姜曉斐，羅心平，施海明

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040)

·論 著·

紅景天及紅景天苷對(duì)低氧狀態(tài)下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及表達(dá)的影響Δ

姜曉斐*，羅心平，施海明#

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040)

目的：探討紅景天及紅景天苷對(duì)低氧狀態(tài)下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及表達(dá)的影響。方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并將其分為正常氧對(duì)照組、低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組。采用CCK8法比較不同干預(yù)時(shí)間和質(zhì)量濃度下的細(xì)胞增殖情況，采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平，采用Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：低氧狀態(tài)下，紅景天和紅景天苷均可促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)紅景天培養(yǎng)液質(zhì)量濃度為10 μg/ml、干預(yù)時(shí)間為24 h時(shí)，紅景天對(duì)細(xì)胞的促增殖作用最顯著。低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組細(xì)胞的腎上腺髓質(zhì)素和降鈣素受體樣受體的mRNA、蛋白表達(dá)明顯高于正常氧對(duì)照組，且低氧紅景天組、低氧紅景天苷組明顯高于低氧對(duì)照組，低氧紅景天組明顯高于低氧紅景天苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：紅景天可促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎上腺髓質(zhì)素和降鈣素受體樣受體的mRNA、蛋白表達(dá)，而紅景天苷是紅景天該作用的重要但非唯一有效成分。

紅景天； 紅景天苷； 細(xì)胞增殖； 腎上腺髓質(zhì)素； 降鈣素受體樣受體

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物[1]，根莖用藥，具有耐缺氧、抗心肌缺血、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫及促低氧狀態(tài)下細(xì)胞增殖的作用[2-3]。紅景天中含有苷、苷元、香豆素等物質(zhì)，而紅景天苷是目前評(píng)價(jià)紅景天藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)[4-6]。但紅景天苷是否能夠完全替代紅景天的促細(xì)胞增殖作用尚需進(jìn)一步探討。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族成員，通過與降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)結(jié)合可發(fā)揮包括促血管新生在內(nèi)的多種生理效應(yīng)[7-8]。ADM及CRLR基因啟動(dòng)子中都含有低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)結(jié)合位點(diǎn)，紅景天的促細(xì)胞增殖作用與HIF-1相關(guān)[9]，而該作用與ADM途徑是否相關(guān)及紅景天苷在其中是否發(fā)揮主要作用尚需研究。本研究比較了紅景天水提劑與紅景天苷單體對(duì)細(xì)胞增殖及ADM、CRLR的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)液的制備

1.1.1 對(duì)照培養(yǎng)液：含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。

1.1.2 紅景天培養(yǎng)液：大花紅景天生藥/塊莖(上海雷允上大藥房)粉碎成粉狀后加蒸餾水浸泡2 h，置于中藥提取罐，加熱至100 ℃、煎煮2 h，無菌紗布濾出藥汁后再重復(fù)2次，混合3次提取液，200目篩網(wǎng)過濾，得澄清藥液，真空濃縮至約4 L后置于真空干燥箱干燥72 h，再置于-80 ℃冰箱過夜后使用粉碎機(jī)粉碎成干粉，于-80 ℃冰箱保存待用，每1 kg 紅景天生藥制成紅景天干粉211.59 g。紅景天干粉采用去離子水溶解，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定干粉中紅景天苷含量為0.83%，即每1 g紅景天干粉中含有8.3 mg紅景天苷。將紅景天干粉用去離子水溶解后無菌過濾，制成100 μg/ml的母液，實(shí)驗(yàn)前用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋，即得。

1.1.3 紅景天苷培養(yǎng)液：取紅景天苷粉(純度99%，上海康九化工有限公司)用去離子水溶解后無菌過濾，制成0.83 μg/ml的母液，實(shí)驗(yàn)前用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋，即得。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

取傳代4～6次、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度，以4×104/ml的細(xì)胞密度接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶15 ml細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，24 h后更換培養(yǎng)液進(jìn)行相關(guān)研究。

