王宏坤，鄭繪霞，梁建芳，肖 虹

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:huixiazheng62@126.com)

ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

王宏坤，鄭繪霞*，梁建芳，肖 虹

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:huixiazheng62@126.com)

目的 探討ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的表達并分析其臨床意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科收集的133例乳腺癌和80例正常乳腺組織中ECT2和E2F1蛋白的表達情況。 結(jié)果 ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的陽性表達率分別為55.6%和74.4%,二者分別與正常組織(8.8%和2.5%)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);ECT2和E2F1蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小及腫瘤類型無關(guān)(P>0.05),與腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示,ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的表達呈顯著正相關(guān)性(r=0.344,P<0.05)。 結(jié)論 ECT2和E2F1蛋白表達在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中相互之間存在一定的作用,ECT2在乳腺癌中的作用可能受E2F/RB信號通路的調(diào)控,二者共同表達對評估患者預(yù)后有一定的價值。

乳腺癌; ECT2; E2F1

乳腺癌為惡性上皮性腫瘤,是上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化而形成的。在上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中可能存在多種基因蛋白的參與及多種信號通路的參與。與人類癌癥發(fā)生密切相關(guān)的癌基因,ECT2(epithelial cell transforming sequence 2)即上皮細胞轉(zhuǎn)化序列2,它的作用是在某些信號通路的參與下能將上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化,從而形成腫瘤[1]。E2F/RB信號通路在癌癥的形成過程中起了重要的作用,是細胞周期中調(diào)控細胞分裂的重要通路,有研究顯示,ECT2直接受E2Fs信號通路的調(diào)控,在敲除RB基因的骨肉瘤U-2 OS細胞中,ECT2表達受到抑制并且導(dǎo)致了細胞分裂的停滯,說明在RB缺失的細胞中,缺乏E2F介導(dǎo)的細胞分裂的調(diào)控是ECT2表達受抑制的主要原因[2]。本研究通過檢測乳腺癌中ECT2和E2F1蛋白的表達情況,分析二者的表達關(guān)系及臨床意義,初步探討ECT2在乳腺癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012-01～2016-01間在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科存檔的乳腺癌根治標本133例,80例相應(yīng)正常乳腺組織(標本均為乳腺癌根治標本中遠離癌組織的正常乳腺)。全部病例術(shù)前均未行放療、化療,并已將資料不完整者排除(包括患者年齡、其他病史、放化療史等不詳?shù)馁Y料)。所有病理資料全部進行復(fù)查,均由2名資深的高級職稱病理醫(yī)師雙盲做出診斷。

1.2 實驗方法

ECT2抗體購自Sigma公司,E2F1鼠抗人單克隆抗體、免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組化按EnVision二步法進行檢測。ECT2、E2F1濃度配比1 ∶100。實驗步驟按試劑說明書進行,4 μm厚切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2液處理標本,高壓抗原修復(fù)沖洗,滴加一抗二抗,顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片。用已知陽性切片作陽性對照和PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

顯微鏡下可見ECT2蛋白在腫瘤細胞胞核中表達,部分細胞胞質(zhì)有微弱表達,E2F1以細胞核呈棕黃色為陽性,以染色強度和陽性細胞百分率判斷,高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野,每個視野計數(shù)50個細胞,取平均值作為陽性百分率(陰性為0,陽性細胞占1%-10%為1分,11%-50%為2分,51%-80%為3分,81%-100%為4分),染色強度不顯色為0分,依次弱陽性1分、中等陽性2分、強陽性3分。兩者積分相乘:≤4分為低表達/不表達,>4分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理,計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗及Pearson相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達

ECT2蛋白在133例乳腺癌中有74例陽性表達,陽性率為55.6%,與正常乳腺組織陽性率8.8%(7/80)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);E2F1蛋白在乳腺癌中的陽性表達率為74.4%,正常乳腺組織為2.5%,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。免疫結(jié)果顯示ECT2和E2F1在乳腺癌中呈高表達(見圖1,2)。

