汪進(jìn)城,汪 虎,張 配,劉永紅,許培權(quán)*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233004;2蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;*通訊作者,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

miRNA-506在乳腺癌中的表達(dá)及其意義

汪進(jìn)城1,汪 虎1,張 配2,劉永紅1,許培權(quán)1*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科,蚌埠 233004;2蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;*通訊作者,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

目的 探討microRNA-506(miR-506)在乳腺癌患者中的表達(dá)水平,并進(jìn)一步研究其臨床意義。 方法 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測miR-506在30例乳腺癌組織及其癌旁正常組織、10例乳腺良性病變組織中的表達(dá)水平,用P50(P25,P75)表示;使用免疫組化的方法檢測乳腺癌組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、HER-2、Ki-67和P53的表達(dá);分析miR-506與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 乳腺癌組織中miR-506表達(dá)水平為0.301 0(0.069 5,0.349 3),明顯低于正常組織2.361 5(1.906,3.658 0)和良性組織2.671 5(2.274,2.992 5),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-506在正常組織和良性組織中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);乳腺癌組織中miR-506水平在不同腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同HER-2和Ki-67表達(dá)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但在不同年齡、不同組織學(xué)分級、不同TNM分期、不同ER、PR和P53表達(dá)之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 miR-506在乳腺癌組織中的表達(dá)水平降低,miR-506可能參與乳腺癌的病理過程,發(fā)揮類似抑癌基因的作用。

乳腺癌; miR-506; qRT-PCR; 免疫組織化學(xué)

乳腺癌(breast cancer)是一種好發(fā)于女性的惡性腫瘤,常表現(xiàn)為乳腺腫塊、皮膚改變以及腋窩淋巴結(jié)腫等,現(xiàn)今已成為全球女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1-3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中長約18-23個核苷酸的小分子非編碼RNA,具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的功能,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)進(jìn)程[4]。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)和證明了許多人類惡性腫瘤中都存在異常表達(dá)的miRNA, miRNA因表達(dá)的不同、作用靶基因的不同,發(fā)揮著抑癌或者致癌基因的角色[5-7]。miR-506位于X染色體上,為miR-506-514群的一員,在多種惡性腫瘤中表達(dá)降低[8-11]。本研究旨在探索miRNA-506在乳腺良性病變、乳腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)差異,并分析其在乳腺癌組織中的表達(dá)以及與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系,進(jìn)而為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 組織標(biāo)本來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科2016-11～2017-01乳腺癌手術(shù)標(biāo)本及其對應(yīng)的癌旁正常組織各30例(癌旁正常乳腺組織取自距離癌組織邊緣≥5 cm且與腫塊不在同一象限),另取乳腺纖維腺瘤組織10例。所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療等治療,所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診。所取組織一部分迅速置于液氮中,后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫保存,另一部分行常規(guī)免疫組化。乳腺癌的TNM分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)2003版乳腺癌TNM分期;乳腺癌常規(guī)免疫組化結(jié)果判讀依據(jù)2012年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄劑盒購自中國Takara公司;GeneJET RNA Purification Kit(K0731)RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;HER-2基因擴(kuò)增檢測試劑盒購自北京安必奇生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 按照GeneJET RNA Purification Kit(K0731)RNA提取試劑盒方法提取所需RNA,紫外分光光度儀測定RNA溶液OD260 nm/OD280 nm的吸光度值,計算RNA的濃度和純度;行RNA瓊脂糖凝膠電泳試驗測定其完整性。將檢驗合格的RNA置于-80 ℃冰箱保存,用于逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 將已提取的RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書依次逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄采用20 μl反應(yīng)體系：RNA sample 10.0 μl,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl,RT Primer 1.0 μl,5×PrimeScript Buffer 24.0 μl,RNase Free dH2O 4.0 μl。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,反應(yīng)產(chǎn)物保存于4 ℃。

1.2.3 實時熒光定量PCR 以U6作為內(nèi)參基因，使用Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒和進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。采用20 μl反應(yīng)體系：2×SYBR Green 10 μl，Primer mix 1.6 μl，RT product 1 μl，DNase-free Water 7.4 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值。實驗采用定量PCR中的相對定量法進(jìn)行分析，ΔCt癌=Ct待測基因-CtU6,ΔCt正常=Ct待測基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌-ΔCt正常，F(xiàn)=癌/正常=2-ΔΔCt(F即代表癌組織相對正常組織的表達(dá)變化倍數(shù))。

