董行 羅以勤 葉書來

肺癌患者血小板中VEGF與TSP-1測定的臨床應用價值

董行 羅以勤 葉書來

目的 探討血小板中血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）與凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）測定在肺癌進展中的臨床應用價值。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測71例最終確診為肺癌的患者及35例健康體檢者的血小板與貧血小板血漿（PPP）中的VEGF與TSP-1水平。結(jié)果 與正常對照組比較，肺癌未轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移患者血小板中VEGF水平及VEGF/ TSP-1比值均明顯升高（P＜0.05）；肺癌轉(zhuǎn)移患者血小板中VEGF及VEGF/TSP-1比值高于肺癌未轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；肺癌未轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)移患者血小板中TSP-1水平明顯低于對照組（P＜0.05）；肺癌組與對照組所有個體的貧血小板血漿中的VEGF與TSP-1均低于檢測下限而未能檢出。結(jié)論 肺癌患者血小板中VEGF與TSP-1平衡關(guān)系發(fā)生改變，并且血小板VEGF與VEGF/TSP-1水平有助于反映肺癌的轉(zhuǎn)移情況。

肺癌血管內(nèi)皮細胞生長因子 凝血酶敏感蛋白-1 血小板

目前，肺癌的發(fā)病率和病死率迅速上升，已躍居全世界癌癥死因的第一位，嚴重危及人類的身體健康。20世紀70年代，F(xiàn)olkman提出了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成的理論[1]。腫瘤血管的生成依賴于血管形成促進因子和抑制因子之間的平衡調(diào)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)外周血血管形成調(diào)節(jié)因子水平能夠反映腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及預后，所以血管形成調(diào)節(jié)因子有可能成為一種新的腫瘤標記物[3]。然而，血液中大部分血管形成調(diào)節(jié)因子來源于血小板，如血管形成促進因子（VEGF）70%以上由血小板釋放，這也就是除具有止血、組織修復等功能外，血小板在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用的原因之一[4]。血管形成相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白存在于血小板α顆粒，避免血液中各種血漿蛋白酶的降解[5]，因此相對于血清、血漿，檢測血小板中此類蛋白能更好地反映腫瘤進程中血管生成調(diào)節(jié)因子的真實水平[5，6]。本研究通過檢測肺癌患者血小板中具有代表性的VEGF和抑制因子（TSP-1）的水平，初步探討血小板中血管形成調(diào)節(jié)因子在肺癌進展中的臨床應用價值。

對象與方法

1 對象

1.1 肺癌組：按照最新的肺癌病理診斷標準，收集2015年5月～2016年5月的肺癌患者71例，男44例，女27例。其中肺癌未轉(zhuǎn)移患者33例，年齡32～71歲，平均年齡52.64歲；肺癌轉(zhuǎn)移患者38例，年齡45～79歲，平均年齡62.85歲。

1.2 對照組：在采集肺癌患者血液標本的同時，在排除具有各種血管病變的疾?。ㄈ缣悄虿?、高血壓等）后，隨機選取性別、年齡均相近的體檢者35例為對照組，其中男21例，女14例，年齡41～68歲，平均年齡56.75歲。

2 儀器與試劑 CTAD（枸櫞酸鹽、茶堿、腺苷、潘生?。┛鼓埽ㄉ虾？迫A公司）；Sysmex KX-2100血球分析儀（日本Sysmex公司）；Thermo scientific恒溫離心機（美國）；RIPA裂解液（上海碧云天）；CUSABIO ELISA試劑盒（美國CUSABIO BIOTECH公司）

3 方法

3.1 血標本采集：使用CTAD抗凝管采集空腹靜脈血約3ml。CTAD抗凝血用于制備貧血小板血漿和一定濃度的血小板。所采集的血液標本須在2h內(nèi)進行處理。

