谷 軍, 張曉彥*, 孟利強(qiáng),3， 沙長(zhǎng)青

(1.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所,黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150001；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150090)

等離子體法誘變淡紫擬青霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌種的篩選

谷 軍1, 張曉彥1*, 孟利強(qiáng)1,3， 沙長(zhǎng)青2

(1.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所,黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150001；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150090)

采用菌株誘變技術(shù)，提高生防用淡紫擬青霉菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力。通過常溫常壓等離子體誘變技術(shù)(MPMS)對(duì)淡紫擬青霉進(jìn)行誘變育種處理，對(duì)處理的菌種先采用透明圈法進(jìn)行初篩，然后采用發(fā)酵方法進(jìn)行復(fù)篩。采用MPMS法誘變淡紫擬青霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌種時(shí)，溫度25 ℃，處理時(shí)間30 s，樣品處理量60 μL，誘變菌的致死率為30.33%時(shí)，正突變率為14%。采用搖瓶分批發(fā)酵培養(yǎng)，誘變菌種的幾丁質(zhì)酶活為0.17 U/mL。結(jié)果表明，經(jīng)過對(duì)淡紫擬青霉的誘變處理，獲得高活性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株，幾丁質(zhì)酶酶活提高180%。

淡紫擬青霉；誘變育種；等離子體法誘變育種技術(shù)

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是農(nóng)作物的一種主要害蟲,它分布廣,對(duì)許多經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害[1]，由于化學(xué)殺蟲劑造成農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染 ,根結(jié)線蟲病害的生物防治受到越來越廣泛的重視。淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)是線蟲卵的寄生真菌,被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的線蟲生防真菌[2-4]，而淡紫擬青霉防治根結(jié)線蟲，起主要作用的是該菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶[5-6]。因此，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生量及其活性對(duì)能否很好地防治線蟲有重要作用，篩選出產(chǎn)酶活性高的淡紫擬青霉菌種，對(duì)更好地發(fā)揮其生物防治作用具有重要意義。多功能等離子體誘變系統(tǒng)(MPMS)以等離子體為主要誘變劑，在高壓交變電場(chǎng)作用下，空氣介質(zhì)形成等離子體[7-9]，等離子體中含有氮正離子(N+)、原子態(tài)氧(O)、OH自由基等活性成分，可使微生物的細(xì)胞膜受損，增加其通透性[10-11]。此類活性粒子進(jìn)入細(xì)胞后，使DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子受損，同時(shí)激發(fā)細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制，在此過程中，微生物將產(chǎn)生大量突變體[12]。本研究采用MPMS法對(duì)淡紫擬青霉進(jìn)行誘變處理，提高其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力，為淡紫擬青霉在農(nóng)業(yè)生物防治上的應(yīng)用做準(zhǔn)備。高通量篩選是獲得高產(chǎn)突變株的關(guān)鍵步驟，通常的化學(xué)分析方法比較精確，但該法較為繁瑣，不方便實(shí)現(xiàn)菌株的快速篩選。在篩選平板中加入膠體幾丁質(zhì)，通過產(chǎn)生透明圈的大小判斷菌株產(chǎn)酶情況，可以縮減工作量，因此探尋新的高通量篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的方法至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)，本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏。

1.1.2 試劑 磷酸二氫鉀、3,5-二硝基水楊酸、硫酸銨、硫酸鎂、鹽酸等試劑均為分析純(AR)，葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、酵母膏、蛋白胨、幾丁質(zhì)為生化試劑(BR)。

