王晶+殷亮++++++呂涌濤++++++馮肖亞

[摘要] 目的 研究紅藻氨酸（KA）致大鼠顳葉癲癇（TLE）后腺苷酸激酶2（AK2）的表達(dá)變化，探討AK2參與顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制。 方法 將60只雄性SD大鼠分為正常組（10只）和模型組（50只），模型組建立TLE模型；按致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、1周對(duì)模型組再次進(jìn)行分組，每組各10只。利用半定量RT-PCR法及Western bloting技術(shù)檢測(cè)AK2 mRNA及蛋白在大鼠額葉及海馬中的表達(dá)變化。 結(jié)果 致癇后額葉及海馬組織中AK2 mRNA及蛋白表達(dá)均較正常組明顯升高（P < 0.05）；致癇后3 d組AK2 mRNA及蛋白含量達(dá)到高峰，致癇后1周逐漸降低（P < 0.05）。 結(jié)論 AK2可能參與癲癇的發(fā)生機(jī)制，為癲癇發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 紅藻氨酸；癲癇；腺苷酸激酶2；線粒體；凋亡

[中圖分類號(hào)] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（c）-0014-04

[Abstract] Objective To determine the expression levels of multifunction cytokine AK2 in kainic acid-induced epileptic rat， and to investigate whether AK2 participates in the pathogenesis of EP. Methods 60 male SD rats were divided into control group （10 cases） and model group （50 cases）， the animal model of temporal lobe epilepsy was established in model group by intra cerebroventricular injection of KA. Then the rats in the model group were divided into 6 hours group， 12 hours group， 1 day group， 3 days group and 1 week group， with 10 cases in each group， according to the different time points after seizures. AK2 mRNA and protein expression in frontal lobe and hippocampus tissue were measured by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting. Results In the model group， expression levels of AK2 in both front al lobe and hippocampus tissue were significant increased compared with the control group （P < 0.05）. And the expression levels were reached the highest 3 days after seizures and then gradually declined 1 week later （P < 0.05）. Conclusion AK2 may participate in the pathophysiological process of EP and provide a new mechanistic basis for the pathogenesis of epilepsy.

[Key words] Kainic acid； Epilepsy； Adenylate kinase 2； Mitochondria； Apoptosis

癲癇是大腦神經(jīng)元過(guò)度超同步化異常放電的慢性腦部疾病。其具有多樣性的發(fā)作形式和復(fù)雜的遺傳機(jī)制，目前對(duì)癲癇的發(fā)作機(jī)制認(rèn)識(shí)還比較局限[1]。有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸激酶2（AK2）存在于細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜間隙中，線粒體在細(xì)胞的調(diào)亡過(guò)程中起著主要調(diào)控作用，表明腦內(nèi)線粒體的功能障礙在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)在立體定向技術(shù)下在大鼠行側(cè)腦室注射紅藻氨酸建立TLE模型，通過(guò)行為學(xué)觀察癲癇發(fā)作后，大鼠額葉及海馬組織中的AK2 mRNA及蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，以探討AK2是否參與癲癇發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD健康大鼠60只，體重200～280 g，購(gòu)自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：0029760。飼養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)如下：24 h晝夜循環(huán)，恒溫23～25℃，恒濕50%～60%，避免噪音及強(qiáng)光照射、每只大鼠分裝于獨(dú)籠，在均可自由進(jìn)食及飲水的條件下飼養(yǎng)。

1.2 分組

按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成正常組（10只）、模型組（50只），按KA首次致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、1周共5個(gè)時(shí)間段將模型組分為5組，每組各10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作TLE模型 3.6%水合氯醛360 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，使用立體定位儀將大鼠固定，備皮，消毒，鋪孔巾，沿頭部正中線切開皮膚，長(zhǎng)度約1 cm，暴露前囟。按前囟后0.8 mm，右側(cè)旁開1.5 mm定位側(cè)腦室，電鉆鉆孔達(dá)硬腦膜表面，將KA（濃度為1 μg/μL）通過(guò)微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針4.5 mm，10 min內(nèi)推注1 μL，緩慢拔除穿刺針。用消毒骨蠟封閉穿刺處后進(jìn)行皮膚縫合，對(duì)每只大鼠均進(jìn)行持續(xù)行為學(xué)觀察。按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（1972年）分為0～V級(jí)，Ⅲ級(jí)以上為成功造模。按上述方法對(duì)正常組大鼠進(jìn)行麻醉后側(cè)腦室注射生理鹽水1 μL。

