嚴(yán)鳳好 鐘展華 李雪群 萬(wàn)小春

HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)結(jié)果分析*

嚴(yán)鳳好 鐘展華 李雪群 萬(wàn)小春

目的 通過(guò)對(duì)HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免結(jié)果雙陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測(cè)（NAT），分析兩種檢測(cè)方法的結(jié)果差異和鑒別試驗(yàn)的反應(yīng)性項(xiàng)目，為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊(duì)提供理論依據(jù)。方法 分別用兩種酶免試劑對(duì)獻(xiàn)血者血液進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV血清學(xué)檢測(cè)，對(duì)酶免陰性及單試劑反應(yīng)性標(biāo)本8人份混樣進(jìn)行HBV、HCV、HIV三聯(lián)核酸定性檢測(cè)，對(duì)NAT呈反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行鑒別試驗(yàn)確定反應(yīng)性的具體標(biāo)本。結(jié)果 31 065份血液標(biāo)本中酶免雙試劑陰性30254份，單試劑反應(yīng)性241份，其中進(jìn)口試劑180份，國(guó)產(chǎn)試劑61份，主要集中在HCV和HIV進(jìn)口試劑，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)行8人份混樣NAT檢測(cè)共有54份呈反應(yīng)性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鑒別實(shí)驗(yàn)檢出39份HBV，其中ELISA陰性標(biāo)本鑒別出37份陽(yáng)性，單試劑反應(yīng)標(biāo)本中鑒別出2份，未拆分出HCV、HIV陽(yáng)性標(biāo)本，總拆分陽(yáng)性率為72.2% 。結(jié)論 酶免單試劑反應(yīng)性結(jié)果的假陽(yáng)性率較高，核酸檢測(cè)能提高對(duì)病毒的檢測(cè)能力，有效降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)，選擇兩者互補(bǔ)的檢測(cè)模式，對(duì)酶免單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤隨訪和復(fù)查，可為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊(duì)提供理論支撐，有利于獻(xiàn)血者的召回。

單試劑反應(yīng)性 核酸檢測(cè) 鑒別實(shí)驗(yàn)

降低輸血相關(guān)病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)是輸血行業(yè)乃至全醫(yī)療行業(yè)、全社會(huì)所關(guān)注的問(wèn)題，核酸檢測(cè)（NAT）被公認(rèn)為是降低血清學(xué)窗口期漏檢風(fēng)險(xiǎn)及低病毒載量檢出的最佳解決方法[1]。酶聯(lián)免疫（ELISA）方法作為我國(guó)血源篩查中普遍使用的檢測(cè)技術(shù)，在保障輸血安全方面也起到重要作用，然而，因單試劑陽(yáng)性結(jié)果不確定性和假反應(yīng)性造成獻(xiàn)血者被淘汰的概率非常大。據(jù)調(diào)查顯示，全國(guó)每年因血液篩查不合格淘汰的獻(xiàn)血者約20萬(wàn)人次，其中單試劑不合格淘汰的獻(xiàn)血者約10萬(wàn)人次[2]。既浪費(fèi)寶貴的血液資源，也損害了獻(xiàn)血者身心和名譽(yù)，甚至給其家庭帶來(lái)不必要的誤會(huì)和困擾。本文通過(guò)對(duì)HBsAg、HCV、HIV酶免結(jié)果雙陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測(cè)，分析兩種檢測(cè)方法的結(jié)果差異和鑒別試驗(yàn)的反應(yīng)性項(xiàng)目，旨在為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊(duì)提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

1 對(duì)象 惠州血站2016年2～7月自愿無(wú)償獻(xiàn)血者31 065名，獻(xiàn)血者均符合健康檢查要求。每位獻(xiàn)血者留取2管標(biāo)本，一管為5 ml EDTA-K2真空采血管（用于ELISA檢測(cè)），一管為5 ml EDTA-K2分離膠真空采血管（用于NAT 檢測(cè)）。NAT 管采集后4 h內(nèi)離心，在標(biāo)本采集后48 h內(nèi)完成各項(xiàng)檢測(cè)，不能完成的置-20℃密閉保存，并于7 d內(nèi)檢測(cè)。

