李靈毅，駱曼

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430030；2.湖北省武漢市第一醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430022）

MiR-194對惡性黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響及機制

李靈毅1，駱曼2

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430030；2.湖北省武漢市第一醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430022）

目的研究miR-194對人惡性黑色素瘤細胞的增殖和凋亡的影響及機制。方法 應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分別檢測miR-194在原代正常人皮膚黑色素細胞系PIG1和5種惡性黑色素瘤細胞系（A375、SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL-28）中的相對表達量。利用LipofectamineTM2000分別將A375細胞系轉(zhuǎn)染miR-194 mimics和陰性對照質(zhì)粒，從而將A375細胞系分為miR-194模擬物組和陰性對照組；應(yīng)用MTT法和流式細胞術(shù)分別測定miR-194模擬物組和陰性對照組細胞的增殖能力及凋亡率，蛋白印跡（Western blot）分別檢測miR-194模擬物組和陰性對照組的細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表達情況。結(jié)果miR-194在5種黑色素瘤細胞系A(chǔ)375、SKMEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL-28中的表達水平低于正常人皮膚黑色素細胞系PIG1，依次分別是正常細胞系的（0.18±0.03）、（0.25±0.05）、（0.37±0.03）、（0.39±0.04）及（0.45±0.03）倍（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后第0、1、2、3、4及5天，miR-194模擬物組vs陰性對照組的OD值分別為：（0.18±0.02）vs（0.19±0.03）（P＞0.05）、（0.29±0.02） vs（0.27±0.03）（P＞0.05）、（0.42±0.08） vs（0.45±0.07）（P＞0.05）、（0.63±0.09）vs（1.17±0.12）（P＜0.05）、（1.05±0.15）vs（2.15±0.21）（P＜0.05）及（1.87±0.23）vs（3.18±0.27）（P＜0.05）。miR-194 模擬物組和陰性對照組的細胞凋亡率分別為24.2%和9.3%（P＜0.05）。Cyclin D1和Cleaved Caspase-3蛋白在miR-194模擬物組中的表達量分別是陰性對照組的（0.36±0.04）和（3.2±0.28）倍（均P＜0.05）。結(jié)論miR-194在黑色素瘤細胞中低表達，miR-194表達上調(diào)可促進黑色素瘤細胞凋亡并抑制黑色素瘤細胞的增殖，其機制可能為下調(diào)Cyclin D1蛋白及上調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白表達。

micR-194；黑色素瘤；增殖；凋亡

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-194 (miR-194)on cell proliferation and apoptosis in melanoma cells and potential underlying mechanism.Methods Real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)was utilized to measure miR-194 in normal primary human skin melanocytes(PIG1)and five kinds of malignant melanoma cells (A375,SK-MEL-1,SK-MEL-2,SK-MEL-5 and SK-MEL-28).A375 melanoma cells were transfected with miR-194 mimics or negative control plasmid via lipofectamine 2000 system.The proliferation capability was measured by MTT assay,and apoptosis rate was determined by flowcytometry.Expressions of Cyclin D1 and cleaved Caspase-3 were detected by Western blot.Results The miR-194 level among A375,SK-MEL-1,SK-MEL-2,SK-MEL-5 and SK-MEL-28 was significantly lower than that in PIG1,and fold of PIG1 was(0.18±0.03),(0.25±0.05),(0.37±0.03),(0.39±0.04),and(0.45±0.03) (P＜0.05),respectively.OD values at 490 nm on day 0,1,2,3,4,and 5 post transfection in the miR-194 mimics group vs the negative control group were(0.18±0.02)vs(0.19±0.03)(P＞0.05),(0.27±0.02)vs(0.29±0.03)(P＞0.05),(0.42±0.08)vs(0.45±0.07)(P＞0.05),(0.63±0.09)vs(1.17±0.12)(P＜0.05),(1.05±0.15)vs(2.15±0.21)(P＜0.05)and(1.87±0.23)vs(3.18±0.27)(P＜0.05),respectively.The apoptosis rate in the miR-194 mimics group vs the negative control group was 24.2%vs 9.3% (P＜0.05).Compared with the negative control group,the miR-194 mimics group had(0.36±0.04)-fold change and(3.2±0.28)-fold change in Cyclin D1 and cleaved Caspase-3,respectively (P＜0.05).ConclusionsThere is low expression of miR-194 in melanoma cells.Up-regulation of miR-194 can promote apoptosis rate and inhibit proliferation of melanoma cells by down-regulation of Cyclin D1 protein and up-regulation of cleaved Caspase-3 protein.

