宋磊+孟國慶+郭燕風+王傳寶+王宜磊

摘要：本研究利用乙醇初步提取發(fā)酵液中透明質酸，確定最佳提取方案為乙醇體積分數(shù)60%，洗滌次數(shù)為兩次。然后，以透明質酸含量為指標，在單因素試驗的基礎上，采用根據Box-Behnken原理設計的響應面法優(yōu)化透明質酸純化工藝。方差分析和交互作用分析表明，最佳純化工藝為NaCl濃度45 g/L，溫度55℃，pH值9.6，在此工藝條件下，透明質酸含量為93.71%。本工藝所生產的透明質酸純度較高，符合化妝品、醫(yī)藥行業(yè)標準，具有廣泛的應用價值。

關鍵詞：透明質酸；發(fā)酵液；分離純化；響應面

中圖分類號：TS218文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）03-0134-06

AbstractIn this research， the hyaluronic acid was preliminarily extracted from fermentation broth using alcohol. The best extraction parameters were ethanol volume fraction of 60% and washing for two times. Using the content of hyaluronic acid as indicator， single-factor experiments were performed. Then the response surface analysis based on Box-Behnken experimental design was carried out to optimize the purification process of hyaluronic acid. Through analysis of variance and interaction， the optimal purification process was NaCl additive amount of 45 g/L， temperature of 55℃ and pH value of 9.6. Under the optimized conditions， the actual content of hyaluronic acid reached up to 93.71%. By this process， the content of hyaluronic acid was higher， which conformed to the stands of cosmetic and pharmaceutical industries， so it had extensive application value.

KeywordsHyaluronic acid； Fermentation broth； Separation and purification； Response surface

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種高分子量的酸性黏多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通過β-1，4和β-1，3糖苷鍵反復交替連接而成[1]，由于其獨特的流變學特性、黏彈性、保濕性以及良好的生物相容性，透明質酸在化妝品、醫(yī)學領域都有廣泛的應用[2]。透明質酸用于食品領域還處于起步階段。近年來國內外關于HA口服后吸收、代謝和功效的研究越來越多，大量科學證據證明了其功效。特別是2008年5月，國家衛(wèi)生部按照《新資源食品管理辦法》的規(guī)定發(fā)布相關公告，批準透明質酸鈉作為一種新資源食品用于保健食品原料。這一公告的發(fā)布必將進一步推動HA在我國保健食品中的應用。

微生物發(fā)酵法是目前透明質酸的主要生產方式，而下游分離純化工藝是獲得高純度HA的關鍵環(huán)節(jié)，也是制約多數(shù)企業(yè)生產高標準透明質酸的瓶頸。根據透明質酸國家質量標準和行業(yè)標準，成品中熱源蛋白質含量越低，透明質酸含量越高，產品質量越高。因此，除去發(fā)酵液中的熱源蛋白是透明質酸分離純化的首要任務。

依據文獻，從發(fā)酵液中分離提純透明質酸主要有大量稀釋膜濾法、季銨鹽法、氯仿法、酶法、離子交換層析等[3-5]，這些方法存在生產成本高、操作復雜、純度和回收率低、環(huán)境不友好等諸多缺點，不利于在工業(yè)中應用。本研究利用乙醇對發(fā)酵液中透明質酸進行初步粗提，之后采用響應面法優(yōu)化純化工藝，得到了純度和產率都較高的透明質酸，并在山東某透明質酸生產工廠得到應用，具有較大的實際生產參考價值。

1材料與方法

1.1材料與儀器

透明質酸發(fā)酵液：山東某透明質酸生產公司提供；β-葡萄糖醛酸：購自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）：購自北京欣經科生物技術有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

UV-1910型紫外-可見分光光度計（北京普析），D2F-6090真空烘箱（上海精宏實驗設備有限公司），LXJ-ⅡB 低速大容量離心機（上海精密儀器儀表有限公司），79480型真空冷凍干燥機（Labconco 公司），ALC-1100型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1工藝流程透明質酸發(fā)酵液→乙醇粗提→洗滌→溶解→純化→過濾→調整pH值→95%乙醇沉淀→真空冷凍干燥→成品。

1.2.2透明質酸粗提①粗提乙醇體積分數(shù)的選擇：在快速攪拌下，分別向1 000 mL新鮮HA發(fā)酵液中加入95%的乙醇，使混合液中乙醇終體積分別控制在30%、40%、50%、60%、70%。加入過程需緩慢，避免大結塊沉淀產生。加入完畢后快速攪拌10 min，靜置1 h后置于1 000 r/min離心機中離心5 min。取沉淀，測HA含量，考察添加不同體積乙醇對于HA提取量的影響。②洗滌次數(shù)的確定：取離心后沉淀，加入300 mL 95%乙醇進行洗滌，洗滌次數(shù)分別為1、2、3次?？疾煜礈齑螖?shù)對于溶液透光率、HA提取量的影響。③透明質酸溶解方案的確定：取洗滌后沉淀，加入1 500～4 000 mL去離子水進行溶解。以溶解后粘度作為確定溶解相應方案的指標。