鐘惠娟，陳璐，廖慧穎，張濤，王波，周潔

（1.廣州醫(yī)學院荔灣醫(yī)院 心內科，廣東 廣州 510000；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 神經內科，湖南 常德 415003；3.南華大學附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.解放軍第一六九醫(yī)院（湖南師范大學附屬湘南醫(yī)院）普外科，湖南 衡陽 421001）

二氫楊梅素調控自噬抑制氧化低密度脂蛋白誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的研究

鐘惠娟1，陳璐1，廖慧穎2，張濤3，王波3，周潔4

（1.廣州醫(yī)學院荔灣醫(yī)院 心內科，廣東 廣州 510000；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 神經內科，湖南 常德 415003；3.南華大學附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.解放軍第一六九醫(yī)院（湖南師范大學附屬湘南醫(yī)院）普外科，湖南 衡陽 421001）

目的 觀察二氫楊梅素（DMY）對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）損傷的影響，并探討自噬在其中的作用。方法 DMY（0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L）預處理HUVECs 2 h，用100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。以辛伐他汀作為陽性對照組。采用噻唑藍法檢測細胞活力，Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài)，透射電鏡觀察自噬體，Western blot檢測自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin-1和p62/SQSTM1的表達，觀察自噬抑制劑對DMY作用的影響。結果 與對照組比較，ox-LDL組細胞的存活率降低（P＜0.05），細胞核呈集中高強度藍色熒光，固縮致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，細胞核較小，形態(tài)不規(guī)則，自噬體和自噬溶酶體數量增加；Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調，而p62的表達下調（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，0.1、1.0和10.0μmol/LDMY預處理組細胞存活率均升高；細胞核熒光強度降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少，形態(tài)較規(guī)則；1.0 μmol/LDMY預處理組的自噬體和自噬溶酶體數量增加；Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調，而p62的表達下調（P＜0.05）。自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY抑制ox-LDL誘導的HUVECs存活率降低（P＜0.05）。結論 DMY能抑制ox-LDL誘導的HUVECs損傷，其機制與誘導自噬有關。

二氫楊梅素；氧化低密度脂蛋白；內皮細胞；自噬；自噬相關蛋白

Abstract:Objective To investigate the effect of Dihydromyricetin (DMY)on the damage induced by oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)and to explore the role of autophagy in this effect.Methods After HUVECs were pretreated with DMY (0.01,0.1,1.0 and 10.0 μmol/L)for 2 h,the cells were incubated with ox-LDL(100.0 mg/L)for 24 h.Simvastatin was made as a positive control.MTT was used to detect cell viability.Nuclear morphology was observed by Hoechst 33258 staining.Cell ultrastructures and autophagosomes were observed by transmission electron microscope.Theexpressions of Beclin-1,light chain-3 of microtubule-associated protein (LC3)and the autophagy substrates p62/SQSTM1 in cells were determined by Western blot.Results Compared with the control group,the cell survival rate was singificantly decreased (P＜0.05),the nuclei were smaller in the ox-LDL group.The concentrated high-intensity blue fluorescence in nuclei,nuclear condensation and dense dyeing,or nuclear chunky and dense dyeing were observed in the ox-LDL group.Compared with the control group,the number of autolysosomes was obviously increased,the expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin the cells were singificantly increased and the expression of p62 in the cells was singificantly decreased in the ox-LDL groups (P＜0.05).Compared with the ox-LDL group,the cell survival rate was singificantly increased (P＜0.05),the fluorescence intensity of nuclei was obviously decreased,nuclear condensation and dense dyeing or nuclear chunky and dense dyeing were decreased,the nuclei were regular in the DMY(0.1,1.0 and 10.0 μmol/L)pretreatment groups.Compared with the ox-LDL group,the number of autolysosomes was obviously increased,the expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin the cells were singificantly increased while the expression of p62 in the cells was singificantly decreased in the DMY(1.0 μmol/L)pretreatment group(P＜ 0.05).Autophagy inhibitor 3-MA partly abolished the effect of DMY on the cell survival rate(P＜0.05).Conclusions DMY protects ox-LDL-induced damage in HUVECs,the mechanism is associated with induction of autophagy.