Keywords: miR-194;melanoma;proliferation;apoptosis

惡性黑色素瘤是一類惡性程度較高的皮膚腫瘤[1-2]，常見于皮膚，約占皮膚腫瘤的10%，死亡率可接近80%[3-4]，其發(fā)病率在全球呈不斷上升趨勢[3-4]，有家族聚集傾向[3-4]。本病早期癥狀不典型，我國每年新發(fā)病例持續(xù)增長約2萬例[2]，本病易于早期轉(zhuǎn)移，預后多較差，5年生存率僅約15%[2]。本病死亡率極高，尤其是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，患者中位生存期僅約6月，5年生存率＜5%[5]。本病目前尚無理想的根治手段，因此深入研究惡性黑色素瘤的發(fā)病機制為提高惡性黑色素瘤的療效具有重要意義。miRNA是一類約由18～25nt組成的小分子非編碼RNA，在增殖、分化、代謝、凋亡及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。多種惡性腫瘤的發(fā)生過程與miRNA表達譜的改變密切相關(guān)，miRNA的異常表達是參與腫瘤細胞增殖生長重要分子機制之一[8-10]，因此，miRNA可能成為腫瘤治療的新靶點。miR-194已被證實在其他腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，并存在異常表達[11-15]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)miR-194與惡性黑色素瘤的文獻報道。本研究miR-194對惡性黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，為探求新的有效的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原代正常人皮膚黑色素細胞系PIG1和惡性黑色 素 瘤 細 胞 系 A375、SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL-28（購自中國醫(yī)學科學院），胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國Roswell公司），實驗所需的Cyclin D1、Caspase-3及GAPDH一抗（購自美國BD公司），二抗（購自湖北省武漢博士德生物科技有限公司），miR-194 mimics及Scramble（由廣州銳博生物科技有限公司合成）。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

原代正常人皮膚黑色素細胞系PIG1和惡性黑色素瘤細胞系 A375、SK-MEL-1、SK-MEL-2、SKMEL-5及SK-MEL-28均種植于RPMI 1640培養(yǎng)基并培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，于48 h后消化傳代，利用LipofectamineTM2000分別將A375細胞系轉(zhuǎn)染miR-194 mimics和陰性對照質(zhì)粒，并將A375細胞系分為miR-194模擬物組和陰性對照組，miR-194轉(zhuǎn)染序列：miR-194 mimics-sense正向引物，5'-UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA-3'；miR-194 mimics-antisense反向引物，5'-UCCACAU GGAGUUGCUGUUACAUU-3'。陰性對照組轉(zhuǎn)染序列：miR-194 NC-sence正向引物，5'-UUCUCCGAA CGUGUCACGUTT-3'；NC-anti-sence 反向引物，5'-A CGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

用All-in-One miRNA-194抽提試劑盒和Allin-One miRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒提取和分離miRNAs，ABI Prism 7700 system的SYBR Green Reagents（日本TaKaRa株式會社），qRT-PCR在 ABI 7500 qRT-PCR儀中，以U6小核RNA作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miR-194相對表達水平。

1.4 細胞增殖實驗

采用MTT法，將miR-194模擬物組和陰性對照組兩組細胞消化成單細胞懸液后，按每孔2×103個細胞接種于96孔板上，培養(yǎng)基體積為200 μl。培養(yǎng)24 h后加入5 mg/ml MTT溶液40 μl，孵育4 h后每孔加入200μl DMSO，搖床上充分震蕩。在轉(zhuǎn)染1、2、3、4及5 d后于490 nm波長測定OD值。重復3次，取平均值。