3.2 定量血小板的制備：3 mlCTAD抗凝血顛倒混勻后于24℃條件下離心（150 g，10 min）。提取約1ml富血小板血漿（避免吸入紅細胞）于24℃條件下離心（900 g，20 min）。將上層的貧血小板血漿轉(zhuǎn)移至一個新EP管中，血小板沉淀通過含有CTAD的緩沖液清洗2次后，加入一定量的CTAD緩沖液以形成血小板懸液。此懸液通過Sysmex血球分析儀檢測血小板濃度后，對其調(diào)整為2×108/ ml濃度的血小板懸液。編號并分裝保存于–80℃冰箱待測。

3.3 貧血小板血漿的提?。河?.2步驟中所獲得的貧血小板血漿，經(jīng)再次離心（900 g，20 min）吸取上層血漿后編號，并分裝保存于-80℃冰箱中保存待測。

3.4 血小板、血漿中VEGF與TSP-1水平檢測：將分裝的血小板懸液和貧血小板血漿從低溫冰箱中取出，置于室溫下充分溶解，在血小板懸液中RIPA裂解液于4℃條件下充分裂解血小板。 然后將裂解后的血小板與血漿在室溫下離心（10 000 g，5 min）。吸取100 ul標準品和離心后的樣本上清加入微量孔中；37℃溫育2 h后棄去反應板中的液體，在標準品和樣本孔中分別加入100 ul生物素標記抗體，37℃溫育1 h。洗板后，每孔加入辣根過氧化物酶標記的親和素抗體100 ul，37℃溫育1 h。溫育洗板后，依序每孔加入底物溶液90ul，37℃避光顯色。30 min內(nèi)，若肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度藍色，即可終止反應。用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度值，根據(jù)標準孔的濃度及其光密度值制作標準曲線，通過樣本光密度值和標準曲線得出各個樣本濃度。將由血小板樣本所得到的濃度換算成每106個血小板來表示。

4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差（

結(jié) 果

1 肺癌未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF高于對照組（P＜0.05），而兩組的血小板中TSP-1水平分別低于對照組（P＜0.05），見表1。肺癌轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF高于未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），但血小板中TSP-1在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。此外，肺癌未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF/ TSP-1比值高于對照組（P＜0.05），且肺癌轉(zhuǎn)移組血小板中VEGF/TSP-1比值高于肺癌未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。

表1 肺癌組與對照組血小板中VEGF、TSP-1檢測結(jié)果比較

2 肺癌組與對照組中所有實驗對象的貧血小板血漿VEGF與TSP-1水平均低于檢測限，結(jié)果表明采用CTAD的抗凝血中血小板并沒有發(fā)生活化而釋放VEGF。

肺癌是一種富含豐富血管的腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的生成。在腫瘤微環(huán)境中，新生血管的生成受到血管生成促進因子和血管生成抑制因子的平衡調(diào)控。作為最具有代表性的血管生成促進因子，VEGF在促進肺癌的血管生成以及肺癌的生長和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮了重要作用[7]。TSP-1是最早發(fā)現(xiàn)的一種具有代表性的內(nèi)源性血管生成抑制因子[8]。目前，對于VEGF和TSP-1在肺癌患者血小板中量的變化以及兩者之間的平衡關(guān)系還未見報道。

