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幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

2013-01-22 01:34:29張利平
浙江柑橘 2013年2期
關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)分子量昆蟲

張利平

(浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026)

幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

張利平

(浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026)

幾丁質(zhì)酶是一種具有生物催化活性的水解酶,它具有水解幾丁質(zhì)的特異功能,可以將幾丁質(zhì)水解成幾丁糖或者N-乙酰葡萄糖胺。幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上主要是防治害蟲,幾丁質(zhì)酶可以直接作為殺蟲劑或者和其他微生物協(xié)同防治害蟲,幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物中,可以增強植物的抗病性。

1 幾丁質(zhì)

幾丁質(zhì)又稱甲殼素或甲殼質(zhì),學(xué)名為( 1-4)- 2-乙酰胺基- 2-脫氧- β-D葡聚糖,它是由葡萄糖結(jié)構(gòu)單元組成的直鏈多糖,也是唯一含氨基的均態(tài)多糖,結(jié)構(gòu)與纖維素非常相似。幾丁質(zhì)是廣泛分布于自然界的生物多聚物,自然界每年生成的幾丁質(zhì)約有一百億噸,在天然聚合物中幾丁質(zhì)的貯量占第二位,僅次于纖維素。幾丁質(zhì)是構(gòu)成大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分,同時也大量存在于昆蟲和動物的甲殼中[1]。

2 幾丁質(zhì)酶

幾丁質(zhì)酶是一種具有生物催化活性的水解酶,它能特異性地水解幾丁質(zhì)。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可以從內(nèi)部隨機打斷幾丁質(zhì),產(chǎn)生可溶的、小分子量的幾丁四糖、幾丁三糖和幾丁二糖產(chǎn)物。外切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)的非還原末端降解幾丁質(zhì),產(chǎn)物為N-乙酰葡萄糖胺。根據(jù)其來源不同可以將其分為幾類,即微生物幾丁質(zhì)酶,植物幾丁質(zhì)酶,昆蟲幾丁質(zhì)酶等。

2.1 幾丁質(zhì)酶特性

微生物幾丁質(zhì)酶的分子大小差異很大,一般為10~100 kD,但因其來源不同,差異也很大。目前研究的相對分子質(zhì)量最大的是Microbulbifer degradans 2~40株的幾丁質(zhì)酶,達到了140kD。粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)產(chǎn)生五種幾丁質(zhì)酶,其分子量分別為21、36、48、52和57kD,而從擬橄欖綠鏈霉菌(S.olivaceoviridis)的培養(yǎng)液中純化得到的五種幾丁質(zhì)酶其分子量分別為20.5、30、47、70和92kD,皺褶鏈霉菌(S.plicatus)產(chǎn)生的二種幾丁質(zhì)酶分子量分別為49、63kD,紅色鏈霉菌(S.erythraeus)則僅產(chǎn)生一種,分子量為30kD。微生物幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值的變動范圍很大,一般認為是 3~11,但絕大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶最適pH值為4.0~ 6.0的偏酸性環(huán)境。酶在pH值為3~11時通常都十分穩(wěn)定,酶的等電點pI為3.6~ 8.6。微生物幾丁質(zhì)酶往往對熱都比較穩(wěn)定,在 4~60℃時都具有酶活性,而像激烈熱球菌的幾丁質(zhì)酶在98~100℃時仍然能正常進行水解反應(yīng),但大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為40~50℃,在-20℃保存 9年仍有酶活性。微生物幾丁質(zhì)酶的這種熱穩(wěn)定性特點,使其在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)方面具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。

植物幾丁質(zhì)酶大部分是小分子蛋白,分子量介于12~55kD之間。在以幾丁質(zhì)為底物時,最適pH一般低于7,其等電點pI介于3~10之間,對熱穩(wěn)定(有的酶在60℃仍很穩(wěn)定),抗蛋白酶。植物幾丁質(zhì)酶的等電點有的偏酸,有的偏堿,常稱為酸性或堿性幾丁質(zhì)酶。植物體內(nèi)通常含有一種或幾種幾丁質(zhì)酶,有些植物既含酸性幾丁質(zhì)酶,又含堿性幾丁質(zhì)酶[3]。