表1 ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達情況

Table 1 The expression of ECT2 and E2F1 protein in breast cancer and normal breast tissues

分組ECT2E2F1+-χ2P+-χ2P乳腺癌 745946.6020.0009934103.6750.000正常乳腺組織773278

圖1 ECT2在乳腺癌中高表達(EnVision法，×100)Figure 1 High expression of ECT2 in breast cancer (EnVision，×100)

圖2 E2F1在乳腺癌中高表達(EnVision，×100)Figure 2 High expression of E2F1 in breast cancer (EnVision，×100)

2.2 ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的表達及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

ECT2和E2F1蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小及類型均無關(guān)(P>0.05),與腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.3 乳腺癌中ECT2和E2F1蛋白表達之間的相關(guān)性分析

133例乳腺癌中ECT2蛋白與E2F1蛋白共同陽性表達65例(見表3),Pearson相關(guān)性分析顯示,ECT2蛋白與E2F1蛋白二者表達呈顯著正相關(guān)(r=0.344,P=0.000)。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果,其中細胞的惡性轉(zhuǎn)化是乳腺癌發(fā)生的主要原因之一,而細胞的惡性轉(zhuǎn)化也需要多種基因蛋白或信號通路等復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程的參與,因此乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程。ECT2是鳥苷酸交換因子,定位于人染色體3q26,是一種具有高度保守性的基因,已被確定為原癌基因,它能將成纖維細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞,能與Rho GTP家族成員相互作用導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化,引發(fā)細胞分裂,調(diào)控上皮細胞的極性,到目前為止,ECT2被認為與人類多種癌癥相關(guān),

表2 乳腺癌中ECT2和E2F1蛋白表達與臨床指標之間的關(guān)系 (例)

Table 2 The relationships between expression of ECT2 and E2F1 protein and clinical parameters in breast cancer (cases)

臨床病理參數(shù)nECT2E2F1+-χ2P+-χ2P例數(shù)13374599934年齡(歲)0.5150.4900.0021.000 ≤496333304716 >497041295218腫瘤大小(cm)0.1380.7292.0560.168 ≤26135264912 >27239335022腫瘤類型0.2640.7083.3240.087 浸潤性導(dǎo)管癌9152397219 浸潤性小葉癌4222202715分級7.1770.0289.9650.007 G15121303120 G2453015405 G3372314289淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34.4500.00021.0820.000 是42393420 否9135565734TNM分期13.0010.00534.8470.000 Ⅰ期3012181020 Ⅱ期342014286 Ⅲ期453311405 Ⅳ期24915213

表3 ECT2和E2F1蛋白在乳腺癌中的表達關(guān)系 (例)

Table 3 The relationship between the expression of ECT2 and E2F1 protein in breast cancer (cases)

E2F1ECT2+-χ2P+653415.7450.000-925

甚至包括膠質(zhì)瘤[1]。ECT2的表達與細胞周期調(diào)控及細胞分裂密切相關(guān)[3],ECT2的表達下調(diào)可以將細胞阻滯在G1期,ECT2表達可以動態(tài)調(diào)控整個細胞周期[4]。由此可見,ECT2在腫瘤發(fā)生機制中可能起了非常重要的作用。在肝癌的研究中顯示,ECT2在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織,體外實驗顯示,過表達ECT2對HEP3B細胞的克隆增殖能力顯著提高,并且顯著增加了細胞的侵襲遷移能力,ECT2的表達上調(diào)與肝癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[5]。消化道腫瘤如胃癌的研究發(fā)現(xiàn),無論是在胃癌組織還是血清中,ECT2的表達都顯著高于正常對照,而且ECT2的表達與臨床病理參數(shù)包括腫瘤分級,TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),ECT2在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用,可能是胃癌診斷和靶向治療的依據(jù)[6]。不僅在胃癌中發(fā)現(xiàn)ECT2,而且在食管癌和結(jié)直腸癌中同樣發(fā)現(xiàn)ECT2在腫瘤中呈高表達,而且是患者預(yù)后差的重要標記物[7,8]。