1.1.3 儀器 MPMS多功能等離子體誘變系統(tǒng)(北京艾德豪克國(guó)際技術(shù)有限公司)；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；SKY-1102C恒溫震蕩培養(yǎng)箱 (金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)；SP-756PC可見紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；YSQ-LS-100S11型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；DRP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%) ①斜面試管培養(yǎng)基:可溶性淀粉2，K2HPO40.1，KNO30.1，MgSO40.05，NaCl 0.05，F(xiàn)eSO40.001，瓊脂2，pH自然；②種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2，K2HPO40.1，KNO30.1，NaCl 0.05，MgSO40.05,FeSO40.001，pH自然；③發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉2，100目幾丁質(zhì)粉0.1，K2HPO40.1，KNO30.1， MgSO40.05，NaCl 0.05，F(xiàn)eSO40.001，pH自然；④篩選培養(yǎng)基:可溶性淀粉2，2%的膠體幾丁質(zhì)10，K2HPO40.1，KNO30.1， MgSO40.05，NaCl 0.05，F(xiàn)eSO40.001，瓊脂2，pH自然。上述培養(yǎng)基滅菌采用濕熱滅菌，條件為121 ℃，30 min 。

1.2 方法

1.2.1 膠態(tài)幾丁質(zhì)的制備 取5 g幾丁質(zhì)加入50 mL濃鹽酸中,充分?jǐn)嚢韬蠓湃? ℃冰箱靜置冷藏24 h,加入50%乙醇200 mL,沉淀出膠態(tài)幾丁質(zhì)。將沉淀物反復(fù)水洗至中性(pH 7.0±0.2),用蒸餾水定容至250 mL,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的膠態(tài)幾丁質(zhì)。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶活性分析 ①透明圈法:將篩選菌株涂布到篩選培養(yǎng)基的篩選平皿中，28 ℃ 靜止培養(yǎng)4 d后，分別測(cè)定平皿中菌落周圍顯現(xiàn)透明圈的直徑R2和淡紫擬青霉的菌落直徑R1，計(jì)算R2/R1比值來比較菌株幾丁質(zhì)酶的相對(duì)活性[13]。②DNS比色法[14-15]:采用測(cè)定還原糖的方法測(cè)定幾丁質(zhì)酶的酶活。首先做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置不同梯度濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入DNS(3，5- 二硝基水楊酸)后，100 ℃水浴10 min，在 540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將測(cè)定的發(fā)酵液樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，計(jì)算出幾丁質(zhì)酶活。方法：取樣品發(fā)酵液，紗布過濾，上清液作為待測(cè)發(fā)酵酶液；在3根試管中分別加入1 mL待測(cè)幾丁質(zhì)酶的發(fā)酵液和1 mL的1%膠態(tài)幾丁質(zhì)，其中1根試管加入1 mL DNS，置于100 ℃恒溫水浴鍋中保持10 min，作對(duì)照，另外2根試管于40 ℃水浴鍋中保持60 min的酶解反應(yīng)后，各加入1 mL DNS，放入100 ℃水浴鍋中進(jìn)行滅活10 min；在3根試管中各加入10.0 mL蒸餾水，離心后取上清液利用分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值，將測(cè)定結(jié)果與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，并測(cè)算出還原糖含量，進(jìn)而計(jì)算出幾丁質(zhì)酶活力。酶活力單位(U/mL)定義為40 ℃條件下，幾丁質(zhì)酶每1 min分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μmoL還原糖所需要的酶活為1個(gè)活力單位。

1.2.3 淡紫擬青霉孢子菌懸液的制備 將經(jīng)過活化的淡紫擬青霉菌種涂布到斜面試管培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃，在生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)5 d，待菌體表面全部由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榈仙螅脽o菌水洗出孢子，充分混拌均勻，適當(dāng)稀釋使孢子懸液中的孢子數(shù)達(dá)到2×105cfu/mL左右，備用。

1.2.4 誘變方法 首先打開MPMS后進(jìn)行消毒(紫外線)30 min，連接氮?dú)夤?，打開閥門，進(jìn)氣壓力調(diào)至0.3 MPa，恒定后，開始進(jìn)行誘變處理操作。在不銹鋼誘變杯(內(nèi)徑16.2 mm，高度7.9 mm)中裝入不同體積淡紫擬青霉孢子菌懸液(超凈工作臺(tái)中進(jìn)行)，裝入到MPMS系統(tǒng)中后，設(shè)置誘變參數(shù)(處理時(shí)間、平臺(tái)高度、樣品裝量)啟動(dòng)系統(tǒng)開始工作。完成后取出誘變杯，吸出樣品，并將洗出液合并，定容。然后涂平板進(jìn)行菌株的篩選測(cè)定工作。