1.3.2 獲取腦組織 斷頭處死大鼠，于冰臺(tái)上迅速剝?nèi)〕瞿X組織，分離出額葉及海馬組織，迅速置入凍存管中并于液氮中凍存。

1.3.3 半定量RT-PCR法 RNA 抽提：取約100 mg組織放于研磨器內(nèi)，邊研磨邊加入液氮，將組織研磨成粉末狀，加入含有Trizol溶液的EP管中，在超聲破碎儀中給予充分混勻，置于冰上10 min。加入氯仿，用力充分混勻，置于冰上10 min。離心15 min，10 000 r/min。等體積異丙醇與上層水相混勻后置于-20℃冰箱中10 min，待能看見清楚分層后，離心10 min，10 000 r/min。留取白色沉淀，振蕩洗滌RNA，離心5 min，12 000 r/min。棄上清液，4℃冰箱內(nèi)適度干燥RNA。通過(guò)檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm和280 nm的吸光度（OD）值，部分RNA進(jìn)行完整性電泳。

AMV一步法RT-PCR檢測(cè)：以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)AK2引物序列，并已通過(guò)堿基局部對(duì)準(zhǔn)檢索工具檢測(cè)：上游引物5′-GAAGGGGTTAGGGAACAAGC-3，下游引物5′-ATGGCAGCATTTGGTCAGTT-3′。β-actin 上游引物5′-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，下游引物5′-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性90℃ 3 min，變性92℃ 30 s，退火60℃ 45 s，延伸80℃ 1 min，最后一次延伸75℃ 5 min，重復(fù)2～4次，共28個(gè)循環(huán)。

電泳：PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算出待測(cè)基因與β-actin OD比值作為待測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，與正常組進(jìn)行組間比較。

1.3.4 免疫印跡法 總蛋白的提?。喝?00 mg組織在含有液氮的研磨器中進(jìn)行研磨，研碎至粉末狀后轉(zhuǎn)入干燥清潔EP管中，進(jìn)行裂解粉碎后，離心30 min，10 000 r/min，將上清取出分裝于EP管中，凍存條件-80℃。

測(cè)定蛋白含量：按BCA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

凝膠電泳：取總蛋白50 μg進(jìn)行電泳。

轉(zhuǎn)膜：正確切割膠條后于轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行平衡，按從下至上的順序：陽(yáng)極碳板、2層濾紙、PVDF膜、凝膠、2層濾紙、陰極碳板，裝好轉(zhuǎn)膜裝置，并排空每層氣泡后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

免疫反應(yīng)：轉(zhuǎn)膜后于脫色搖床上封閉1 h，加入AK2多克隆抗體（1∶500）進(jìn)行雜交過(guò)夜，待洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交。雜交后用再次洗膜。

顯影及定影：采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。

凝膠圖象分析：用凝膠圖象系統(tǒng)處理，計(jì)算出待測(cè)蛋白與GAPDH蛋白OD比值作為待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，與正常組進(jìn)行組間比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

通過(guò)立體定位儀對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注入KA后，10～30 min絕大部分大鼠癲癇發(fā)作，表現(xiàn)：如面部抽搐、節(jié)律性點(diǎn)頭動(dòng)作、胡須抖動(dòng)、肢體陣攣發(fā)作；1～3 h后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)表現(xiàn)：反復(fù)出現(xiàn)雙側(cè)眼球凝視，伴咀嚼動(dòng)作、口角流涎、面部抽搐及肢體陣攣、身體弓背向上、尾部向上高高翹起、反復(fù)出現(xiàn)站立跌倒等；6～8 h后癲癇發(fā)作頻次較前逐漸減少，持續(xù)時(shí)間較前縮短，1 d～1周后可出現(xiàn)間斷性癲癇發(fā)作。所有大鼠造模后分級(jí)（按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）：0級(jí)0只，Ⅰ級(jí)0只，Ⅱ級(jí)0只，Ⅲ級(jí)20只，Ⅳ級(jí)19只，Ⅴ級(jí)11只，均造模成功，且符合TLE模型標(biāo)準(zhǔn)。但術(shù)后出現(xiàn)5只大鼠全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作，最終無(wú)法耐受最終死亡，其中包括Ⅴ級(jí)3只，Ⅳ級(jí)2只，再次按同樣方法造模成功5只大鼠，符合造模入選標(biāo)準(zhǔn)，且無(wú)死亡。生理鹽水組無(wú)上述異常，無(wú)死亡。

2.2 模型組大鼠額葉及海馬AK2 mRNA的表達(dá)

模型組大鼠額葉及海馬組織中AK2 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)：從致癇后6 h開始逐步增高，3 d后可達(dá)高峰，1周后逐漸降低。模型組與正常組相比，額葉及海馬組織中AK2 mRNA在不同時(shí)間段的表達(dá)均顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。各組大鼠額葉及海馬AK2 mRNA結(jié)果見圖1。

2.3 模型組大鼠額葉及海馬AK2蛋白的表達(dá)