Keywords:Dihydromyricetin;oxidized low-density lipoprotein;endothelial cell;autophagy;autophagy related proteins

二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）是黃酮類化合物之一，我國民間古茶藤茶中大量存在。二氫楊梅素的藥理作用非常廣泛，具有鎮(zhèn)痛、止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)血糖和血脂、調節(jié)免疫力及肝腎保護作用等[1]。最近研究表明，二氫楊梅素能降低動脈粥樣硬化（Artherosclerosis，AS）大鼠血脂水平，改善其血流動力學，抑制大鼠主動脈弓的炎癥因子的表達，具有抗AS的作用[2]，然而其詳細的機制還不清楚。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是 AS 的獨立危險因素[3]。ox-LDL 導致血管內皮細胞的損傷是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。自噬是真核生物中一種進化上高度保守，用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程[4]。研究發(fā)現自噬與AS關系密切，在AS中的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用，適度的自噬對AS具有保護作用，過度的自噬卻會導致細胞死亡，降低斑塊的穩(wěn)定性，導致斑塊破裂，發(fā)生急性臨床事件[5]。研究發(fā)現，ox-LDL能誘導內皮細胞的自噬并發(fā)生Ⅱ型程序性死亡[6]。DMY的抗AS作用是否與內皮細胞的自噬有關，目前還不清楚。因此，本研究旨在觀察DMY對ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷的影響，并探討自噬在其中的作用，為AS的防治提供新的線索和策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

HUVECs株由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心提供，二氫楊梅素為成都曼斯特生物科技公司產品，RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶、四乙酸乙二胺為美國Gibco公司產品，細胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒購于杭州碧云天生物技術研究所，3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）和噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]為美國Sigma公司產品，兔抗人Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3（Microtubule-associatedproteinlightchain-3，LC3）、p62/SQSTM1、β- 肌 動 蛋白一抗單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗為美國Santa Cruz公司產品。

1.2 實驗儀器

二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱、細胞工作超凈臺、多功能酶標儀、低速離心機和倒置顯微鏡。全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司），垂直電泳儀與轉膜系統(tǒng)（美國BioRad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司），圖像分析系統(tǒng)（武漢華海公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)和實驗分組

HUVECs用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。隔天傳代，處于對數生長期的細胞用于實驗。實驗分為6組：①對照組；②ox-LDL組：用含100.0mg/L ox-LDL RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h；③DMY單獨處理組：用含1.0或100.0μmol/LDMY培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞26 h；④辛伐他汀預處理組：以辛伐他汀做為陽性對照組，用含1.8 mg/L辛伐他汀的培養(yǎng)液預處理2 h后，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h；⑤不同濃度DMY預處理組：用含0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/LDMY的培養(yǎng)液預處理2 h后，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h；⑥自噬抑制劑3-MA干預組：用含5 mmol/L 3-MA培養(yǎng)液預處理30 min，用含1.0 μmol/LDMY培養(yǎng)液預處理2 h，加入100.0 mg/L ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。

1.4 MTT法

用胰酶消化后將HUVECs細胞制成細胞懸液，計數細胞密度，以1×104個/孔接種到96孔培養(yǎng)板內。實驗結束后每孔加入100μl MTT，使MTT的終濃度為0.5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液。加入二甲基亞砜100μl/孔，振蕩10 min，待結晶完全溶解后，在酶標儀上測定570 nm波長的吸光度值（optical density，OD），每組設重復孔3個。計算各組細胞的存活率，以對照組為參照（細胞存活率為100%），計算其他各組細胞存活率=（處理組OD值/對照組OD值）×100%。

1.5 Hoechst 33258染色

HUVECs細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，相應處理結束后，用磷酸鹽緩沖溶液將細胞清洗2遍。然后每孔加 10μg/ml Hoechst33258染色液 100 μl，在室溫下避光孵育15 min，將染色液吸去。在熒光顯微鏡下以346 nm的激發(fā)光激發(fā)，在460 nm的發(fā)射光下觀察細胞核的形態(tài)[7]。實驗操作按試劑盒說明書進行。