1.3 分組與處理

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常氧對(duì)照組、低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組。其中正常氧對(duì)照組更換對(duì)照培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；低氧對(duì)照組更換對(duì)照培養(yǎng)液，置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)低氧處理24～72 h；低氧紅景天組更換紅景天培養(yǎng)液，置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)低氧處理24～72 h；低氧紅景天苷組更換紅景天苷培養(yǎng)液，置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)低氧處理24～72 h。本研究采用的低氧狀態(tài)為1%O2、5%CO2、94%N2，所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次或3個(gè)復(fù)孔。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 CCK8法：比較紅景天與紅景天苷在不同干預(yù)時(shí)間和質(zhì)量濃度下細(xì)胞增殖情況。選取6個(gè)紅景天干預(yù)質(zhì)量濃度及對(duì)應(yīng)的紅景天苷干預(yù)質(zhì)量濃度(見結(jié)果)，不同質(zhì)量濃度藥物干預(yù)24、48、72 h后測(cè)定各孔吸光度OD值，無細(xì)胞僅含檢測(cè)液孔為空白對(duì)照孔，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率。相對(duì)細(xì)胞增殖率(%)=(藥物實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(低氧對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4.2 SYBR Green法：實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，查得ADM(GeneID：133)、CRLR(GeneID：10203)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(GeneID：2597)的基因序列，見表1。使用ABI PRIMER EXPRESS 2.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物(由上?；巧锛夹g(shù)公司設(shè)計(jì)，上海生工生物工程有限公司合成)；Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(FSQ-101，TOYOBO公司)，三步法進(jìn)行Realtime PCR擴(kuò)增(QPK-212，TOYOBO公司)，循環(huán)條件為：95 ℃、60 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、45 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab 1 Sequences of PCR primers at real-time quantification SYBR Green

1.4.3 Western Blot法：檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。冷聚丁二酸丁二醇酯清洗貼壁細(xì)胞2次，加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，每106個(gè)細(xì)胞中加入抽提試劑1 ml，冰浴下?lián)u動(dòng)15 min進(jìn)行充分裂解，預(yù)冷的離心機(jī)12 000 g離心15 min，收集上清液，二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白溶液中室溫(25 ℃)封閉膜1 h，TBS/T洗膜3次，加入ADM(R&D SYSTEMS公司)、CRLR(R&D SYSTEMS公司)、β-actin(R&D SYSTEMS公司)4 ℃過夜，TBS/T洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二級(jí)抗體室溫孵育1 h，TBS/T洗膜3次，3,3-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，X光膠片曝光顯影，Image J分析軟件對(duì)灰度值進(jìn)行量化分析。

1.4.4 RQ的計(jì)算公式為：用ΔΔCT相對(duì)定量方法表示治療組樣本基因表達(dá)的數(shù)量，ΔΔCT=(治療組樣本基因均值CT-治療組管家基因均值CT)-(對(duì)照組樣本基因均值CT-對(duì)照組管家基因均值CT)，治療組樣本基因相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的量(RQ值)通過公式2-(ΔΔCT)計(jì)算得到。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藥物質(zhì)量濃度和干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響

紅景天和紅景天苷的促細(xì)胞增殖作用趨勢(shì)基本一致，但紅景天更明顯。當(dāng)紅景天培養(yǎng)液質(zhì)量濃度>50 μg/ml(或相當(dāng)于該質(zhì)量濃度的紅景天苷培養(yǎng)液)，其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用基本消失，甚至抑制細(xì)胞增殖；紅景天培養(yǎng)液濃度為10 μg/ml干預(yù)24 h時(shí)促細(xì)胞增殖作用最顯著，是低氧對(duì)照組細(xì)胞增殖率的1.9倍，故選定該條件為下一步實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件見表2、圖1。

2.2 四組細(xì)胞ADM、CRLR的mRNA表達(dá)相對(duì)量

低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組細(xì)胞的ADM和CRLR的mRNA表達(dá)明顯高于正常氧對(duì)照組，且低氧紅景天組、低氧紅景天苷組明顯高于低氧對(duì)照組，低氧紅景天組明顯高于低氧紅景天苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.3 四組細(xì)胞ADM和CRLR的蛋白表達(dá)情況比較

低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組細(xì)胞的ADM和CRLR的蛋白表達(dá)明顯高于正常氧對(duì)照組，且低氧紅景天組、低氧紅景天苷組明顯高于低氧對(duì)照組，低氧紅景天組明顯高于低氧紅景天苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2—3。

表2 藥物質(zhì)量濃度和干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響Tab 2 Effect of different times of intervention and different concentration on cell proliferation

圖1 藥物質(zhì)量濃度和干預(yù)時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of different intervention time and concentration on cell proliferation

組別ADMmRNACRLRmRNA正常氧對(duì)照組1.000±0.3201.000±0.249低氧對(duì)照組2.322±0.7401.481±0.326低氧紅景天組11.917±1.1453.451±0.202低氧紅景天苷組6.928±1.0282.573±0.297

圖2 四組細(xì)胞ADM和CRLR的蛋白表達(dá)情況Fig 2 Protein expression of ADM and CRLR of four groups

圖3 四組細(xì)胞ADM和CRLR蛋白表達(dá)情況柱形圖Fig 3 Column diagram of protein expression of ADM and CRLR of four groups