2 試劑與儀器 S T A R全自動(dòng)加樣儀（瑞士HAMILTON），F(xiàn)AME24/20全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)（瑞士HAMILTON），Ampli STAR 全自動(dòng)核酸提取純化儀（瑞士HAMILTON），ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI）。酶免試劑：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）采用新創(chuàng)（批號(hào)2015095132）和Bio-Rad（批號(hào)20150703）；抗-HCV采用萬(wàn)泰（批號(hào)CS20150806）和Ortho（批號(hào)E X E 2 5 2）；抗-H I V采用萬(wàn)泰（批號(hào)I20150716）和DiaSorin（批號(hào)D363710）。核酸試劑：HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA三聯(lián)檢核酸試劑（批號(hào)20160105）以及HIV-1 RNA、HCV RNA劑、HBV DNA 鑒別試劑均購(gòu)自蘇州華益美公司（批號(hào)20160105）。所用試劑均為經(jīng)檢驗(yàn)合格且在有效期內(nèi)使用；所用儀器設(shè)備均按要求進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，并確保儀器在正常工作狀態(tài)下運(yùn)轉(zhuǎn)。

3 方法

3.1 酶免檢測(cè)：將標(biāo)本按要求進(jìn)行離心處理，用不同的加樣系統(tǒng)、不同的酶免分析系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)，按各試劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)程進(jìn)行操作。結(jié)果以S/CO≥0.80為反應(yīng)性，兩種試劑均無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本判定為試劑室溫放至平衡后，使用STAR全自動(dòng)加樣儀進(jìn)行全自動(dòng)加樣，采用FAME 24/20全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)處理。初檢采用國(guó)產(chǎn)試劑、復(fù)檢采用進(jìn)口試劑；任一種試劑有反應(yīng)性的標(biāo)本需剪血袋辮子用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)查，復(fù)查雙孔均無(wú)反應(yīng)性判定ELISA 陰性，否則判定ELISA 陽(yáng)性。

3.2 核酸檢測(cè)：挑出酶免雙陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)酶免陰性及單試劑陽(yáng)性的標(biāo)本采用8人份樣本混和檢測(cè)模式進(jìn)行HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA 三聯(lián)核酸檢測(cè)，無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本為NAT 陰性，對(duì)有反應(yīng)性的混合標(biāo)本分別進(jìn)行拆分鑒別檢測(cè)，以確定具體的陽(yáng)性標(biāo)本。拆分檢測(cè)后呈反應(yīng)性的標(biāo)本判為不合格，無(wú)反應(yīng)性的標(biāo)本為合格。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ELISA試劑單檢陽(yáng)性情況 31 065份標(biāo)本中有570份呈雙試劑陽(yáng)性，241份呈單試劑反應(yīng)性，其中進(jìn)口試劑180份，國(guó)產(chǎn)試劑61份，進(jìn)口HCV和HIV試劑較高，分別為0.17%和0.28%，與國(guó)產(chǎn)試劑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1 。

表1 2016年2～7月ELISA試劑單檢陽(yáng)性情況

2 ELISA陰性與單試劑反應(yīng)性標(biāo)本NAT檢測(cè)情況剔除酶免雙陽(yáng)性標(biāo)本后共有30 495份標(biāo)本進(jìn)行了8人份混樣NAT檢測(cè)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行拆分鑒別發(fā)現(xiàn)，30 254份ELISA陰性標(biāo)本NAT鑒別出37份陽(yáng)性，241份單試劑反應(yīng)標(biāo)本中鑒別出2份陽(yáng)性，見表2。