1.2.5 致死率曲線的測(cè)定 將經(jīng)過誘變處理和未經(jīng)誘變處理的菌液用無菌水稀釋到適當(dāng)濃度，涂布到平板固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫靜置培養(yǎng)70 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以未經(jīng)等離子誘變處理的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算出不同誘變處理?xiàng)l件后菌株的致死率，以誘變處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌種的致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線。

致死率(%)=

1.2.6 正負(fù)突變率 幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量低于對(duì)照10%視為負(fù)突變株，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量高于對(duì)照10%的視為正突變株。

1.2.7 誘變菌株的篩選 ①平板透明圈法初篩：取經(jīng)過誘變處理的樣品，涂布到幾丁質(zhì)酶初篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取R2/R1比值大的菌株到斜面試管中作為初篩得到的菌，詳見1.2.2；②搖瓶發(fā)酵法進(jìn)行菌種復(fù)篩：將初篩獲得的效果較好的菌株作為發(fā)酵菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并將原菌株作為對(duì)照菌株進(jìn)行對(duì)比發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵條件為溫度28 ℃，500 mL三角瓶裝量100 mL發(fā)酵液，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，時(shí)間72 h。測(cè)定發(fā)酵液的幾丁質(zhì)酶活。

1.2.8 遺傳穩(wěn)定性考察 選取經(jīng)過復(fù)篩得到的誘變菌株，在固體斜面試管中連續(xù)傳代培養(yǎng)8次，比較不同傳代次數(shù)菌株幾丁質(zhì)酶活的產(chǎn)率情況，確定誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MPMS不同處理對(duì)淡紫擬青霉菌株致死率的影響

2.1.1 不同處理時(shí)間對(duì)致死率的影響 將制備好的孢子懸液進(jìn)行誘變處理，誘變處理時(shí)間分別為0、30、60、90、120 s。0 s為對(duì)照，處理完成后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算致死率，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，誘變處理時(shí)間對(duì)菌株致死率影響較大，隨誘變處理時(shí)間加長(zhǎng)，菌株的死亡率提高，在處理30 ～60 s階段，致死率的提升速度最大，當(dāng)誘變處理30 s時(shí)，淡紫擬青霉孢子旳死亡率為30.33%，處理60 s時(shí)死亡率79.67%，90 s以后幾乎全部死亡。

圖1 MPMS不同處理時(shí)間對(duì)淡紫擬青霉菌株致死率Fig.1 Fatality rate of MPMS different processing time of Paecilomyces lilacinus

2.1.2 不同樣品裝量對(duì)致死率的影響 每個(gè)誘變杯中的樣品裝量分別為40、60、80 μL，誘變處理時(shí)間分別為30、50、70 s。處理完成后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并計(jì)算致死率，結(jié)果如圖2所示。不同樣品裝量決定處理樣品的厚度，裝量越多，樣品在誘變杯中的厚度越大，結(jié)果顯示隨處理樣品裝量的增加，樣品的厚度也在提高，處理樣品的死亡率逐漸降低。裝量80 μL，時(shí)間30 s，死亡率為18.3%；而裝量40 μL，時(shí)間30 s，死亡率為58.7%，相差3倍。因此，裝量是影響誘變死亡率的一個(gè)重要因素。