3 討論

目前，紅景天苷是紅景天公認(rèn)的主要有效成分[4]，許多相關(guān)研究采用紅景天苷作為對(duì)照品。為保證紅景天與紅景天苷比較時(shí)成分含量一致，本研究根據(jù)以往同類研究經(jīng)驗(yàn)，將紅景天藥物制成易于保存的干粉，并采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器定量測(cè)定干粉中的紅景天苷單體含量，既保證了比較的合理性，同時(shí)也解決了紅景天藥物的質(zhì)控和定量問題。

ADM最初是從人嗜鉻細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)降壓肽，CRLR是一種跨膜蛋白，屬于鳥嘌呤三磷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體家族成員(B型或Ⅱ型)，通過激活型G蛋白和腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷，ADM通過與CRLR結(jié)合產(chǎn)生作用，ADM和它的受體在多個(gè)器官組織中都有表達(dá)，ADM mRNA在心血管系統(tǒng)有相當(dāng)高的水平，有充足的證據(jù)顯示ADM有明確的促血管生長(zhǎng)和心血管系統(tǒng)保護(hù)作用[10-12]。以往的研究結(jié)果證實(shí)，紅景天在大鼠心肌梗死模型中的促血管新生作用與紅景天靶向作用于心肌局部ADM及受體相關(guān)[12-14]。

本研究結(jié)果顯示，紅景天及紅景天苷均在低氧情況下具有促細(xì)胞增殖作用，該作用與ADM途徑相關(guān)。同時(shí)，過高質(zhì)量濃度的紅景天及紅景天苷反而會(huì)抑制細(xì)胞增殖，可能與過高質(zhì)量濃度藥物對(duì)細(xì)胞的毒性有關(guān)，這與以往研究的結(jié)果類似。提示紅景天苷是紅景天促增殖作用的主要成分之一，但非唯一有效成分。低氧對(duì)照組、低氧紅景天組、低氧紅景天苷組細(xì)胞的ADM和CRLR的mRNA、蛋白表達(dá)明顯高于正常氧對(duì)照組，且低氧紅景天組、低氧紅景天苷組明顯高于低氧對(duì)照組，低氧紅景天組明顯高于低氧紅景天苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明紅景天及紅景天苷對(duì)ADM及其受體CRLR在mRNA及蛋白表達(dá)上均有促進(jìn)作用，且該作用具有同步同向性。ADM途徑是紅景天及紅景天苷低氧狀態(tài)下促細(xì)胞增殖作用的機(jī)制之一，而該作用的機(jī)制可能與HIF-1等ADM與CRLR的共同上游因子的影響相關(guān)[15]。

綜上所述，紅景天可促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)ADM和CRLR的mRNA、蛋白表達(dá)，而紅景天苷是紅景天該作用的重要但非唯一有效成分。

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Effects of Rhodiola Rosea and Salidroside on the Proliferation and Expression of Human Umbilical Vein Endothelial Cells under Hypoxia ConditionΔ

JIANG Xiaofei,LUO Xinping,SHI Haiming

(Dept. of Cardiology,Huashan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,China)

OBJECTIVE: To probe into the effects of rhodiola rosea and salidroside on the proliferation and expression of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under hypoxia condition. METHODS: HUVECs were cultivated and divided into normoxia control group,hypoxia control group,hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group. CCK8 assay was adopted to compare the cell proliferation at different times of intervention and different concentrations,SYBR Green fluorescent quantitative polymerase chain reaction assay was adopted to detect the expression of mRNA at real-time,and the Western Blot assay for the expression of protein. RESULTS: Under hypoxia condition,both rhodiola rosea and salidroside can improve the cell proliferation. The improvement of rhodiola rosea was the most significant at the concentration of 10 μg/ml and the intervention of 24 h of the nutrient solution. The mRNA and protein expression of adrenomedullin and calcitonin receptor like receptor of hypoxia control group,hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group were significantly higher than that of the normoxia control group,and that of the hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group were significantly higher than the hypoxia control group,that of the hypoxia rhodiola rosea group was significantly higher than the hypoxia salidroside group,with statistically significant differences (P<0.05). CONCLUSIONS: The rhodiola rosea can improve cell proliferation,promote the mRNA and protein expression of adrenomedullin and calcitonin receptor like receptor,the salidroside is an important but not the only effective constituent of rhodiola rosea of thees functions.

Rhodiola rosea; Salidroside; Cell proliferation; Adrenomedullin; Calcitonin receptor like receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81573710)

R932

A

1672-2124(2017)08-1022-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.006

2017-07-04)

*主治醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性心臟病、心力衰竭。E-mail：sule_jiang@126.com

#通信作者：教授。研究方向：心血管內(nèi)科。E-mail：shihm@medmail.com.cn