段希宇， 葉 陵， 劉成國(guó)， 王蓉蓉， 周 輝

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

乳酸菌的抗氧化作用機(jī)制

段希宇， 葉 陵， 劉成國(guó)， 王蓉蓉， 周 輝*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

乳酸菌可以作為發(fā)酵劑、保鮮劑用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)和保藏。由于無(wú)法進(jìn)行呼吸產(chǎn)能，乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)面臨氧化脅迫。研究表明，乳酸菌具有一定的抗氧化能力，能清除體內(nèi)的活性氧分子,并使其保持相對(duì)穩(wěn)定。綜述了乳酸菌的抗氧化作用機(jī)制，主要從抗氧化酶、維持細(xì)胞還原狀態(tài)、金屬離子螯合等方面進(jìn)行了介紹，以期為深入了解乳酸菌的抗氧化機(jī)制以及改善乳酸菌的環(huán)境生存能力提供一定的理論參考。

乳酸菌；抗氧化作用；抗氧化酶

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是指一類不產(chǎn)生芽胞、不能進(jìn)行呼吸作用、能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌[1]。乳酸菌無(wú)處不在，廣泛分布于人體、動(dòng)物、植物和整個(gè)自然界。乳酸菌用途廣泛，可以作為發(fā)酵劑、保鮮劑用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)和保藏，也能作為保健食品和藥品，改善和提高人體的健康水平，還可作為微生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的模式生物。作為一類不能利用氧氣進(jìn)行呼吸產(chǎn)能的細(xì)菌，乳酸菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，不得不面對(duì)來(lái)自氧的脅迫。環(huán)境中的氧進(jìn)入細(xì)胞后，接收菌體提供的電子而依次被還原為超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等有毒的代謝產(chǎn)物，習(xí)慣上將超氧陰離子、過(guò)氧化氫及羥自由基合稱為活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，ROS具有較強(qiáng)的氧化活性，可以氧化蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜、DNA等生物大分子，造成蛋白的變性、酶蛋白的失活及細(xì)胞膜的通透性改變，從而抑制菌體的生長(zhǎng)代謝。本文對(duì)乳酸菌的抗氧化機(jī)制進(jìn)行綜述，從抗氧化酶、胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、金屬離子螯合等抗氧化作用機(jī)制進(jìn)行介紹。

1 抗氧化酶

在面臨來(lái)自自然界中氧氣的脅迫時(shí)，微生物逐漸進(jìn)化出能將氧及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行還原和降解的蛋白酶，在乳酸菌中這些抗氧化酶主要有NADH氧化酶/NADH過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等。

1.1 NADH氧化酶(NADH oxidase)/NADH過(guò)氧化物酶(NADH peroxidase)

除NADH氧化酶外，還在乳桿菌和糞球菌中發(fā)現(xiàn)一類NADH過(guò)氧化物酶[5-7]，這類酶催化反應(yīng)如下：

NADH過(guò)氧化物酶可直接將過(guò)氧化氫還原為水，但這種酶在氧化脅迫時(shí)降解過(guò)氧化氫的效率較低，只是作為一種協(xié)同的氧化防御機(jī)制。

1.2 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)

超氧化物歧化酶是廣泛存在于生物體的一種十分重要的金屬酶，按其結(jié)合金屬離子種類的不同可以分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種，這類酶在抗氧化功能中起著非常重要的作用，廣泛分布于一些好氧菌中，如大腸埃希菌中的Fe-SOD，在一些乳酸菌屬中也有超氧化物歧化酶的分布，這類酶主要是Mn-SOD，如鏈球菌和乳桿菌[8-9]。這類酶催化反應(yīng)如下：

與很多菌體的SOD不同，嗜熱鏈球菌無(wú)論是在厭氧還是通氧的培養(yǎng)狀態(tài)下，都有SOD的表達(dá)，而且這種表達(dá)不受百草枯(能產(chǎn)生超氧自由基)的誘導(dǎo)，在它的生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期以后，SOD的表達(dá)量會(huì)增加三至四倍[10]。將sod基因進(jìn)行外源表達(dá)后，可明顯提高乳桿菌的抗氧化能力，還可以使其發(fā)揮抗炎癥的生理作用[11-12]。