1.5 細胞凋亡測定

采用流式細胞術(shù)，用Annexin V/PI染色檢測，將兩組細胞消化成單細胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin V陽性細胞比例來確定細胞凋亡的變化。

1.6 Western blot法

將miR-194模擬物組和陰性對照組兩組細胞裂解、變性后，以每孔30μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳50 min，分離膠100 V電泳100 min。濕法轉(zhuǎn)膜，加入GAPDH、Cyclin D1及Caspase-3一抗，抗體濃度為1∶300，于4℃孵育過夜，PBST漂洗3遍，二抗（1∶500）37℃孵育 4 h，PBST 漂洗后，ECL 液顯影，用Quantity One 1-D分析灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/GAPDH，實驗重復3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Graph軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-194在黑色素瘤細胞系中的表達

qRT-PCR檢測miR-194在原代正常人皮膚黑色素細胞PIG1和惡性黑色素瘤細胞系的相對表達量，在PIG1細胞系中miR-194相對表達量為1，A375、SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5、及 SKMEL-28細胞系miR-194相對表達量依次為（0.18±0.03）、（0.25±0.05）、（0.37±0.03）、（0.39±0.04）及（0.45±0.03），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=121.13，P=0.000）；經(jīng) LSD-t檢驗，A375、SKMEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-5 及 SK-MEL-28 細胞系miR-194相對表達量均低于PIG1（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-194在正常黑色素細胞系及惡性黑色素瘤細胞系中的表達

圖2 陰性對照組和miR-194模擬物組細胞增殖曲線

2.2 過表達miR-194對A375細胞增殖和凋亡的影響

轉(zhuǎn)染24h后，miR-194模擬物組與陰性對照組miR-194相對表達量分別為（10.3±0.51）vs（1.00±0.00），P＜0.001（見圖 2A）；MTT 實驗顯示，在轉(zhuǎn)染后0、1、2、3、4 及 5 d，miR-194 模擬物組與陰性對照組OD值分別為[（0.18±0.02）vs（0.19±0.03），t=-0.547，P=0.306]、[（0.27±0.02）vs（0.29±0.03），t=-0.960，P=0.195]、[（0.42±0.08）vs（0.45±0.07），t=-0.488，P=0.325]、[（0.63±0.09）vs（1.17±0.12），t=-6.235，P=0.001]、[（1.05±0.15）vs（2.15±0.21），t=-7.382，P=0.000]及[（1.87±0.23）vs（3.18±0.27），t=-6.397，P=0.001]（見圖2B）；流式細胞術(shù)測定兩組凋亡率，結(jié)果顯示，miR-194模擬物組vs陰性對照組凋亡率為[（24.6±2.5）%vs（9.4±1.1）%，t=9.639，P=0.000]。見圖3。

圖3 陰性對照組及miR-194模擬物組凋亡率比較

2.3 miR-194對 Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達的影響

Western blot檢測增殖、凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)miR-194模擬物組中Cyclin D1下調(diào)，而凋亡發(fā)生標志物Cleaved Caspase-3上調(diào)表達，miR-194模擬物組vs陰性對照組Cyclin D1蛋白相對表達量為[（0.36±0.04）vs（1.00±0.00），t=-27.712，P=0.000]；miR-194模擬物組vs陰性對照組Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量為[（3.20±0.28）vs（1.00±0.00），t=13.608，P=0.000]。見圖4。

圖4 miR-194對Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達的影響

3 討論

惡性黑色素瘤常發(fā)病于皮膚，有極高的死亡率[4]。惡性黑色素瘤就診時往往就已經(jīng)進入晚期[16]。盡管與西方發(fā)達國家相比，惡性黑色素瘤在我國的發(fā)病率較低，但是本病發(fā)生率在我國依然呈上升趨勢，保守估計每年大約有2萬例新發(fā)患者[2]。本病預后較差，5年生存率不足20%[2]，若是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，患者的中位生存期約為半年左右，5年生存率不足5%[5]。