昆蟲幾丁質(zhì)酶的分子量在45~85kD之間,酶的活性范圍在pH 4.0~ 8.0之間,等電點在 5.0~ 7.0之間,大多屬于18家族幾丁質(zhì)酶。昆蟲幾丁質(zhì)酶屬于內(nèi)切酶,可將幾丁質(zhì)水解為低分子量的乙酰氨基葡萄糖的寡聚物,如幾丁四糖、幾丁三糖、幾丁二糖[4]。

2.2 結(jié)構(gòu)特征

典型的幾丁質(zhì)酶由N端信號區(qū)、催化區(qū)和C端延伸區(qū)組成,有的還有幾丁質(zhì)結(jié)合域。各功能域具有各自的功能。

研究表明,多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶的基因以單拷貝形式存在,包括啟動子、SD序列、結(jié)構(gòu)基因和終止子,這與原核生物的基因結(jié)構(gòu)相似。在相應(yīng)的酶蛋白結(jié)構(gòu)上有對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域,從 N端到 C端依次為信號肽、幾丁質(zhì)催化區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)以及一個短的 C端區(qū)。

近些年來,對多種植物的幾丁質(zhì)酶基因進行了克隆。核苷酸和氨基酸的序列分析表明,植物幾丁質(zhì)酶前體一般都含有一個 N端信號區(qū)、一個主結(jié)構(gòu)區(qū)(催化區(qū))和C端延伸區(qū),有的在 N端信號區(qū)之后有富含半胱氨酸的CBD,它與主結(jié)構(gòu)區(qū)之間有一段可變交聯(lián)區(qū)。

無脊椎動物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特征一般包括了催化域、富含Cys的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)區(qū)、富含Ser/Thr區(qū)(該區(qū)一般糖基化)。昆蟲幾丁質(zhì)酶通常在 N端有一個催化區(qū),在 C端有一個幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)。但也有例外,如Penaeus japonica的 幾丁質(zhì)酶在 N端有一個CBD,Caenorhaditis elegans幾丁質(zhì)酶在 C端有兩個CBD等[5]。

3 幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在防治害蟲上。幾丁質(zhì)酶可以直接防治害蟲或者與其他微生物協(xié)同防治,幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入到植物中,增加植物對害蟲的抗病性,達到防治的作用。

3.1 幾丁質(zhì)酶防治害蟲

幾丁質(zhì)酶可以作為殺蟲劑直接防治害蟲。幾丁質(zhì)是昆蟲外表皮(外骨骼)、呼吸道、腸腔(包括圍食膜)和生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成,并且是外骨骼和圍食膜的主要組成成分,通常占昆蟲體壁干重的25%~40%,而昆蟲變態(tài)發(fā)育的每一次蛻皮都要完成幾丁質(zhì)的更新,也就是消化舊皮層幾丁質(zhì)的同時合成新皮層的幾丁質(zhì),這一過程主要依賴于自身分泌的幾丁質(zhì)酶起作用。另外,昆蟲的圍食膜和外骨架是昆蟲抵御病原體重要生理屏障,而昆蟲病原真菌可利用自身的幾丁質(zhì)水解酶和蛋白水解酶突破這種屏障,幾丁質(zhì)是昆蟲殺蟲劑作用的一個極具吸引力的潛在靶目標(biāo),通過將幾丁質(zhì)酶導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)來破壞其正常的組織結(jié)構(gòu),達到抑殺害蟲的目的。