1.6 Western blot檢測

提取各組HUVECs細胞的總蛋白，BAC法測定蛋白濃度。取100μl蛋白樣本加入到2×十二烷基磺酸鈉凝膠加樣緩沖液中，煮沸充分變性蛋白。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h分離蛋白，分離的蛋白轉膜至聚偏氟乙稀膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人 Beclin-1（1∶200）、LC3（1∶200）、p62（1∶200）及β-肌動蛋白（1∶400）一抗，4℃下過夜。加入鼠抗兔二抗，孵育6 h。洗膜，顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進行掃描和半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析；組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ox-LDL和DMY對HUVECs細胞存活率的影響

采用MTT法檢測HUVECs細胞活力，細胞的存活率組間比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.872，P=0.016）。ox-LDL組細胞的存活率與對照組比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.843，P=0.000），ox-LDL 組降低；DMY 單獨處理組與對照組比較，經LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.382，P=0.657）；辛伐他汀預處理組與ox-LDL組細胞存活率比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.157，P=0.001），辛伐他汀預處理組升高；0.1、1.0 和10.0μmol/LDMY預處理組細胞的存活率與ox-LDL組比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=1.463、3.051 和 3.349，P=0.015、0.008 和 0.004），0.1、1.0 和10.0μmol/LDMY預處理組均升高，其中最佳藥物濃度為1.0μmol/L。1.0和10.0μmol/LDMY預處理組細胞的存活率與辛伐他汀預處理組比較，經LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.627和0.834，P=0.571和0.482）。見圖 1。

圖1 ox-LDL和DMY對HUVECs細胞存活率的影響

2.2 ox-LDL和DMY對HUVECs細胞核形態(tài)學的影響

對照組細胞核呈彌散較均勻低強度藍色熒光，細胞核較大，形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形。ox-LDL組細胞數量明顯減少，細胞核出現高強度藍色熒光，固縮致密濃染，部分呈碎塊狀致密濃染，細胞核較小，形態(tài)呈不規(guī)則型。DMY單獨處理組與對照組比較，細胞核的形態(tài)無差異。辛伐他汀預處理組與ox-LDL組比較，細胞數量明顯增加，細胞核熒光強度明顯降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少。0.1、1.0和10.0μmol/LDMY預處理組與ox-LDL組比較，細胞數量增加，細胞核熒光強度明顯降低，核固縮致密濃染和碎塊狀致密濃染減少，細胞形態(tài)較規(guī)則，1.0和10.0μmol/LDMY預處理組細與辛伐他汀預處理組比較，細胞核形態(tài)無差異。其中DMY最佳藥物濃度為1.0μmol/L，與細胞存活率結果一致，因此后續(xù)實驗中DMY的濃度為1.0μmol/L。見圖2。

2.3 HUVECs中自噬體的觀察

目前檢測自噬的金標準是透射電鏡觀察自噬體。與對照組比較，ox-LDL組和DMY單獨處理組細胞自噬體和自噬溶酶體數量明顯增加；與ox-LDL組比較，1.0μmol/LDMY預處理組細胞自噬體和自噬溶酶體數量明顯增加。見圖3。

圖2 ox-LDL和二氫楊梅素對HUVECs細胞核形態(tài)學的影響 （×400）

圖3 HUVECs中自噬體 （透射電鏡）

2.4 ox-LDL和DMY對HUVECs細胞中Beclin1、LC 3及p62表達的影響

Beclin-1和LC3是自噬體形成的標志蛋白，而p62是自噬的底物，常用來反應自噬流的水平。Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62的表達組間比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.641，P=0.024）。與對照組比較，ox-LDL組和DMY單獨處理組的Beclin-1（t=2.746和2.723，P=0.024和 0.027）、LC3-Ⅱ（t=2.542 和 2.521，P=0.036和0.039）的表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（t=2.806和 2.721，P=0.022 和 0.028）比較，經 LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，ox-LDL組和DMY單獨處理組均上調；而p62表達比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.149和 3.068，P=0.012和0.015），ox-LDL組和DMY單獨處理組均下調。與ox-LDL組比較，1.0μmol/LDMY 預處理組的 Beclin-1（t=2.957，P=0.018）、LC3-Ⅱ（t=2.731，P=0.026）的表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（t=2.958，P=0.018）比較，經 LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義，1.0μmol/LDMY預處理組上調；而p62表達比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.809，P=0.021），1.0μmol/LDMY 預處理組下調。見圖4。