本研究通過檢測ECT2在乳腺組織中的表達,發(fā)現(xiàn)在癌陽性率明顯高于正常對照;與臨床病理參數(shù)比較,ECT2表達與腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),腫瘤分級高者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及TNM分期高的病例ECT2表達明顯增加,眾所周知,此三類參數(shù)均是患者惡性進展甚至是預(yù)后判斷的指標,由此可見,ECT2不但與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),還可能與患者的預(yù)后相關(guān)。

E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在細胞的增殖分化及凋亡中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9]。在E2F/RB信號通路中,當細胞周期蛋白激酶與RB結(jié)合后,磷酸化的RB釋放E2F家族成員,激活后E2F能夠引起下游基因的信號傳導(dǎo),從而調(diào)節(jié)與細胞周期相關(guān)的多種基因的表達[10,11]。E2F1是E2F家族重要的轉(zhuǎn)錄因子,在細胞周期的調(diào)節(jié)和凋亡中發(fā)揮著重要的作用。在腎透明細胞癌Caki-2細胞株中,未敲除E2F1的細胞中表達較高,而敲除E2F1后細胞的增殖能力、侵襲遷移能力都明顯下降,提示E2F1在腎透明細胞癌中有促進腫瘤生長的作用,并認為E2F1在癌細胞中的異常表達可能是腎透明細胞癌未來潛在的治療靶點[12]。在鼻咽癌細胞中,E2F1的表達能夠顯著抑制某藥物誘導(dǎo)的放療敏感性,而當敲除E2F1后,細胞對放療的敏感性明顯增強,細胞死亡率增加[13]。睪丸生殖細胞腫瘤中,E2F1的表達明顯增高,而對照組織中則呈現(xiàn)低表達/不表達[14]。我們的實驗結(jié)果顯示,E2F1在正常組織中的表達明顯低于癌組織,在癌組織中的表達與腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),分級高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及TNM分期高者E2F1表達明顯增加,可見E2F1在乳腺癌中的表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

由于ECT2在細胞周期調(diào)控中起著重要的作用,轉(zhuǎn)錄因子E2F1在細胞周期的調(diào)控中同樣有一定的作用。在某些癌細胞中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn),ECT2基因在缺乏E2F介導(dǎo)的細胞中表達明顯受到抑制,而存在E2F1的細胞中,在細胞分裂的過程中,E2F1能夠提供轉(zhuǎn)錄調(diào)控,使ECT2在S期與其他一些因子相互調(diào)節(jié),從而在G2/M期細胞分裂達到頂峰,導(dǎo)致細胞增殖[2,15]。本實驗結(jié)果顯示,133例乳腺癌中,ECT2與E2F1表達共陽性例數(shù)為65例,統(tǒng)計學(xué)分析,二者間表達存在顯著正相關(guān)性,提示在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中,二者存在相互協(xié)同作用,ECT2在乳腺癌中的作用可能與E2F/RB信號通路有關(guān),具體的作用機制需要從細胞體內(nèi)外實驗中才能證實。我們還發(fā)現(xiàn),二者共同陽性病例中多數(shù)為腫瘤分級高、TNM分期高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例,可見ECT2與E2F1共同表達在評估乳腺癌的預(yù)后中也有一定的作用?？傊?ECT2與E2F1在乳腺癌中均呈現(xiàn)高表達,二者在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起了一定的作用,二者共表達的患者可能預(yù)后較差。

[1] Jin Y, Yu Y, Shao Q,etal.Up-regulation of ECT2 is associated with poor prognosis in gastric cancer patients[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(12):8724-8731.

[2] Eguchi T, Takaki T, Itadani H,etal.RB silencing compromises the DNA damage-induced G2/M checkpoint and causes deregulated expression of the ECT2 oncogene[J].Oncogene, 2007,26(4):509-520.

[3] Tan H, Wang X, Yang X,etal.Oncogenic role of epithelial cell transforming sequence 2 in lung adenocarcinoma cells[J].Exp Ther Med,2016,12(4):2088-2094.