3.2 轉(zhuǎn)基因植株表達幾丁質(zhì)酶

植物受病原菌侵染后會產(chǎn)生一系列的主動防御反應(yīng),這些反應(yīng)包括:植保素的合成;植物細胞壁結(jié)構(gòu)的增強;蛋白酶抑制劑及一些水解蛋白的誘導(dǎo)和積累。水解蛋白中研究較多的是幾丁質(zhì)酶。很多植物病原真菌細胞壁的主要成分是幾丁質(zhì),體外抑菌試驗表明,幾丁質(zhì)酶能抑制一些病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長。因此,幾丁質(zhì)酶一直被看作是植物抗真菌病害的潛在物質(zhì)?,F(xiàn)在已經(jīng)克隆到了許多幾丁質(zhì)酶基因,這些幾丁質(zhì)酶基因被轉(zhuǎn)到植物中增強植物對病蟲害的抵抗力。

20世紀(jì)80年代以來,科學(xué)家已分別將細菌及植物幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)移到煙草、番茄、大豆、馬鈴薯、葛首、葡萄及甜菜等植物中,獲得了表達幾丁質(zhì)酶活性的轉(zhuǎn)基因植物。與普通植物相比,轉(zhuǎn)基因植物不僅抗真菌,而且對線蟲和昆蟲也有一定的抗性。

1996年,Grison等將組成型表達的幾丁質(zhì)酶基因?qū)敫侍m型油菜中,利用三種病原菌Cylin drosporium concentricum(柱胞霉菌)、Phomalingam(莖點霉菌)、Sclerotinia sclerotiorum( 菌核菌)做接種實驗,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株對病害的田間耐性比對照明顯增強。Lorito等將從Trichoderma harzianum而來的編碼一個強的抗真菌的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶導(dǎo)入煙草和土豆中,獲得了對Alterbaria alternata、A.solani有很高抵抗力的植株。

通過向植物中導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因,使其在植物體中過量表達,提高植物體對真菌病害的抗性,幾丁質(zhì)酶基因工程為防治植物真菌病害開辟了一條新途徑,而且在生產(chǎn)試驗中顯示出其優(yōu)越性。隨著對幾丁質(zhì)酶的催化機制、抗病機理,以及幾丁質(zhì)酶基因的克隆測序等研究的不斷深入,形成了它的新的應(yīng)用策略。但在實際應(yīng)用中,還存在一些問題,應(yīng)用于病害防治還需要一些時間。

3.3 幾丁質(zhì)酶和微生物的協(xié)同作用

幾丁質(zhì)酶與微生物殺蟲劑之間有增效作用。以幾丁質(zhì)酶作為輔劑與Bt劑一起施用可以提高Bt菌的殺蟲效果。Brandt等(1978)發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶可在昆蟲圍食膜上造成穿孔而有利于病原微生物進入昆蟲組織。Smirnoff等研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶與蘇云芽孢桿菌一起防治云杉色卷娥能增強Bt的殺蟲效果。Arora等(2003)報道,幾丁質(zhì)酶Chi36的加入使得Bt對斜紋夜蛾幼蟲的半致死濃度降低了30%。劉艷荷(2008)、王芳(2004)等的研究證實桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因的表達產(chǎn)物對昆蟲病毒早期侵染和蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)都有明顯的增效作用,Shapiro等人發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶能顯著增強LDNPV對舞毒娥的致死作用。Dubois等人研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶在體外亦能從3~ 4齡舞毒娥幼蟲中觀察到圍食膜穿孔。用包裹幾丁質(zhì)酶制劑的飼料喂健康的舞毒娥幼蟲,也同樣發(fā)現(xiàn)其圍食膜穿孔[3]。

[ 1]黃崇元.甲殼素資源的綜合利用與發(fā)展[J].濕法冶金,1995,( 9):4~15.

[ 2]王治偉,劉志敏.微生物幾丁質(zhì)酶研究進展.生物技術(shù)通訊[J].2006,( 3):439~442

[ 3]歐陽石文,趙開軍,馮蘭香.植物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能、分類及進化[J].植物學(xué)通報,2001, 18( 4):418~426

[ 4]李瑤,范曉軍.昆蟲幾丁質(zhì)酶及其在害蟲防治中的應(yīng)用[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報,2011,48( 5): 1489~1494

[ 5]吳志剛,朱旭芬.幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)特性及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2002, 14( 2):117~121

2012-12-03

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