1.2.4 免疫組化 按照SP試劑盒說明書對乳腺癌標(biāo)本組織進(jìn)行免疫組化染色,以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照,用試劑公司提供的陽性切片作對照。所得試驗結(jié)果由本院病理科兩名專業(yè)醫(yī)師在雙盲的前提下閱片分析并判斷結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,miRNA-506的表達(dá)數(shù)據(jù)以P50(P25,P75)來表示。多組獨立樣本間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗,多樣本間兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換后的LSD檢驗,miRNA-506表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系應(yīng)用Fisher確切概率法檢驗。所有實驗結(jié)果統(tǒng)計值均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR特異性檢測

miRNA-506的擴(kuò)增曲線平滑,基線期、對數(shù)期、平臺期明顯,擴(kuò)增效果滿意(見圖1)。溶解曲線呈現(xiàn)單一峰,溶解溫度在80-90 ℃之間,表明無引物二聚體或其他非特異性擴(kuò)增片段產(chǎn)生,實驗結(jié)果特異性很高(見圖2)。

2.2 miRNA-506在乳腺癌、癌旁正常組織以及乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)

首先采用Kruskal-WallisH檢驗比較miRNA-506在正常乳腺組織、乳腺良性病變組織和乳腺癌組織中的表達(dá)水平差異(見表1),然后再對數(shù)據(jù)進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換后采用LSD檢驗進(jìn)行三者間兩兩比較。結(jié)果顯示乳腺癌組織中的miRNA-506表達(dá)水平低于癌旁正常組織以及乳腺良性病變組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);癌旁正常組織與乳腺良性病變組織中的miRNA-506表達(dá)水平未見明顯差異(P>0.05)。

圖1 miRNA-506擴(kuò)增曲線

Figure 1 Amplification curve of miRNA-506

圖2 miRNA-506溶解曲線

Figure 2 Dissolution curve of miRNA-506

表1 miRNA-506在正常乳腺組織、乳腺良性病變組織和乳腺癌組織中表達(dá)水平

Table 1 The expression level of miRNA-506 in normal breast tissues, benign breast lesions and breast cancer tissues

組織miRNA-506相對表達(dá)量χ2P乳腺癌組織0.3010(0.0695,0.3493)6.1310.047正常組乳腺組織2.3615(1.9060,3.6580)*#乳腺良性病變組織2.6715(2.2740,2.9925)*

與乳腺癌組織比較,*P<0.05;與乳腺良性病變組織比較,#P>0.05

2.3 常規(guī)免疫組化檢查結(jié)果

本實驗所有乳腺癌標(biāo)本均行術(shù)后免疫組化檢查,包括ER、PR、HER-2基因、Ki-67基因、P53基因,HER-2結(jié)果為陰性或者(+)均判定為陰性,HER-2免疫組化為(++)的,均進(jìn)一步行FISH檢測。本實驗中,有2例標(biāo)本經(jīng)免疫組化檢測示HER-2(++),遂行FISH檢測,依據(jù)乳腺癌HER2檢測指南2014版,對此2例HER-2(++)標(biāo)本判定為陽性(見圖3)。

圖3 FISH檢測HER-2擴(kuò)增陽性Figure 3 HER-2 amplification positive in FISH detection

2.4 miRNA-506的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

以miR-506相對表達(dá)的平均值0.301為分界,將30例標(biāo)本分為miRNA-506高表達(dá)組(n=12)和miRNA-506低表達(dá)組(n=18),采用Fisher精確檢驗，結(jié)果表明miR-506在乳腺癌組織中的表達(dá)水平在不同腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同HER-2和Ki-67表達(dá)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但在不同年齡、不同組織學(xué)分級、不同TNM分期、不同ER、PR和P53表達(dá)之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

乳腺癌現(xiàn)階段已成為女性最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)美國癌癥協(xié)會發(fā)布的2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報道顯示,乳腺癌仍占女性癌癥發(fā)病率的首位[2]。而在我國,乳腺癌的發(fā)病率情況也不容樂觀。根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2017年中國最新癌癥數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌在我國城市地區(qū)女性中的發(fā)病率已經(jīng)躍居第一位。目前,我國對于乳腺癌的就診存在著病期偏晚,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較為常見的現(xiàn)狀,這就使得乳腺癌的總體預(yù)后較差[3]?，F(xiàn)階段對乳腺癌的診斷主要還是依據(jù)臨床癥狀以及影像學(xué)的檢查,缺乏比較特異性的臨床檢測指標(biāo)。因此,尋找一種能夠強有力地評估乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展,診斷、治療及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)就變得十分迫切。

表2 miRNA-506的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理之間的關(guān)系 (例)

Table 2 Relationships between the expression of miRNA-506 and clinicopathological features in patients with breast cancer (cases)

病理參數(shù)miRNA-506高表達(dá)miRNA-506低表達(dá)P年齡0.660 ≤50歲33 >50歲915組織學(xué)分級0.457 Ⅰ+Ⅱ級77 Ⅲ級511腫瘤大小0.009 ≤2cm83 >2cm415淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.000 有114 無114TNM分期0.266 Ⅰ期65 Ⅱ+Ⅲ期613ER1.000 陽性811 陰性47PR0.442 陽性910 陰性38HER-20.001 陽性316 陰性92Ki-670.004 陽性416 陰性82P530.722 陽性79 陰性59