模型組大鼠額葉及海馬組織中AK2蛋白的表達(dá)趨勢(shì)：從致癇后6 h開始逐步增高，3 d后可達(dá)高峰，1周后逐漸降低。模型組與正常組相比，額葉及海馬組織中AK2 mRNA在不同時(shí)間段的表達(dá)均顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。各組大鼠額葉及海馬AK2蛋白表達(dá)結(jié)果見圖2。

3 討論

癲癇的腦神經(jīng)元高度同步化異常放電引起不同程度的神經(jīng)功能障礙，具有刻板性、重復(fù)性、發(fā)作性[4]。額葉作為大腦發(fā)育中最高級(jí)的部分，包括初級(jí)運(yùn)動(dòng)區(qū)、前運(yùn)動(dòng)區(qū)和前額葉，主要功能與精神、語(yǔ)言和隨意運(yùn)動(dòng)有關(guān)。海馬主要與記憶以及空間定位有關(guān)[5]。既往實(shí)驗(yàn)研究中顯示癲癇發(fā)作中凋亡相關(guān)基因大量表達(dá)，如P53等，引起神經(jīng)元大量壞死、凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元間重組細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系[6-7]。目前提出凋亡途徑主要為：外源性途徑/死亡受體途徑和內(nèi)源性途徑/線粒體途徑。線粒體作為分子靶點(diǎn)或整合元件參與細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，是啟動(dòng)細(xì)胞調(diào)亡的關(guān)鍵之一[8-9]。

AK是廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的單體酶，在維持細(xì)胞能量平衡起著主要作用，共有5種同工酶，AK2是一種線粒體蛋白，廣泛表達(dá)于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜間隙，并且參與細(xì)胞內(nèi)AMP轉(zhuǎn)化為ADP的過(guò)程，影響ADP、ATP、dATP的生成水平，與核苷酸還原酶相關(guān)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中釋放到胞漿外[10-11]。在腦內(nèi)ATP和GTP是腦細(xì)胞能量的主要來(lái)源，AK2作為一種嘌呤類神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)存在，也作為營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、增殖、凋亡及重塑[12-13]。細(xì)胞凋亡是多種細(xì)胞共同調(diào)控的為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞死亡過(guò)程，癲癇發(fā)作后腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞可發(fā)生明顯的壞死和凋亡，細(xì)胞調(diào)亡需要耗能，若線粒體輕度受損，所產(chǎn)生的ATP足夠維持凋亡所需的能量，神經(jīng)元最終損傷后調(diào)亡；若線粒體受損嚴(yán)重，在缺乏ATP的情況下，神經(jīng)元?jiǎng)t無(wú)法啟動(dòng)凋亡程序，最終發(fā)生壞死[14-15]。因此，癲癇發(fā)病機(jī)制中，因損傷的程度和細(xì)胞的能量狀態(tài)不同，凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特征可同時(shí)存在。近年來(lái)有研究表明AK2的酶活變化在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用，可能參與癲癇的發(fā)病機(jī)制[16]。

AK2作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，主要參與誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡，導(dǎo)致腦內(nèi)異常放電，引起癲癇發(fā)作；還是在癲癇發(fā)作過(guò)程中，僅因線粒體功能障礙而引起其表達(dá)增高；以上問(wèn)題仍需更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步研究證實(shí)。目前尚無(wú)AK2在致癇大鼠腦組織中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AK2從致癇后在額葉及海馬組織中表達(dá)即開始出現(xiàn)增高，3 d后達(dá)高峰，持續(xù)1周后開始緩慢下降，推測(cè)線粒體功能受損后AK2大量表達(dá)，介導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡過(guò)程，引起癲癇發(fā)作；癲癇的發(fā)作后出現(xiàn)線粒體功能障礙和超微結(jié)構(gòu)改變，增加AK2在細(xì)胞胞漿中的表達(dá)，兩者相輔相承。腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞中的線粒體主要作用于ATP的合成，部分線粒體呼吸酶抑制也可引起癲癇的發(fā)作，其功能受到損傷后大量釋放AK2，AK2可作為RNA結(jié)合的非酶活性蛋白，在胞漿中與相應(yīng)RNA結(jié)合后調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄過(guò)程，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17-18]。細(xì)胞內(nèi)保持充足的ATP方能維持神經(jīng)細(xì)胞的膜電位的穩(wěn)定，AK2還可以通過(guò)引起ATP水平的下降及神經(jīng)元Ca2+的動(dòng)態(tài)失衡，影響神經(jīng)元的興奮性和突觸傳遞，誘發(fā)癲癇發(fā)作[19-20]。這將為抑制癲癇發(fā)作的新治療途徑提供理論依據(jù)。

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