2.2 MPMS不同處理時(shí)間對(duì)淡紫擬青霉菌株正負(fù)突變的影響

2.2.1 不同處理時(shí)間的菌株突變情況 樣品裝量為60 μL，誘變處理時(shí)間分別為30、40、50、60 s。培養(yǎng)后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并計(jì)算突變率，結(jié)果見表1。不同誘變處理時(shí)間與正突變率大小之間沒有明顯的相關(guān)性，正突變率在8.67%～21.35%間變動(dòng)，40 s時(shí)正突變率最高，60 s正突變率最小。處理時(shí)間與負(fù)突變率的大小之間沒有明顯的相關(guān)性，但負(fù)突變概率是正突變概率的1.5～4.0倍。說明誘變處理對(duì)微生物細(xì)胞的損傷是隨機(jī)的。

圖2 不同樣品裝量對(duì)致死率的影響Fig.2 Fatality rate ofdifferent samples charge processing

處理時(shí)間/s正突變率/%負(fù)突變率/%3016.2525.684021.3531.255015.3330.12608.6736.67

2.2.2 不同處理樣品量的突變情況 樣品裝量分別為40、60、80、100 μL，誘變處理時(shí)間為30 s。培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。不同處理樣品的裝量與正突變之間的相關(guān)性不明顯，正突變率在4.59%～12.33%，隨樣品量的提高，正突變率有降低的趨勢(shì)，但相關(guān)性不明顯。樣品的裝量與負(fù)突變率之間的相關(guān)性也不十分明顯，負(fù)突變率在12.10%～29.12%之間變動(dòng)，大約高于正突變率2～3倍。

表2 不同誘變處理的樣品量對(duì)突變的影響

2.3 高活性淡紫擬青霉菌株的篩選

按照初篩的方法進(jìn)行誘變菌株的初篩，將其中較好的前14株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。以R2/R1為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖，進(jìn)行二組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析。由圖3可知，隨著R2/R1比值的提高OD也提高，規(guī)律性非常明顯，而且R2為0.928 6，非常接近1，表明R2/R1和OD二者之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性，說明R2/R1的比值代替測(cè)定OD值的方法進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性初步測(cè)定的方法是可行的。

表3 初篩菌株的產(chǎn)酶情況

圖3 幾丁質(zhì)酶活與透明圈直徑比的相關(guān)性Fig.3 Correlation of chitinase live and diameter ratio of transparent circle

2.4 遺傳穩(wěn)定性考察

篩選的菌株經(jīng)過8次試管培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，分別測(cè)定產(chǎn)酶情況。由表4可知，經(jīng)過8次傳代，DZ3的OD值從0.50降到0.46,降低8%；DZ7的OD值從0.52降到0.50,降低4%；DZ9的OD值從0.50降到0.35,降低30%。DZ7誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，沒有明顯下降。DZ9的遺傳穩(wěn)定性不好，下降明顯。

表4 淡紫擬青霉傳代次數(shù)對(duì)酶活產(chǎn)率的影響

2.5 高產(chǎn)突變菌株搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)情況

將經(jīng)過誘變處理得到的菌株DZ3、DZ7、DZ9進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)酶情況見圖4。從圖4中看出，在淡紫擬青霉發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，前期進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)，36 h開始產(chǎn)酶，55～70 h間產(chǎn)酶速度最快，70～78 h酶活性達(dá)到最高點(diǎn)，隨后酶活性開始下降。DZ7的最高活性為0.17 U/mL,DZ9的最高活性為0.16 U/mL，DZ3的最高活性為0.145 U/mL,而未經(jīng)誘變處理的原菌株最高活性為0.095 U/mL，與出發(fā)菌株相比，DZ7誘變處理使菌株產(chǎn)酶能力提高1.8倍。

圖4 淡紫擬青霉菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶情況Fig.4 Production situation of Paecilomyces lilacinus strain fermentation chitinase