越來越多的研究表明,miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-7]。miR-506位于X染色體上,為miR-506-514群(miR-506,miR-507,miR-508,miR-509,miR-510,miR-513,miR-514)的一員,在肝癌[9]、胰腺癌[10]和胃癌[11]等腫瘤中表達(dá)降低。但同時也有研究發(fā)現(xiàn)miR-506在肺癌[12]和黑色素瘤[13]中表達(dá)升高,這表明miR-506在不同的腫瘤中可能發(fā)揮著不同的作用。

在本實驗中,我們通過使用qRT-PCR方法檢測乳腺癌組織中miR-506的表達(dá)水平,通過與乳腺正常組織以及乳腺良性組織相比較,乳腺癌組織中miR-506的表達(dá)水平明顯低于二者(P<0.05),表明miR-506的下調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生相關(guān),并且在乳腺癌的發(fā)生中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。在分析乳腺癌組織中miR-506的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),miR-506在乳腺癌組織中的表達(dá)水平在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、不同腫瘤大小、不同HER-2和Ki-67表達(dá)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而在患者不同年齡、不同組織學(xué)分級、不同TNM分期、不同ER、PR、以及P53表達(dá)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

HER-2是編碼第2人表皮生長因子的癌基因,參與了調(diào)控細(xì)胞增長、促進(jìn)腫瘤增殖及分化,已經(jīng)成為評估乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素[14],本實驗中miR-506在HER-2陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中的表達(dá)水平明顯低于HER-2陰性、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者,表明miR-506可能在乳腺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用,并參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Ki-67作為一種和細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原,與乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移以及侵襲有著密切關(guān)系,是評估乳腺癌診斷和預(yù)后的一個重要指標(biāo)[15],本實驗中miR-506的表達(dá)水平的高低和Ki-67有關(guān)聯(lián),這也提示miR-506高表達(dá)可能對于乳腺癌的預(yù)后起到積極的作用。miR-506與乳腺癌癌灶大小的關(guān)系尚未在相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn),本實驗結(jié)果也為乳腺癌和腫瘤大小在影響預(yù)后方面的研究提供一個方向。同時,本實驗也存在著病例數(shù)量較少以及缺乏隨訪等不足,無法進(jìn)一步評估m(xù)iR-506在乳腺癌患者預(yù)后中的精確價值。

綜上所述,miR-506在乳腺癌組織中的表達(dá)水平降低,miR-506可能參與乳腺癌的病理過程,發(fā)揮類似抑癌基因的作用。雖然其在乳腺癌中的作用機制還有待進(jìn)一步研究,但相信隨著研究的不斷深入,miR-506有可能作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物及治療、預(yù)后的靶標(biāo)。

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Expression and clinical significance of microRNA-506 in breast cancer

WANG Jincheng1,WANG Hu1,ZHANG Pei2,LIU Yonghong1,XU Peiquan1 *

(1DepartmentofSurgeryOncology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China;2SchoolofPharmacy,BengbuMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:xupeiquan2003@sina.com)

ObjectiveTo explore the expression of microRNA-506(miR-506) in breast cancer and its clinical significance.MethodsThe real-time quantitative PCR(qRT-PCR) method was used to detect miR-506 expression level in 30 cases of breast cancer tissues and adjacent normal tissues and 10 cases of benign breast tissues, and the data were represented byP50(P25,P75).The immunohistochemistry method was used to detect the expression of estrogen receptor(ER), progesterone receptor(PR), HER-2, Ki-67 and P53 in breast cancer tissues. The relationships between miR-506 and clinicopathological features of breast cancer were analyzed.ResultsThe expression level of miR-506 in breast cancer tissues was significantly lower than that in normal tissues and benign tissues(P<0.05). The expression levels of miR-506 in normal tissues and benign tissues were not significantly different(P>0.05). The level of miR-506 was correlated with tumor stage, lymph node metastasis,expression of HER-2 and Ki-67(P<0.05), but not with age, histological grade, TNM stage,expression of ER, PR and P53(P>0.05).ConclusionThe expression level of miR-506 in breast cancer tissues is decreased, and it may be involved in the pathological process of breast cancer, and play a role of tumor suppressor genes.

breast cancer; microRNA-506; qRT-PCR; immunohistochemistry

國家自然科學(xué)基金資助項目(81603155);安徽省自然科學(xué)基金青年基金資助項目(1708085QH212)

汪進(jìn)城，男，1991-12生，在讀碩士，E-mail:18725527900@163.com

2017-05-13

R737.9

A

1007-6611(2017)08-0847-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.020