錢燕

（武漢理工大學(xué)醫(yī)院 公共衛(wèi)生科，湖北 武漢 430070）

黃芩素抑制白血病細(xì)胞增殖的分子機制研究

錢燕

（武漢理工大學(xué)醫(yī)院 公共衛(wèi)生科，湖北 武漢 430070）

目的 探討黃芩素抑制白血病細(xì)胞增殖的分子機制。方法 用不同終濃度的黃芩素處理多種白血病細(xì)胞，通過細(xì)胞計數(shù)獲得不同時間的活細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞的生長曲線。采用對黃芩素處理最敏感的6133/MPL W515L細(xì)胞，探討黃芩素抑制白血病細(xì)胞增殖的分子機制、細(xì)胞周期分布及凋亡情況。結(jié)果 黃芩素能抑制實驗中所有白血病細(xì)胞的增殖，但對來自小鼠胚胎干細(xì)胞非惡變的G1ME細(xì)胞卻無效果，提示黃芩素可能特異性抑制惡變白血病細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析顯示，不同濃度的黃芩素對6133/MPL W515L細(xì)胞凋亡的作用不同（P＜0.05），提示可能導(dǎo)致6133/MPL W515L細(xì)胞凋亡和將細(xì)胞周期阻滯于G1期。另外，黃芩素可能通過抑制MAPK/Erk通路，激活Caspase-3的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。單獨Z-VAD不影響細(xì)胞增殖，但也不能拯救黃芩素導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制，提示Caspase活化可能不是黃芩素抑制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路。結(jié)論 黃芩素能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而抑制其增殖，可能是有效的抗白血病候選藥物。

白血?。稽S芩素；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

Abstract:Objective To investigate the molecular mechanism of baicalein inhibiting proliferation of leukemic cells.Methods A variety of leukemia cells were treated with different concentrations of baicalein,and the number of viable cells was obtained by cell counting.6133/MPL W515L cells were used to study the molecular mechanism of baicalein inhibition of cell proliferation,cell cycle distribution and apoptosis.Results Baicalein could inhibit the proliferation of all the tested leukemia cells,except for the non malignant G1ME cells from mouse embryonic stem cells,suggesting that baicalein might specifically inhibit the proliferation of malignant leukemia cells.Cell cycle analysis showed that the different concentrations of baicalein had different effect on apoptosis of 6133/MPL W515L cells (P＜0.05),suggesting that may lead to the apoptosis of 6133/MPL W515L cells and cell cycle arrest in G1phase.In addition,baicalein may induce apoptosis by inhibiting MAPK/Erk pathway and activating caspase-3.Z-VAD alone did not affect cell proliferation,but it could not save the cell proliferation inhibition induced by baicalein,suggesting that caspase activation may not be the key pathway of baicalein inhibiting cell proliferation.Conclusions Baicalein can induce apoptosis and cell cycle arrest and inhibit the proliferation of leukemia cells.It may be an effective candidate for anti-leukemia drugs.

Keywords:leukemia;baicalein;proliferation;apoptosis;cell cycle

白血病是威脅人類健康的重大疾病，白血病致病的分子機制和治療一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點[1-4]。從天然物質(zhì)中尋找毒副作用小，安全有效的治療白血病的藥物，已經(jīng)成為近些年的研究熱點[5-7]。黃芩素是黃芩的主要有效成分，具有多種藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抑制醛糖還原酶及抗病毒等，其抗腫瘤作用一直是國內(nèi)外研究的熱點。本文主要探討黃芩素抑制白血病細(xì)胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì) 胞 系 6133、6133/MPLW515L、K562、CMK（原始巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系）、HL-60、HEL、Jurkat（人外周血白血病T細(xì)胞）、Raji（人淋巴瘤）、U937（人巨噬細(xì)胞系）、G1ME等細(xì)胞系為武漢理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗室所保藏，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）中。

1.1.2 試劑 黃芩素為美國Sigma公司產(chǎn)品，純度為99.00%，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫水浴鍋（上海精宏試驗設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱、小型離心機及高速冷凍離心機購自香港Healforce公司，生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），基因擴增儀（美國Thermo公司），流式細(xì)胞儀（美國Beck-man&Coulter公司生產(chǎn)Epics XL流式細(xì)胞儀），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國ABI7500定量PCR儀），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京君意東方設(shè)備有限公司），液氮罐(成都市洪達化工責(zé)任有限公司)，-80℃、-20℃和4℃冰箱均購自青島海爾集團，XFS-280A高壓滅菌鍋 (長沙科怡儀器設(shè)備有限公司)，DGG-9023AD電熱恒溫烘箱（濟南恒旭試驗機技術(shù)有限公司），凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司），磁力攪拌器（德國IKA公司)，XS-205電子天平、pH計購自瑞士Mettler Toledo公司。