2.5 自噬抑制劑對DMY作用的影響

采用MTT法檢測HUVECs細胞活力，觀察自噬抑制劑3-MA對DMY抑制ox-LDL誘導的HUVECs損傷的影響。細胞的存活率組間比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.673，P=0.002）。ox-LDL組和3-MA組細胞存活率與對照組比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.645和6.817，P=0.001和 0.000），ox-LDL組和 3-MA組均降低；1.0μmol/LDMY預處理組細胞存活率與ox-LDL組比較，經LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.958，P=0.012），1.0μmol/LDMY預處理組升高；自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY抑制ox-LDL誘導的HUVECs存活率的降低（t=2.586，P=0.022）。DMY單獨處理不影響 HUVECs細胞的存活率（t=0.584，P=0.843）。見圖5。

圖4 ox-LDL和DMY對HUVECs細胞中Becl i n 1、LC 3及p62表達的影響

圖5 自噬抑制劑對二氫楊梅素作用的影響

3 討論

血管內皮細胞受損是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，ox-LDL是導致內皮細胞損傷的常見因素，也是導致AS發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素。ox-LDL可刺激內皮細胞分泌多種炎癥因子、黏附分子及趨化因子，促進T淋巴細胞和單核細胞的黏附并向內膜下移行，促進AS的形成。另一方面，ox-LDL誘導機體產生大量的活性氧，導致內皮細胞的脂膜、蛋白質和DNA的損傷，損傷內皮細胞，降低內皮細胞對血管的保護作用，加速AS的發(fā)生。因此保護血管內皮細胞是防治AS的一個重要途徑。

二氫楊梅素為 3，5，7，3’，4’，5’-6 羥基 -2，3-雙氫黃酮醇，是一種常見的黃酮類化合物，在我國民間古茶藤茶中含量較高，在葡萄等水果和蔬菜中都大量自然存在。二氫楊梅素的藥理作用非常廣泛，具有鎮(zhèn)痛、止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、護肝、調節(jié)血糖和血脂，以及調節(jié)免疫力等作用。最近研究表明，二氫楊梅素具有抗AS的作用。梁柱第等[2]研究發(fā)現，藤茶二氫楊梅素抑制高脂誘導Wistar大鼠AS的形成，降低AS大鼠血清C-反應蛋白、血清腫瘤壞死因子及白細胞介素-1的水平，顯著降低AS大鼠主動脈弓分泌型血小板型磷脂酶A2的表達，提示藤茶雙氫楊梅素具有防治AS的作用。其作用機制是通過改善AS大鼠炎癥因子水平，抑制分泌型血小板型磷脂酶A2的表達。研究發(fā)現，藤茶總黃酮（主要成分為DMY）可顯著降低AS大鼠的血清低密度脂蛋白、三酰甘油及總膽固醇水平，升高高密度脂蛋白水平；顯著降低AS大鼠血漿黏度、全血黏度和紅細胞壓積，提示藤茶總黃酮可改善AS大鼠血脂水平和血流動力學，具有防治AS的作用。血管內皮細胞的損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，DMY具有血管內皮細胞保護作用。劉云霄等[8]研究發(fā)現，DMY能抑制H2O2誘導的血管內皮細胞的損傷，其機制與清除細胞內活性氧、抑制細胞內鈣離子介導的細胞凋亡相關。HOU等[9]研究表明，DMY能通過線粒體凋亡途徑抑制血管內皮細胞的氧化應激損傷。本研究結果顯示，DMY預處理能抑制ox-LDL誘導的損傷，增加細胞的存活率，抑制細胞的凋亡，與以前的研究結果一致，但其機制還不清楚。