表2 30 495份標(biāo)本ELISA與NAT檢測(cè)結(jié)果

3 NAT混檢陽(yáng)性標(biāo)本拆分鑒別情況 30 495份標(biāo)本進(jìn)行8人份混樣NAT檢測(cè)共檢出54份反應(yīng)性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鑒別實(shí)驗(yàn)檢出39份HBV，總拆分陽(yáng)性率為72.2% ，未拆分出HCV、HIV陽(yáng)性標(biāo)本，見表3。

表3 NAT混檢陽(yáng)性標(biāo)本拆分鑒別結(jié)果

討 論

2015年3月國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)在《關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知》中明確規(guī)定，2015年血站核酸檢測(cè)要覆蓋全國(guó)[3]。雖然近年來(lái)ELISA試劑盒的靈敏度、特異性不斷改進(jìn)，但仍然無(wú)法避免病毒感染窗口期、病毒變異、免疫沉默等因素造成的漏檢[4，5]，NAT檢測(cè)可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別由56 d、70 d、22 d縮短為41 d、12 d和11 d[6，7]，而且不受病毒變異、個(gè)體免疫因素影響，使輸血感染相關(guān)病毒的風(fēng)險(xiǎn)降到最低，極大程度地保障血液安全。

之前，我站采用兩種酶免試劑（一種國(guó)產(chǎn)一種進(jìn)口）對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，開展核酸檢測(cè)后，為節(jié)約成本，選擇一種酶免試劑聯(lián)合一種核酸試劑進(jìn)行檢測(cè)，然而，該保留何種試劑必須經(jīng)過(guò)可靠的評(píng)估。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，ELISA試驗(yàn)的假陽(yáng)性率還是較高，尤其是本站目前所使用的HCV和HIV進(jìn)口試劑，與國(guó)產(chǎn)試劑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），除了與試劑的靈敏度有關(guān)外，還可能由以下因素引起[8]：標(biāo)本溶血、脂血或血漿中存有纖維蛋白等物質(zhì)；加樣或洗板過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染或拖帶現(xiàn)象；不同生產(chǎn)廠家使用的抗原抗體原料不同；人體內(nèi)其他非病毒抗體的干擾等。HIV使用第四代試劑后，增加了P24抗原檢測(cè)，靈敏度大大提高；同時(shí)，由于部分正常人血清可能存在對(duì)P24抗原檢測(cè)造成干擾的物質(zhì)，導(dǎo)致陽(yáng)性率較高。因試劑原因出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果造成血液報(bào)廢，提示應(yīng)該選用高質(zhì)量試劑進(jìn)行檢測(cè)。核酸檢測(cè)方面，2016年2～7月，排除雙陽(yáng)性血樣后，本站共有30 495份標(biāo)本進(jìn)行8孔混樣NAT檢測(cè)，檢出54例反應(yīng)性，拆分確認(rèn)后共鑒別出39例HBV DNA（30 254份ELISA陰性中檢出37例，241份ELISA單陽(yáng)性中檢出2例），HBV DNA的拆分陽(yáng)性率為84.8%，未拆分出HCV RNA和HIV RNA，總拆分陽(yáng)性率為77.2%，高于程衛(wèi)芳等報(bào)道的59%[9]和田耘博等報(bào)道的37%[10]，可能與所選試劑及處理方法有關(guān)。有研究表明，HBV、HCV病毒經(jīng)9.6倍超濃縮處理后，含量分別是原有含量的5.92±1.98倍和4.7±1.43倍，有利于提高NAT檢測(cè)靈敏度和提高篩查反應(yīng)性標(biāo)本的鑒別陽(yáng)性率[11]。本研究中酶免陰性標(biāo)本HBV DNA 的檢出率為1.21‰（37/30 414），比重慶[10]、南京[12]等地區(qū)略高，與廣東地區(qū)乙肝流行率高有關(guān)，本站開展NAT檢測(cè)后至少規(guī)避了1/818的輸血感染HBV風(fēng)險(xiǎn)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NAT在降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮舉足輕重的作用，特別是對(duì)于HBV的傳播，與血清學(xué)的“補(bǔ)漏”效果較好，與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)論相一致[13，14]。ELISA與NAT兩種方法檢測(cè)的病毒標(biāo)志物不同，各標(biāo)志物在外周血中存在時(shí)間亦有差別，提示這兩種檢測(cè)技術(shù)均可能出現(xiàn)漏檢和假陽(yáng)性，二者聯(lián)合應(yīng)用篩查血液更能提高血液安全性。對(duì)于HBsAg、HCV、HIV 項(xiàng)目ELISA單試劑陽(yáng)性的獻(xiàn)血者，建議采供血機(jī)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行追蹤，讓其進(jìn)入重新歸隊(duì)程序，24周后再次采血進(jìn)行ELISA和NAT檢測(cè)[15]，結(jié)果均為陰性者可重新歸于獻(xiàn)血者隊(duì)伍進(jìn)行獻(xiàn)血，結(jié)果仍為單試劑陽(yáng)性的獻(xiàn)血者可以通過(guò)確證試驗(yàn)來(lái)鑒別，確證試驗(yàn)陰性的獻(xiàn)血者可進(jìn)入下一輪追蹤檢測(cè)。這一方面是對(duì)獻(xiàn)血者負(fù)責(zé)；另一方面也能最大限度地保留壯大無(wú)償獻(xiàn)血隊(duì)伍。