1.1.4 試劑及溶液 胎牛血清（美國Hyclone公司），誘導(dǎo)劑TPA（美國Sigma公司），人源CD61-FITC抗體（美國Bdbioscience公司），焦碳酸二乙酯水（日本TaKaRa公司），Trizol（美國Invitrogen公司)，鹽酸HCl（美國Sigma公司)，氯仿，異丙醇，乙醇。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）的配置：稱取 0.2 g氯化鉀 KCl、8 g 氯化鈉 NaCl、0.24 g 磷酸二氫鉀KH2PO4及1.44 g磷酸氫二鈉Na2HPO4溶于800 ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杌靹?，溶解后用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L。在103.4 kPa高壓下濕熱滅菌20 min，保存于室溫或4℃冰箱中。RPMI 1640培養(yǎng)基的復(fù)制：將1 L RPMI 1640粉末溶于800 ml去離子水中，4℃攪拌2 h，加2.5g碳酸氫鈉NaHCO3，繼續(xù)攪拌30 min。2.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0。0.22 μm無菌濾膜過濾，分裝2瓶，500 ml/瓶，每瓶取4 ml于小青瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，溶液若清澈透明即可使用。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液的配制：將500 ml RPMI 1640培養(yǎng)基移出50 ml，加入胎牛血清50 ml，并加入5 ml青霉素-鏈霉素雙抗母液，相同方向搖勻，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 黃芩素溶液的制備 稱取適量黃芩素溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中制備成100 mmol/L儲存母液，用0.22μm的一次性針頭過濾器過濾，置入-20℃避光保存?zhèn)溆?，根?jù)需要將母液稀釋。

1.2.2 白血病腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 IU/L青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，將其置于37℃、5%二氧化碳C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 白血病腫瘤細(xì)胞的生長曲線 將對數(shù)生長的6133、6133/MPL W515L、6133、K562、CMK、HEL、HL-60、U937、Raji、Jurkat等白血病細(xì)胞，以及 G1ME 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，0.5×106個細(xì)胞/孔接種于12孔板中，1 ml/孔；在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；加入終濃度為0、10、20和40 μmol/L黃芩素溶液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，以不含黃芩素培養(yǎng)基的細(xì)胞作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h，進行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.4 BrdU滲入法 細(xì)胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/ml。44 h加秋水仙素0.1μg/ml。48 h后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。常規(guī)染色體制片。染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30 min。棄去2×SSC液，流水沖洗。Giemsa液染色10 min，流水沖洗，晾干。鏡檢100個分裂相，記錄第1～4細(xì)胞期分裂指數(shù)。細(xì)胞周期=48/[（M1+2M2+3M3+4M4）/100]。

1.2.5 Annexin-V 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色 將6133/MPLW 515L細(xì)胞1 500 r/min離心5 min。用PBS將細(xì)胞洗滌2次，1 500 r/min離心5 min，收集2×106個細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后再加入5 μl PI充分混勻。于室溫、避光條件下反應(yīng)5～15 min。在1 h內(nèi)于激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm條件下用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 PI染色 將6133/MPL W515L細(xì)胞1500r/min離心5 min，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，收集2×106個細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過夜，或置入-20℃長期固定。細(xì)胞染色，離心收集細(xì)胞，用1ml PBS洗滌細(xì)胞1次，加入500 μl PBS（含 50μg/ml PI、100μg/ml Rnase A、0.2%Triton X-100），4℃避光條件下孵育30 min。在標(biāo)準(zhǔn)程序條件下用流式細(xì)胞儀進行檢測，一般計數(shù)2～3104個細(xì)胞，用Flowjo軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.7 Western blot檢測 ①蛋白質(zhì)樣品獲得：每個樣品收集10×106個細(xì)胞，1 500 r/min離心，去上清液，用PBS重懸洗2次，加1 ml放射免疫分析裂解液Buffer（含有1/1 000的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟），裂解30 min。為使細(xì)胞充分裂解，培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。4℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液作為樣品；②電泳：根據(jù)目的蛋白大小選擇適當(dāng)濃度的分離膠來制備電泳凝膠，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，根據(jù)凈光密度值分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對白血病細(xì)胞增殖的影響

用終濃度為40 μmol/L的黃芩素處理6133/MPL W515L、6133、CMK、K562、HL-60、HEL、Jurkat、U937及Raji細(xì)胞48h后，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖率分別為0.100%、0.150%、0.160%、0.790%、0.955%、0.575%、0.115%、1.055%及0.625%，表明黃芩素對不同組織來源的白血病細(xì)胞均有抑制作用。其中6133/MPL W515L細(xì)胞對其最敏感。此外，黃芩素對來自胚胎干細(xì)胞永生化的G1ME細(xì)胞卻無效果，表明黃芩素可能特異性地抑制惡變白血病細(xì)胞的增殖。見圖1、2。