自噬是一種真核細胞進化過程中高度保守的機制，在自噬相關基因的調控下，利用溶酶體降解細胞內長壽蛋白質、受損的細胞器和入侵微生物的過程，是維持細胞內穩(wěn)態(tài)必不可少的一條分解代謝途徑，是細胞應激情況下，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和存活的重要途徑。研究顯示，細胞自噬參與內皮細胞的保護，細胞自噬可降解和消化內皮細胞內受損、衰老和失去功能的細胞器和變性的蛋白質，能減輕炎癥、氧化應激和缺氧等誘導的內皮細胞的凋亡和壞死。XIA等[10]研究發(fā)現，飛燕草素三葡萄糖甙通過腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息調節(jié)因子1（AMP-activatedproteinkinase/silentinformationregulatoroftranscription1，AMPK/Sirt1）信號通路上調自噬水平，抑制ox-LDL誘導的HUVECs的損傷。研究發(fā)現，Sirt3活化可維持細胞內的自噬水平，而抑制ox-LDL誘導的HUVECs的損傷[11]。Beclin-1和LC3是自噬標志性蛋白。Beclin-1是哺乳動物體內參與細胞自噬的特異性基因，也是酵母自噬相關蛋白6的同系物。Beclin-1能與ClassⅢ磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）形成復合物，參與自噬前體復合物的形成和自噬小體膜的形成，成為自噬體形成的標志性蛋白。最初合成一個未處理的LC3是前體LC3，自噬相關蛋白4可立即將其裂解，產生一種活躍的細胞溶質形式被稱為LC3-Ⅰ。隨著自噬相關蛋白7的催化和E2酶At93的結合，LC3-Ⅰ和豐富的膜磷脂即磷脂酰乙醇胺相互作用產生LC3-Ⅱ。LC3Ⅱ結合并位于胞內自噬體膜上，其含量與自噬泡數量成正相關，反映自噬體的含量，因此LC3-Ⅱ表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ常用來反映自噬的水平。p62/SQSTM1是自噬降解的標志物，常用來反映自噬活性。DMY對細胞自噬具有調節(jié)作用。XIA等[10]研究發(fā)現，DMY能抑制哺乳動物雷帕霉素靶向基因（Mammaliantargetofrapamycin，mTOR）途徑誘導的HepG2細胞自噬。研究發(fā)現，DMY通過AMPK信號通路誘導自噬，改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗[12]。本研究結果顯示，DMY預處理增加ox-LDL誘導的HU VECs的自噬體和自噬溶酶體的數量，上調Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，下調p62的表達，而自噬抑制劑3-MA部分抵消DMY對ox-LDL誘導的HUVECs的保護作用，提示DMY通過誘導細胞自噬，抑制ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷。細胞自噬的調控過程十分復雜，涉及PI3KI/mTOR、PI3KⅢ和AMPK/Sirt1等信號通路，DMY誘導血管內皮細胞自噬的詳細過程有待進一步研究。

總之，DMY能抑制ox-LDL誘導的血管內皮細胞損傷，其機制與促進細胞自噬水平有關。本研究證實，DMY能通過保護血管內皮細胞而發(fā)揮抗AS的作用，為臨床上將DMY用于內皮細胞損傷相關性疾病的防治，提供理論依據和實驗支持。

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（童穎丹 編輯）

Dihydromyricetin protects oxidized low-density lipoproteininduced damage by inducing autophagy in human umbilical vein endothelial cells

Hui-juan Zhong1,Lu Chen1,Hui-ying Liao2,Tao Zhang3,Bo Wang3,Jie Zhou4
(1.Department of Cardiology,Liwan Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510000,China;2.Department of Neurology,the First People's Hospital of Changde,Changde,Hunan 415003,China;3.The Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;4.Department of General Surgery,the 169thHospital of Chinese People's Liberation Army,Hengyang,Hunan 421001,China)

R543；R363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.006

1005-8982（2017）23-0031-07

2016-08-28

周潔，Tel：0734-8483223；E-mail：zhoujie7927@126.com