±0.0823 0.8173±0.0310 0.8015±0.0077 0.8167±0.0603第 3 代 0.1657±0.0046 0.4047±0.0079 0.8195±0.0067 0.7932±0.0072 0.8062±0.0010 0.7945±0.0166t值 0.903 3.630 3.297 1.856 0.854 3.085P值 0.388 0.005 0.008 0.093 0.413 0.012

2.5 兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)比較

兩組細(xì)胞均貼附復(fù)合膠原膜上，呈集落生長(zhǎng)，生出偽足，細(xì)胞表面可見(jiàn)微絨毛、凸起等結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)良好，增殖狀態(tài)佳。見(jiàn)圖4。

圖4 軟骨細(xì)胞 （電鏡）

3 討論

軟骨細(xì)胞是自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)的關(guān)鍵，如何從少量的軟骨組織中，在體外獲得足夠數(shù)量且活性良好的的軟骨細(xì)胞，一直困擾著研究者。目前多在關(guān)節(jié)的非負(fù)重、正常軟骨區(qū)獲得足夠數(shù)量軟骨組織，從而獲得足夠數(shù)量、表型穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在軟骨損傷區(qū)取下少量損傷軟骨組織，在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)，通過(guò)建立正常軟骨細(xì)胞對(duì)照組，探索軟骨損傷區(qū)所含軟骨細(xì)胞是否變性，是否能提取出正常軟骨細(xì)胞，能否正常生長(zhǎng)，是否能達(dá)到移植要求。

從軟骨損傷軟骨組織中提取出細(xì)胞是至關(guān)重要的一步，因此提取方法值得學(xué)者們探討。為排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其他因素影響，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的軟骨組織重量、提取方法、消化時(shí)間、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件均一致。軟骨組織主要為軟骨細(xì)胞和Ⅱ型膠原組成，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化細(xì)胞外基質(zhì)后就可獲得較純的軟骨細(xì)胞[8]。在關(guān)節(jié)鏡下取的軟骨組織純度很高，可不用胰蛋白酶消化，但是實(shí)驗(yàn)組損傷的軟骨組織表面含有滑膜或者結(jié)締組織，因此需要在Ⅱ型膠原酶作用前，用胰蛋白酶去除軟骨組織外其他雜質(zhì)。為保證實(shí)驗(yàn)條件一致性，對(duì)照組同樣用胰蛋白酶處理且時(shí)間均為30 min。胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶均能夠?qū)?xì)胞造成損傷[9]，因此濃度和消化時(shí)間必須控制好，本實(shí)驗(yàn)采用多次消化，每次消化時(shí)間短[10]，Ⅱ型膠原酶消化時(shí)間均為1 h，共消化3次，最后將消化出的細(xì)胞合并在一起計(jì)數(shù)及培養(yǎng)。接種密度低，軟骨細(xì)胞的旁分泌因子無(wú)法相互作用，容易出現(xiàn)去分化。合適的接種密度，細(xì)胞分泌的因子可相互影響，互相維持細(xì)胞的表型[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，合適的接種密度，在5代之前的軟骨細(xì)胞為三角形或多邊形，形態(tài)保持良好[12-13]。本實(shí)驗(yàn)多次、短時(shí)間消化可以獲得足量的原代細(xì)胞，保證接種密度，從而保證細(xì)胞表型一致。

本實(shí)驗(yàn)觀察貼壁后細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性，以及用甲苯胺藍(lán)染色對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞鑒定。對(duì)照組細(xì)胞是從正常軟骨組織中提取，為正常軟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后，形態(tài)和生長(zhǎng)特性方面與對(duì)照組一致，為聚集生長(zhǎng)的三角形或多角形細(xì)胞，呈鋪路石樣改變；同時(shí)其甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果也一致[14]，表明從損傷的軟骨組織中所提取的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞，軟骨損傷后其所含軟骨細(xì)胞未發(fā)生變性。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞為軟骨細(xì)胞后，需進(jìn)一步測(cè)定其生長(zhǎng)活性，以判定其是否滿足移植要求。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法[15]和電鏡觀察法對(duì)實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)活性進(jìn)行鑒定。值得強(qiáng)調(diào)的是進(jìn)行MTT接種時(shí)應(yīng)同樣注意接種密度，本實(shí)驗(yàn)接種密度為2×104個(gè)/ml，100μg/（ml.孔），保證接種密度，維持細(xì)胞的表型。MTT法結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)活性和正常軟骨細(xì)胞活性相同，培養(yǎng)周期接近；電鏡觀察結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞一樣生出偽足，表面同樣可見(jiàn)微絨毛、凸起等結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)良好。結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組的軟骨細(xì)胞為活性正常的軟骨細(xì)胞，可以滿足自體軟骨細(xì)胞移植要求。

通過(guò)原代細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，軟骨損傷后有一定量的軟骨細(xì)胞丟失，但是其所含軟骨細(xì)胞未發(fā)生變性，少量損傷軟骨組織仍可通過(guò)采用多次、短時(shí)間二步酶消化法提取出數(shù)量合適、表型穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞，其生長(zhǎng)活性并未受到損傷因素及損傷后炎癥的影響，與正常軟骨細(xì)胞無(wú)明顯差異，因此可以作為自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)的軟骨細(xì)胞來(lái)源之一，不必在非負(fù)重區(qū)取正常的軟骨組織，避免人為因素對(duì)關(guān)節(jié)面完整造成的二次損傷。

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（童穎丹 編輯）

Isolation,identification and biological activity of chodrocytes from injured cartilage*

Wang-lin Yao,Li-jin Liu,Xun-an Xu,Bo Cong,Jia-ting Zhang,Zhong-wen Zhang
(Department of Orthopaedics,General Hospital of Chinese Armed Police Forces,Beijing 100039,China)

R687.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.004

1005-8982（2017）23-0018-05

2016-11-03

首都臨床特色應(yīng)用研究（No：Z161100000516013）

張仲文，E-mail：zhang6816151@163.com；Tel：13716151868