圖1黃芩素對各種白血病細(xì)胞的抑制作用

2.2 黃芩素對6133/MPLW 515L細(xì)胞周期的影響

用終濃度為0、10和20 μmol/L的黃芩素作用6133/MPL W515L細(xì)胞12 h后，其S期細(xì)胞分別為56.2、28.4和13.8個，其G1/G0期細(xì)胞分別為21.4、43.0和53.8個，其G2/M期細(xì)胞分別為10.4、14.3和18.4個。由此可見，黃芩素處理6133/MPL W515L細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，相應(yīng)降低S期細(xì)胞數(shù)，G2/M期則沒有變化。另外，通過PI染色的方法，并利用流式細(xì)胞儀分析軟件Flowjo中細(xì)胞周期分析功能，同樣可以看到黃芩素處理導(dǎo)致G1/G0期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞沒有變化。由此可見，黃芩素處理能導(dǎo)致6133/MPL W515L細(xì)胞周期阻滯。本研究共平行進行50次實驗，同一時間的50次實驗結(jié)果差異較小，組內(nèi)各時間比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=43.754，P=0.000）。見圖 3、4。

圖2 黃芩素對各種白血病細(xì)胞和G1ME細(xì)胞的抑制作用

2.3 黃芩素對6133/MPLW 515L細(xì)胞凋亡的影響

隨著黃芩素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率由黃芩素終濃度為0 μmol/L時的1.62%，到20 μmol/L時的7.69%，以及在40 μmol/L時的14.3%，表現(xiàn)為劑量依賴性的凋亡現(xiàn)象。用終濃度為0、10和20 μmol/L的黃芩素作用6133/MPL W515細(xì)胞12 h后，其DNA含量低于2倍體的細(xì)胞凋亡率，分別為1.23%、1.44%和3.95%，表明黃芩素對細(xì)胞凋亡具有劑量依賴性。用終濃度為10 μmol/L的黃芩素處理6133/MPL W515L細(xì)胞12、24和48 h后，其細(xì)胞凋亡率分別為1.44%、5.19%和9.33%，用終濃度為20 μmol/L的黃芩素處理6133/MPLW515L細(xì)胞12、24和48 h后，其細(xì)胞凋亡率分別為3.95%、10.3%和13.9%，表明黃芩素對6133/MPL W515L細(xì)胞的凋亡不僅具有劑量依賴性，而且具有時間依賴性。組內(nèi)各時間比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.754，P=0.000）。見圖 5～7。

圖3 黃芩素處理后的細(xì)胞周期變化

圖4 黃芩素誘導(dǎo)6133/MPLW 515L細(xì)胞周期阻滯

2.4 芩素抑制6133/MPLW 515L細(xì)胞增殖

隨著黃芩素濃度的增加，p-IκBα磷酸化降低，IκBα總蛋白無變化，說明IκBα磷酸化和降解受到抑制，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）釋放出來進入細(xì)胞核。見圖8。

黃芩素抑制Erk磷酸化但激活A(yù)kt。從Western blot檢測結(jié)果可以看出，與對照組終濃度0 μmol/L相比，終濃度為10、20和40 μmol/L的黃芩素作用6133/MPL W515L細(xì)胞12 h，其細(xì)胞中Erk和Akt總蛋白含量無變化；但p-Erk的含量隨著黃芩素濃度的增加而降低，p-Akt的含量卻隨著黃芩素濃度的增加而升高，推測黃芩素可能通過MAPK-Erk和PI3K-Akt信號通路發(fā)揮作用。見圖9。

圖5 黃芩素誘導(dǎo)6133/MPLW 515L細(xì)胞凋亡

圖6 黃芩素誘導(dǎo)6133/MPLW 515L細(xì)胞凋亡

圖7 黃芩素誘導(dǎo)6133/MPLW 515L細(xì)胞凋亡

圖8 黃芩素抑制I κBα磷酸化

圖9 黃芩素抑制Erk磷酸化激活A(yù)kt

終濃度10、20和40μmol/L黃芩素處理6133/MPL W515L細(xì)胞后，加工后的Caspase-3與對照組終濃度0 μmol/L相比，剪切水平逐漸增高。與此相對應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)總Caspase-3下降。黃芩素可能通過激活Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Z-VAD是一種Caspase的廣譜抑制劑。為驗證Caspase活化在黃芩素抑制細(xì)胞增殖中的作用，本實驗在黃芩素處理細(xì)胞的同時加入Z-VAD。Z-VAD單獨處理6133/MPL W515L細(xì)胞，不影響增殖；用黃芩素和Z-VAD共同處理6133/MPL W515L細(xì)胞后，也未能拯救黃芩素導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制，提示Caspase通路活化可能在黃芩素抑制細(xì)胞增殖中未起關(guān)鍵作用。見圖10。