目前，研究miR-194與惡性黑色素瘤關(guān)系的文獻報道較少，但是個別文獻已經(jīng)證實microRNA在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展中所起的作用[17-18]，miR-194-33a過表達可抑制人皮膚惡性黑色素瘤細胞系A(chǔ)375的增殖、黏附、遷移及侵襲[17]，孫慧娟[18]等學者亦證實上調(diào)miR-205的表達后，人皮膚惡性黑色素瘤細胞系A(chǔ)375的增殖、黏附以及遷移均有不同程度的減低。然而目前關(guān)于miR-194的研究主要集中消化道腫瘤方面，且miR-194對腫瘤的調(diào)控作用與其和p53基因密不可分[19]。miR-194在結(jié)腸癌、食管癌及胰腺癌細胞中存在異常表達，并其與p53基因的關(guān)系可能是miR-194作為MDM2（雙微體2癌基因）/p53調(diào)節(jié)回路的重要分子，能反饋性地對MDM2/p53蛋白的表達起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[12,19-20]。miR-194在肝細胞癌中高表達，可抑制肝星狀細胞的過度激活，從而抑制肝纖維化進展及肝癌細胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14，21]。miR-194表達異常能夠調(diào)控腸上皮細胞發(fā)生變異，并對腸道腫瘤的轉(zhuǎn)移起到正向調(diào)控作用[22]。此外，尚有研究表明，miR-194也與晝夜生理節(jié)律有著密切的關(guān)系[23]。本研究證明miR-194在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中起到的關(guān)鍵作用。

本研究miR-194對黑色素瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制。首先，筆者利用qRT-PCR法證明miR-194在5種人惡性黑色素瘤細胞系中較正常人皮膚黑色素細胞系低表達，提示其可能起“抑癌基因”的作用；其次，對惡性黑色素瘤細胞系轉(zhuǎn)染miR-194后，筆者發(fā)現(xiàn)miR-194過表達可促進人惡性黑色素瘤細胞系A(chǔ)375的凋亡同時抑制A375細胞增殖。

作為細胞周期G1/S期檢查點，Cyclin D1在細胞增殖調(diào)控過程中起著重要的作用，若其持續(xù)激活，將導致G1期縮短，細胞提前進入到S期，進而導致增殖失調(diào)，而引起腫瘤發(fā)生[24]，其在非小細胞肺癌及乳腺癌等腫瘤中都存在高表達[25-26]，本研究中，進一步探討miR-194對細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，miR-194下調(diào)Cyclin D1的表達，其機制可能為miR-194下調(diào)Cyclin D1的表達，并進而抑制細胞周期提前進入到S期，進而抑制細胞增殖過程。與增殖相反的過程是凋亡，細胞凋亡途徑主要包括兩條，內(nèi)源性途徑和外源性途徑[27]，內(nèi)源性途徑主要由線粒體介導，在多種凋亡刺激信號的刺激下，線粒體外膜通透性發(fā)生改變，并進一步激活Caspase-3、8及9，并將DNA裂解為180～200 bp大小的片段，進而引起凋亡小體；而外源性途徑，由死亡受體所介導，并進一步激活Caspase-3、8而誘導凋亡，Caspase-3是內(nèi)源性和外源性途徑的最終作用分子[28]。本研究中檢測miR-194模擬物組發(fā)現(xiàn)Caspase-3蛋白表達量高于陰性對照組，表明其誘導凋亡的機制可能為通過上調(diào)Caspase-3而起作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-194在黑色素瘤細胞中呈低表達，miR-194表達上調(diào)可促進黑色素瘤細胞凋亡并抑制黑色素瘤細胞的增殖，其機制可能是通過下調(diào)Cyclin D1蛋白及上調(diào)Cleaved Caspase-3蛋白水平而實現(xiàn)的，這為深入了解黑色素瘤的發(fā)病機制提供新的視野，可能作為新的治療靶點。

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Effect of miR-194 on cell proliferation and apoptosis in melanoma cells and potential mechanism

Ling-yi Li1,Man Luo2
(1.Department of Dermatology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China;2.Department of Oncology,the First Hospital of Wuhan,Wuhan,Hubei 430022,China)

R730.261

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.006

1005-8982（2017）21-0031-06

2017-02-14

駱曼，E-mail：luomansunshine@163.com