研究還發(fā)現(xiàn)SOD與酸脅迫之間存在一定的關(guān)系，將Mn-SOD基因敲除后，增加了嗜熱鏈球菌對(duì)酸應(yīng)激的敏感性，推測(cè)氧化應(yīng)激反應(yīng)與酸應(yīng)激反應(yīng)間存在一種共同的應(yīng)答機(jī)制，酸應(yīng)激也存在產(chǎn)生ROS的過(guò)程[13]。

1.3 過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)

過(guò)氧化氫酶可簡(jiǎn)單地分為兩種：一種以血紅素為輔基的過(guò)氧化氫酶或被稱為真正的過(guò)氧化氫酶；另外一種以錳離子為輔基的過(guò)氧化氫酶，稱為假過(guò)氧化氫酶(Mn-Kat)，或錳離子型過(guò)氧化氫酶[14]，其催化反應(yīng)如下：

由于乳酸菌胞內(nèi)普遍缺乏合成血紅素的機(jī)制，所以只能通過(guò)添加外源血紅素來(lái)表達(dá)過(guò)氧化氫酶的活性，但也發(fā)現(xiàn)了需要錳離子為輔基的過(guò)氧化氫酶[15]。目前鑒定過(guò)的過(guò)氧化氫酶主要存在于植物乳桿菌和清酒乳桿菌中，而且進(jìn)行了基因工程的構(gòu)建，通過(guò)外源表達(dá)，可以提高宿主菌對(duì)過(guò)氧化氫耐受的能力，延緩發(fā)酵肉制品的脂質(zhì)過(guò)氧化等[16-19]。而將SOD與CAT進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，這兩種抗氧化酶可在活性氧清除途徑中發(fā)揮互補(bǔ)作用，顯著提高長(zhǎng)雙歧桿菌和副干酪乳桿菌的耐氧能力[20-21]。

1.4 過(guò)氧化物氧化還原酶

目前在細(xì)菌中研究較多的過(guò)氧化物氧化還原酶主要是烷基過(guò)氧化物酶(Alkyl-hydroperoxidase, AhpC)、巰基過(guò)氧化物酶(Thiol peroxidase, Tpx)、有機(jī)過(guò)氧化物抗性蛋白(Organic hydroperoxide resistance protein, Ohr)。

1.4.1 烷基過(guò)氧化物酶 AhpC首先在沙門氏菌的氧化脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。它可以還原包括過(guò)氧化氫、有機(jī)過(guò)氧化物等許多更高結(jié)構(gòu)的過(guò)氧化物，所以在細(xì)菌抗氧化反應(yīng)中具有重要作用。AhpC通常以二聚體形式參與氧化還原反應(yīng)，AhpC結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其中能被過(guò)氧化的半胱氨酸殘基首先與過(guò)氧化物(ROOH)反應(yīng)生成相應(yīng)的乙醇，或?qū)⑦^(guò)氧化氫還原為水，而自身生成半胱氨酸次磺酸，接著半胱氨酸次磺酸與另一個(gè)保守半胱氨酸殘基形成二硫鍵，而二硫鍵的還原再生需要AhpC的還原酶AhpF參與[22]。AhpF是AhpC專一性的還原酶，廣泛分布在細(xì)菌中[23]，一般與AhpC位于同一個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)中，并受到過(guò)氧化物轉(zhuǎn)錄因子OxyR、PerR等的調(diào)控。目前研究還發(fā)現(xiàn)，在低溫下AhpC還可以增強(qiáng)乳酸菌的抗氧化能力，對(duì)乳酸菌的快速增長(zhǎng)起著重要作用[24]。

1.4.2 巰基過(guò)氧化物酶 Tpx最早從大腸埃希菌中分離得到，具有一種巰基依賴型的過(guò)氧化物酶活性，Tpx是大腸埃希菌在厭氧條件下生存的主要抗氧化劑[25]。與AhpC類似，Tpx以二聚體形式頭尾相連，通過(guò)每個(gè)亞基中保守的半胱氨酸殘基來(lái)感受環(huán)境中過(guò)氧化物，與之反應(yīng)生成乙醇或水，自身氧化為次磺酸后被還原為巰基，完成一次氧化還原循環(huán)。有研究發(fā)現(xiàn)Tpx可能在單線態(tài)氧介導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起重要的保護(hù)作用，同時(shí)Tpx也對(duì)細(xì)菌細(xì)胞胞內(nèi)的氧化還原的平衡有重要貢獻(xiàn)[26]。目前對(duì)于Tpx的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不是十分清楚。