圖10 黃芩素激活C aspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

3 結(jié)論

黃芩素對白血病腫瘤細(xì)胞的增殖抑制是一個復(fù)雜的過程。該過程牽涉很多因素，包括多個信號通路途徑、活性氧及細(xì)胞周期等[8-10]。并且這些途徑之間可能不是一個相對獨立的過程，而是一個相互作用的網(wǎng)絡(luò)[11-13]。本研究主要探討NF-κB、Caspase-3、Ras/Raf/Mek/Erk通路對白血病增殖和凋亡的影響。

凋亡是在基因的調(diào)控下進行的，相關(guān)基因分為促凋亡基因、抑制凋亡基因及凋亡過程表達基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，黃芩素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與上述基因、蛋白的表達有關(guān)。黃芩素可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的6133/MPL W515L、6133、HL-60、K562、CMK、HEL、Jurkat、U937、Raji 及 永 生化的胚胎干細(xì)胞G1ME細(xì)胞的凋亡和衰竭，黃芩素的濃度與各型癌細(xì)胞間存在著一定的比例關(guān)系。

因此，本研究以白血病腫瘤細(xì)胞中的6133/MPL W515L、6133、HL-60、K562、CMK、HEL、Jurkat、U937、Raji及永生化的胚胎干細(xì)胞G1ME細(xì)胞作為體外模型，通過細(xì)胞計數(shù)法實驗研究黃芩素對上述細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，黃芩素對所有受試白血病細(xì)胞均有抑制作用，但對于不同組織來源的細(xì)胞其抑制強度不盡相同，并且對上述白血病細(xì)胞的作用具有劑量和時間依賴性。實驗結(jié)果表明，黃芩素對來自于永生化的胚胎干細(xì)胞G1ME細(xì)胞幾乎沒有抑制作用，提示黃芩素可以作為一種特異性抑制惡變白血病細(xì)胞增殖的藥物。細(xì)胞增殖受到抑制可能是細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡導(dǎo)致[14-15]。

本實驗通過用黃芩素處理6133/MPL W515L細(xì)胞的PI染色結(jié)果顯示，隨著黃芩素作用濃度和作用時間的增加，S期細(xì)胞減少，G1/G0期和G2/M期細(xì)胞增加。由此推測，黃芩素可能導(dǎo)致6133/MPL W515L的細(xì)胞周期阻滯在G1/S期。Annexin-V和PI染色檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明，黃芩素對6133/MPL W515L細(xì)胞的凋亡不僅具有劑量依賴性，而且具有時間依賴性。多種因素可以造成細(xì)胞凋亡或周期阻滯。

為探討多個信號通路在該過程中的作用，本實驗通過黃芩素處理6133/MPL W515L細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果表明，隨著黃芩素濃度的增加，IκBα、Akt、Caspase-3及Erk總蛋白含量無明顯變化，但Akt蛋白和剪切的Caspase-3含量升高，p-IκBα蛋白和p-Erk蛋白的含量降低，表明抑制p-IκBα進入細(xì)胞核內(nèi)，通過抑制MAPK-Erk和促進PI3KAkt通路，以及激活Caspase的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為探討Caspase-3在黃芩素誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡中的作用，用Caspase的光譜抑制劑Z-VAD單獨處理6133/MPL W515L細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞增殖不受影響。用Z-VAD和黃芩素同時處理6133/MPL W515L細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Z-VAD不能解救黃芩素導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制，表明黃芩素不只是通過Caspase通路起作用。

黃芩素作為傳統(tǒng)中藥應(yīng)用臨床，大量研究證實其具有廣泛的抗腫瘤活性，作用機制主要有：①影響花生四烯酸系統(tǒng)代謝途徑；②抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期；③誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；④抗腫瘤新生血管生成等。目前有關(guān)其抗腫瘤作用的臨床試驗尚未廣泛開展，隨著對黃芩素抗腫瘤作用及機制研究的逐漸深入，可為中藥抗腫瘤的應(yīng)用提供廣闊前景。

綜上所述，黃芩素能通過多條途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。黃芩素抑制白血病增殖是多因素共同作用的結(jié)果。黃芩素是有效的抗白血病候選藥物。

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（童穎丹 編輯）

Study on molecular mechanism by which baicalein inhibits leukemic cell proliferation

Yan Qian
(Department of Public Health,Wuhan University of Technology,Wuhan,Hubei 430070,China)

R285.5；R733.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.005

1005-8982（2017）23-0023-08

2016-08-26