[4] Iyoda M, Kasamatsu A, Ishigami T,etal.Epithelial cell transforming sequence 2 in human oral cancer[J].PLoS One,2010,5(11):e14082.

[5] 袁媛,周闖,翟文龍.上皮細胞轉(zhuǎn)化序列2誘導(dǎo)肝癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進侵襲轉(zhuǎn)移[J].中華實驗外科雜志,2016,33(9):2144-2146.

[6] Wang HB, Yan HC, Liu Y.Clinical significance of ECT2 expression in tissue and serum of gastric cancer patients[J].Clin Transl Oncol, 2016,18(7):735-742.

[7] Luo Y, Qin SL, Mu YF,etal.Elevated expression of ECT2 predicts unfavorable prognosis in patients with colorectal cancer[J].Biomed Pharmacother,2015,73: 135-139.

[8] Hirata D, Yamabuki T, Miki D,etal. Involvement of epithelial cell transforming sequence-2 oncoantigen in Lung and Esophageal cancer progression[J].Clin Cancer Res, 2009,15(1):256-266.

[9] Polager S,Ginsberg D. E2F-at the crossroads of life and death[J].Trends Cell Biol,2008,18:528-535.

[10] Udayakumar T, Shareef MM, Diaz DA,etal.The E2F1/Rb and p53/MDM2 pathways in DNA repair and apoptosis: understanding the crosstalk to develop novel strategies for prostate cancer radiotherapy[J].Semin Radiat Oncol,2010,20(4):258-266.

[11] Mushtaq M, Gaza HV, Kashuba EV. Role of the RB-Interacting proteins in stem cell biology[J].Adv Cancer Res,2016,131:133-157.

[12] 高宇,范陽,陳偉浩,等.敲低E2F1基因?qū)δI透明細胞癌細胞株Caki-2細胞增殖和侵襲力的影響[J].中華實驗外科雜志,2013,30(2):333-335.

[13] Tan Y, Wei X, Zhang W,etal.Resveratrol enhances the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells by downregulating E2F1[J].Oncol Rep, 2017,37(3):1833-1841.

[14] Rocca MS, Di Nisio A, Marchiori A,etal.Copy number variations of E2F1: a new genetic risk factor for testicular cancer[J].Endocr Relat Cancer,2017,24(3):119-125.

[15] Seguin L, Liot C, Mzali R,etal.CUX1 and E2F1 regulate coordinated expression of the mitotic complex genes Ect2, MgcRacGAP, and MKLP1 in S phase[J].Mol Cell Biol, 2009,29(2):570-581.

Expression and clinical significance of ECT2 and E2F1 protein in breast cancer

WANG Hongkun,ZHENG Huixia*,LIANG Jianfang,XIAO Hong

(DepartmentofPathology,FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;*Correspondingauthor,E-mail:huixiazheng62@126.com)

ObjectiveTo explore the expression of ECT2 and E2F1 protein in breast cancer and its clinical significance.MethodsExpression of ECT2 and E2F1 protein was detected in 133 cases of breast cancer and 80 normal breast tissues from department of pathology in First Hospital of Shanxi Medical University using EnVision immunohistochemistry.ResultsThe positive expression rates of ECT2 and E2F1 protein were significantly higher than those of normal breast tissues(55.6%vs8.8%,74.4%vs2.5%,P<0.05). The expression of ECT2 and E2F1 was not correlated with age, tumor size and tumor type(P>0.05), but correlated with tumor grade, lymphatic metastasis and TNM staging(P<0.05). ECT2 expression was positively correlated with E2F1 expression in breast cancer (r=0.344,P<0.05).ConclusionThe expression of ECT2 and E2F1 protein plays a interaction role in the occurrence and deve-lopment of breast cancer. The role of ECT2 may be regulated by E2F/RB signaling pathway in breast cancer. The co-expression of two markers has some value in evaluating the prognosis of patients.

breast cancer; ECT2; E2F1

王宏坤,男,1979-10生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:whk2005002@163.com

2017-04-27

R737.9

A

1007-6611(2017)08-0852-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.021