1.4.3 有機(jī)過(guò)氧化物抗性蛋白 Ohr 是一種分子量在15 kDa、基于半胱氨酸硫醇依賴的過(guò)氧化物酶，包含兩個(gè)高度保守的氧化還原反應(yīng)性半胱氨酸殘基，這些殘基在過(guò)氧化代謝中起重要作用。Ohr具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，且需要單硫醇來(lái)支持其生理活性。在反應(yīng)時(shí)，一個(gè)半胱氨酸殘基被氧化成次磺酸中間體，然后立即與第二個(gè)半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)二硫鍵[27]。Ohr在有機(jī)過(guò)氧化物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[28-29]。

2 錳離子

在植物乳桿菌中，胞內(nèi)普遍缺乏超氧化物歧化酶，但是具有較高濃度的錳離子，胞內(nèi)的錳離子濃度可達(dá)到35 mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)這些高濃度的錳離子具有類似于超氧化物歧化酶的作用，可以清除胞內(nèi)的超氧陰離子，這種清除作用需要有胞內(nèi)磷酸基團(tuán)及乳酸的參與。SOD基因敲除的嗜熱鏈球菌在進(jìn)行通氣培養(yǎng)時(shí)，如果培養(yǎng)基中添加了MnCl2，則可以明顯改善菌體在通氧下的生長(zhǎng)情況。但是一些其他的乳酸菌，如保加利亞乳桿菌，在富含錳離子的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，依然沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，進(jìn)一步推測(cè)這種依靠胞內(nèi)錳離子的抗氧化機(jī)制可能與菌體膜上的錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)[30]。

3 維持胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)

在細(xì)菌受到氧化脅迫后，細(xì)菌胞內(nèi)原有的一些小分子蛋白具有抗氧化的作用。這些小分子蛋白或肽是一種組成型表達(dá)，組成了細(xì)菌防御氧化脅迫反應(yīng)的第一道防線。在革蘭陰性菌及少數(shù)陽(yáng)性菌中有一類重要的小分子肽谷胱甘肽(L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)，在維持細(xì)菌胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。由于谷胱甘肽結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基中的巰基具有接收電子的作用，所以經(jīng)常以氧化還原酶的輔基形式參與氧化脅迫應(yīng)激反應(yīng)和受損蛋白等生物大分子的修復(fù)。乳酸菌中有些種可以合成或從生長(zhǎng)介質(zhì)中導(dǎo)入谷胱甘肽，如發(fā)酵乳桿菌ME-3中包含谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽還原酶，可以從環(huán)境中運(yùn)輸及合成谷胱甘肽來(lái)參與抗氧化反應(yīng)[31]。而乳酸乳球菌不具有谷胱甘肽生物合成的途徑，但是通過(guò)在培養(yǎng)基中添加外源的谷胱甘肽，平臺(tái)期生長(zhǎng)的乳酸乳球菌可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)和利用谷胱甘肽，來(lái)增加對(duì)過(guò)氧化氫氧和酸的抗性[32-33]。

在氧化脅迫反應(yīng)中，對(duì)生物大分子最顯著的影響就是蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基中的巰基被氧化，有些乳酸菌如干酪乳桿菌胞內(nèi)由于不能合成谷胱甘肽，但是它們可以通過(guò)硫氧還蛋白途徑或谷氧還蛋白途徑，利用半胱氨酸殘基中的巰基來(lái)還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵 (如蛋氨酸亞砜還原酶和過(guò)氧化物氧還酶中的二硫鍵)，保持細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境，而自身被氧化的硫氧還蛋白和谷氧還蛋白需要NADPH和NADH提供電子來(lái)恢復(fù)還原狀態(tài)[34-35]。

4 適應(yīng)性機(jī)制

適應(yīng)性是一種廣泛存在于細(xì)菌中的生理反應(yīng)能力。當(dāng)生長(zhǎng)中的環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)菌會(huì)激活一種適應(yīng)性機(jī)制去抵抗更為惡劣的生存環(huán)境。乳球菌在用亞致死水平的H2O2處理后，能增強(qiáng)菌體對(duì)致死水平的H2O2的抵抗力，延長(zhǎng)菌體的生存期[36]。而且乳酸菌經(jīng)過(guò)一定的環(huán)境脅迫處理，比如用UV輻射、饑餓、高溫及低pH，可以增強(qiáng)菌體對(duì)其他一些脅迫應(yīng)激反應(yīng)的防御能力，這主要由于一定的脅迫處理后能誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生共同防御機(jī)制來(lái)抵抗不同的脅迫反應(yīng)[37]。