無(wú)償獻(xiàn)血工作任重道遠(yuǎn)，血液安全至關(guān)重要，在ELISA檢測(cè)的基礎(chǔ)上增加NAT檢測(cè)很有必要，如何結(jié)合實(shí)際情況，選擇最適合的檢測(cè)模式是各血站需要慎重考慮的問(wèn)題。

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3 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知.國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2015〕11號(hào).2015.

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Analysis of Nucleic Acid Tests in HBsAg，Anti-HCV，Anti-HIV ELISA Negative or Single Reagent Reactive Blood Donors

YAN Feng-hao，ZHONG Zhan-hua，LI Xue-qun，et al. Huizhou Blood Center，Huizhou，516000

Objective Nucleic acid tests were performed in the blood donors and compared with the results of ELISA double negative and single reagent reactive in HBsAg，Anti-HCV and Anti-HIV so as to provide a basis for distinguishing the false positive blood donors. Methods Two ELISA reagents were used to detect seral HBsAg，HCV and HIV in the donors，and 8 specimens of ELISA negative and single reagent positive samples were subjected to DNAs detections. All DNAs positive samples were identified. Results In 31 065 blood samples，30 254 cases were found to be negative with double ELISA，and 241 cases were positive with single reagent examination，among them 180 cases were detected with imported kits and 61 with domestic reagents. A significant difference was seen in different reagents. DNAs detection showed 54 positive samples including 46 HBV，3 HCV，and 5 HIV. Identification tests revealed 39 positive HBV，among them 37 and 2 cases were found from ELISA negative and single reagent positive samples，respectively. Neither HCV nor HIV was discovered and total positive rate was 72.2%.Conclusion ELISA single reagent reactive result gives rise to a high false positivity while DNAs examination may improve the efficacy of virus diagnosis. Complementaryexaminations are recommended so as to induce the risk of blood transfusion of infectious diseases.

Single reagent reactive Nucleic acid detection Identification tests

R446.61 R392.11

A

1671-2587（2017）04-0379-04

2017-01-30）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.020

*本課題受惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助（項(xiàng)目編號(hào)：2015Y125）

516000 廣東省惠州市中心血站

嚴(yán)鳳好（1980–），女，廣東惠州人，副主任技師，碩士，主要從事血液檢測(cè)和臨床輸血技術(shù)工作，（Tel）13725046736（E-mail）775443294@qq．com。