VEGF主要由血管內(nèi)皮細胞生成，肺癌組織及其周圍細胞也能夠分泌VEGF[9]。因此，在肺癌患者的血循環(huán)中，VEGF升高可能主要來自于腫瘤組織及其周圍細胞。通過研究發(fā)現(xiàn)，血小板具有選擇性的吸收血液中血管生成調(diào)節(jié)因子的作用[10]。以血小板為媒介，通過血小板傳遞VEGF到達腫瘤的微環(huán)境以促進腫瘤的血管生成[11，12]。有研究表明，相對于血小板外的血漿成份，血小板的α顆粒中存在著各種高濃度的血管形成調(diào)節(jié)蛋白，如VEGF、PDGF、TSP-1等[5]。Peterson等通過研究發(fā)現(xiàn)，在血小板中VEGF濃度是相應血漿的215倍[5]。因此，在腫瘤患者血小板中VEGF的濃度變化比其對應的血漿濃度變化可能更加敏感。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組和對照組的所有貧血小板血漿樣本中，VEGF含量均低于試劑盒檢測下限而未能檢出，可見，采用CTAD的抗凝血中血小板并沒有發(fā)生活化而釋放VEGF。而且腫瘤的存在并沒有影響血漿樣本中VEGF量的變化，這主要是由于血小板選擇性吸收VEGF將其聚集到血小板內(nèi)；其次，在采集血標本與提取血小板標本時，血小板并沒有因為人為操作而引起活化以至于釋放VEGF到血漿中。表1結(jié)果顯示，肺癌未轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組血小板中的VEGF含量均明顯高于對照組，而肺癌轉(zhuǎn)移組血小板VEGF含量高于肺癌未轉(zhuǎn)移組。可見，在肺癌的進展和轉(zhuǎn)移中，VEGF量的變化不僅反映腫瘤的存在和進展，而且相對于貧血小板血漿，VEGF在血小板中量的變化也顯得尤為敏感。

TSP-1作為一種具有代表性的抑制腫瘤血管形成的內(nèi)源性抑制因子[8]。雖然外周血中TSP-1的量與肺癌組織中表達量的關(guān)系需要進一步研究，但本研究結(jié)果顯示，血小板中TSP-1含量在肺癌患者中降低較明顯。此外，TSP-1與VEGF在肺癌患者外周血中的平衡關(guān)系也發(fā)生了較明顯的變化。目前，在血小板α顆粒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在著很多血管形成的促進和抑制因子[4]，其中具有代表性的就有VEGF與TSP-1。另外，作為反映血小板是否活化的敏感指標，在相應的貧血小板血漿中，TSP-1在各組中的水平均低于檢測限以下?？梢?，在血小板提取的過程中并沒有發(fā)生活化。

本研究采用CTAD抗凝血來避免血小板活化，通過研究血小板中VEGF與TSP-1的含量及其變化來反映肺癌的血管形成與腫瘤進展，以此研究肺癌及其他類型的腫瘤提供了潛在的腫瘤標記物。此外，本研究也為如何使用VEGF的抗體作為藥物，以及如何構(gòu)建含有高濃度TSP-1的血小板來治療腫瘤提供了依據(jù)。

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The Application Value of Platelet VEGF and TSP-1 Detections in the Lung Cancers

DONG Hang，LUO Yi-qin，YE Shu-lai.
Department of Laboratory Medicine，Anhui Provincial Hospital（Southern Branch）230001

Objective To investigate the clinical application of platelet vascular endothelial growth factor（VEGF）and TSP-1 determination in the progression of lung cancers. Methods The levels of VEGF and TSP-1 in platelets and platelet-poor plasma（PPP）in 71 patients with lung cancers and 35 healthy controls were determined by ELISA method. Results The levels of platelet VEGF and VEGF/TSP-1 in patients with unmetastatic lung cancers and metastatic lung cancers were significantly higher than those in healthy controls （P＜0.05）； the levels of platelet VEGF and VEGF/ TSP-1 in patients with metastatic lung cancers were significantly higher than those in patients with unmetastatic lung cancers （P＜0.05）. Moreover，the levels of platelet TSP-1 in patients with unmetastatic lung cancers and metastatic lung cancers were remarkably lower than those in healthy controls （P＜0.05）. However，the PPP VEGF and TSP-1 in the patients and control group were undetactable （＜7.18 pg/ml）. Conclusions The balance between the levels of VEGF and TSP-1 is shifted in the peripheral blood of patients with lung cancers，and the levels of platelet VEGF and VEGF/TSP-1 will help to reflect the progression of lung cancers.

Lung cancer VEGF TSP-1 Platelet

R734.2 R446.11

A

1671-2587（2017）04-0397-04

2016-11-25）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.025

230001 安徽省立醫(yī)院南區(qū)檢驗科

董行（1984–），男，安徽宿松人，檢驗師，主要從事血液病檢驗診斷，（E-mail）258028284@qq.com。