5 其他機(jī)制

除上述機(jī)制外，在變性鏈球菌中，還存在一種DNA結(jié)合蛋白dpr，這種蛋白屬于DNA結(jié)合蛋白大家族，但是還能與Fe2+結(jié)合，阻止Fe2+參與Fenton反應(yīng)，從而預(yù)防了羥自由基的產(chǎn)生，減輕了自由基對(duì)細(xì)胞的損害[38]。此外，在植物乳桿菌中，還存在丙酮酸氧化酶等酶蛋白[39]，這些酶雖然沒(méi)有廣泛分布，但還是具有一定的抗氧化作用，在一定程度上減輕了氧化脅迫對(duì)細(xì)胞的影響。抵抗氧化應(yīng)激的另一種方法是對(duì)氧的有效吸收和利用，乳酸乳球菌在血紅素存在下進(jìn)行通氣培養(yǎng)，其細(xì)胞色素氧化酶可以直接參與電子傳遞鏈進(jìn)行呼吸作用，可在一定范圍內(nèi)克服氧化應(yīng)激損傷[40]。此外，還存在一類DNA修復(fù)蛋白R(shí)ec A。乳酸菌在氧化脅迫應(yīng)激下，當(dāng)自由基如羥自由基攻擊菌體DNA并造成DNA損傷時(shí)，需要Rec A這類修復(fù)蛋白對(duì)受損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，以使其發(fā)揮正常的遺傳信息載體作用[41]。

6 展 望

近年來(lái)對(duì)于乳酸菌抗氧化機(jī)制的研究已經(jīng)取得了一定的研究結(jié)果，但對(duì)于乳酸菌氧化應(yīng)激反應(yīng)中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還比較缺乏。此外，一些乳酸菌可能同時(shí)存在多種抗氧化機(jī)制，并且這些抗氧化機(jī)制與其他環(huán)境脅迫應(yīng)激反應(yīng)存在一定的交叉和互補(bǔ)，比如在酸脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，從而誘發(fā)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)。因此在研究乳酸菌對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)激的響應(yīng)機(jī)制時(shí)，有必要同時(shí)對(duì)乳酸菌的抗氧化水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。

氧化脅迫是影響乳酸菌生長(zhǎng)、發(fā)酵性能及產(chǎn)品特性的重要因素，因此闡明乳酸菌的抗氧化機(jī)制將有助于篩選抗氧化菌株，為解決乳品工業(yè)中發(fā)酵劑菌株面臨的耐氧問(wèn)題提供思路。而作為益生菌，具有較強(qiáng)的抗氧化性，可以提高菌株在產(chǎn)品生產(chǎn)以及腸道中的存活率，有利于發(fā)揮益生作用。在深入了解乳酸菌抗氧化機(jī)制的基礎(chǔ)上，可以利用抗氧化功能基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行抗氧化乳酸菌的高通量篩選，而這無(wú)疑將大幅提高抗氧化乳酸菌的篩選效率。

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The Antioxidative Mechanism of Lactic Acid Bacteria

DUAN Xi-yu, YE Ling, LIU Cheng-guo, WANG Rong-rong, ZHOU Hui

(Coll.ofFoodSci. &Technol.,HunanAgric.Uni.,Changsha410128)

Lactic acid bacteria (LAB) could be used as leavening agents and preservative in the production and preservation of fermented food. Due to the inability of breathing and energy producing capacity during the growth, LAB will face with oxidative coercion. Studies have shown that, LAB possess a certain antioxidant capacity, it can scavenging active oxygen molecule (AOM) within the cell, and keep it in relatively stable. This review provided the antioxidative mechanisms of LAB, mainly from the introduction of antioxidant enzymes, the maintenance of cellular redox status, and the chelation of metal ions and other aspects, so as to get the insight of the antioxidative mechanisms of LAB and provide certain theoretical references of the improvement of the environmental viability of LAB.

lactic acid bacteria (LAB); antioxidation; antioxidant enzymes

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571811)

段希宇 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：598224594@qq.com

* 通訊作者。男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事食品生物技術(shù)研究。Tel:0731-84617007，E-mail：paradise917@163.com

2016-06-13；

2016-08-14

Q939.11+7

A

1005-7021(2017)03-0111-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.018