3 討 論

本研究利用等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)淡紫擬青霉菌株進(jìn)行處理時(shí)采用透明圈法進(jìn)行菌株的初篩，雖然培養(yǎng)基中透明圈的大小與培養(yǎng)基的成分、濃度、培養(yǎng)基的厚度、培養(yǎng)時(shí)間等許多因素有關(guān)，但在相同條件下樣品之間仍具可比性，采用透明圈法篩選菌種同搖床發(fā)酵測(cè)定酶活性的結(jié)果看，呈明顯的正相關(guān)性，二者之間相關(guān)性系數(shù)接近1，因而采用透明圈法篩選淡紫擬青霉菌種切實(shí)可行，并且極大地提高了工作效率，方便、簡(jiǎn)潔。在誘變過程中，不同的誘變處理時(shí)間對(duì)淡紫擬青霉菌種死亡率的影響明顯不同，而處理30～60 s死亡率提升很快，表明淡紫擬青霉對(duì)MPMS在此階段處理時(shí)間非常敏感，對(duì)微生物細(xì)胞的損傷最大。樣品的裝量即樣品的厚度對(duì)誘變處理的結(jié)果有一定的影響，厚度越大，死亡率越低，等離子誘變系統(tǒng)中培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)等電離子的穿透還是有一定限制的。本研究采用不同的誘變處理時(shí)間、樣品的裝量等條件對(duì)微生物菌種進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，誘變菌株的正負(fù)突變率與誘變處理?xiàng)l件之間，沒有明顯的相關(guān)性，表明MPMS誘變處理微生物時(shí)，對(duì)細(xì)胞造成的損傷是隨機(jī)的，沒有一定的針對(duì)性，但負(fù)突變率明顯高于正突變率約1.5～4.0倍。在遺傳穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性不盡相同，需要進(jìn)一步選育加以確定，部分菌株的穩(wěn)定性較好。

采用MPMS多功能等離子體誘變系統(tǒng)對(duì)淡紫擬青霉進(jìn)行微生物菌種的誘變過程中，效果明顯，經(jīng)過篩選的誘變菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的活性同原菌株相比提高1.8倍。通過以上研究可看出，多功能等離子體誘變系統(tǒng)處理微生物時(shí)突變率與樣品的厚度和處理時(shí)間關(guān)系密切，并且對(duì)微生物造成的損傷是隨機(jī)的，由于修復(fù)機(jī)制的影響，負(fù)突變率要大于正突變率。

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Screening of Chitinase Producing Strains from Plasma Mutagenesis ofPaecilomyceslilacinus

GU Jun1, ZHANG Xiao-yan1, MENG Li-qiang1, 3, SHA Chang-qing2

(1.Inst.ofMicrobiol.,Harbin150010; 2.HeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150001; 3.HarbinInst.ofTechnol.,Harbin150090)

The production capability of chitinase byPaecilomyceslilacinusfor bio-control was improved adopting strain mutation technology. TheP.lilacinuswas treated by mutation breeding by plasma technology at normal temperature and normal pressure (MPMS), the treated strain were initially screened adopting the method of transparent circle, then rescreened using fermentation method. The results showed that adopting MPMS method to mutateP.lilacinusto produce chitinase under 25 ℃, treated for 30 s. The treated sample volume at 60 μL, and 30.33% of lethality of mutation strain, the positive mutation ratio was at 14%. The chitinase activity of mutant strain was 0.17 U/mL after batch fermentation in shaking flask. It was concluded that after the mutagenic treatment ofP.lilacinus, a high-activity chitinase producing strain were obtained, with chitinase activity increased by 180%.

Paecilomyceslilacinus; mutation breeding; plasma mutation breeding technology

黑龍江省科學(xué)院科研基金項(xiàng)目(CZ14BGJV06)

谷軍 男,研究員級(jí)高級(jí)工程師。研究領(lǐng)域?yàn)榘l(fā)酵工程技術(shù)。Tel：0451-84128758，E-mail:gujun64@163.com

* 通訊作者。女,高級(jí)工程師。研究領(lǐng)域?yàn)榘l(fā)酵工程技術(shù)。E-mail:zhangxiaoyan@163.com

2016-07-19；

2016-10-16

Q815

A

1005-7021(2017)03-028-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.005