張 群，孫 艷，孫玉華

(1.伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000； 2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥理室，新疆 烏魯木齊 830001)

復(fù)方薰衣草油膏的急性毒性及長期毒性研究Δ

張 群1*，孫 艷1，孫玉華2

(1.伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院藥劑科，新疆 伊寧 835000； 2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥理室，新疆 烏魯木齊 830001)

目的：考查復(fù)方薰衣草油膏的急性毒性和長期毒性，為其臨床應(yīng)用的安全性提供實(shí)驗依據(jù)。方法：(1)急性毒性實(shí)驗。將50只豚鼠隨機(jī)分為空白對照組，復(fù)方薰衣草油膏高、中、低劑量組和基質(zhì)對照組，每組10只，除空白對照組外，其余組豚鼠做皮膚破損處理，然后分別一次性給予復(fù)方薰衣草油膏1.500、0.750、0.375 g/kg和基質(zhì)4.000 g/kg，連續(xù)觀察14 d。(2)長期毒性實(shí)驗。將80只Wistar大鼠隨機(jī)分為基質(zhì)對照組和復(fù)方薰衣草油膏高、中、低劑量組，每組20只(雌雄各半)，分別給予基質(zhì)6.0 g/kg和復(fù)方薰衣草油膏1.8、0.9、0.3 g/kg，皮膚涂抹給藥、1日1次，連續(xù)給藥92 d。結(jié)果：急性毒性實(shí)驗結(jié)果顯示，5組豚鼠體質(zhì)量變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察期間，各組豚鼠飲食、活動正常，無異常分泌物，藥物涂抹部位皮膚未見紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)，無死亡情況。長期毒性實(shí)驗結(jié)果顯示，4組大鼠的一般狀況、行為活動、進(jìn)食量、體質(zhì)量變化、外周血象、尿常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)以及病理組織學(xué)等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：復(fù)方薰衣草油膏未見明顯皮膚毒性作用，不同劑量連續(xù)重復(fù)給藥92 d后未見不良反應(yīng)，對大鼠的最大外用安全劑量為1.8 g/kg。

復(fù)方薰衣草油膏； 急性毒性； 長期毒性

薰衣草是新疆維吾爾醫(yī)傳統(tǒng)用藥，維吾爾醫(yī)中稱“烏斯提乎杜思”[1]，在花期以全草作為藥用，具有抗炎、殺菌、止痛、生肌和消除疤痕的功效[2-3]。本研究中的復(fù)方薰衣草油膏為中藥復(fù)方制劑(為在研制劑，準(zhǔn)備申報，暫無批準(zhǔn)文號)，由薰衣草精油、黃芩、薄荷油等成分組成，諸藥合理配伍，起到清熱解毒、止痛、生肌作用，適用于燒燙傷、褥瘡、潰瘍等，對豚鼠燙傷皮膚創(chuàng)面有促愈合作用[4-5]。本研究從動物急性毒性實(shí)驗及長期毒性實(shí)驗等方面對復(fù)方薰衣草油膏進(jìn)行安全性評價。

1 材料

1.1 動物

豚鼠(白色或背部皮膚白色)50只，體質(zhì)量220～250 g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供[動物許可證：SCXK(新)2003-0001]；Wistar大鼠80只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量100～120 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心地方病研究所試驗動物中心提供[動物許可證號：SCXK(新)2003-0001]。實(shí)驗開始前，動物先飼養(yǎng)、觀察7 d，動物室光照充足，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫18～25 ℃。相對濕度40%～50%，實(shí)驗室按常規(guī)定期消毒。

1.2 儀器

BS480型全自動血生化儀、BC-2800vet型獸用血球分析儀(深圳邁瑞儀器有限公司)；C2000-2型高性能血凝儀(北京普利生儀器有限公司)；HC9558型全自動電解質(zhì)分析儀(深圳市航創(chuàng)醫(yī)療設(shè)備有限公司)；SABA-18型全自動血生化儀(意大利醫(yī)學(xué)分析儀器集團(tuán))；Sigma 3K30型低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；TDL80-2B型低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電子天平：AL204型[梅特勒-托利多(上海)有限公司]、LEICA RM2016型(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)、BN-VII型(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)、TS-12D型(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)、TY-6B型(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)。

1.3 藥品與試劑

復(fù)方薰衣草油膏(5%、10%、30%等3個不同濃度)，為棕黃色軟膏，批號：20150524。葡萄糖(GLU)試劑盒(批號：141515018、141815018)、尿素(UREA)試劑盒(批號：141315015)、總膽固醇(TC)試劑盒(批號：141615015)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號：141715013)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號：140215011)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號：140115010)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(批號：140315012)、肌酸激酶(CK)試劑盒(批號：142515011)、肌酐(Cre)試劑盒(批號：141015015)、血清總蛋白(TP)試劑盒(批號：140815013)、血清白蛋白(ALB)試劑盒(批號：140915014)，均由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份公司生產(chǎn)；總膽紅素(TBIL)試劑盒(批號：120791、120811)由中生北控生物科技有限公司提供；血液學(xué)試劑由江西特康科技有限公司生產(chǎn)；血漿凝血酶原時間(PT)試劑盒(批號：105272)由上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2 方法

參考相關(guān)資料[6-9]，進(jìn)行動物急性毒性及長期毒性實(shí)驗。

2.1 急性毒性實(shí)驗

將50只豚鼠隨機(jī)分為空白對照組，復(fù)方薰衣草油膏高、中、低劑量組和基質(zhì)對照組，每組10只，采用不同濃度臨床劑量的2倍作為實(shí)驗劑量。除空白對照組外，其余組豚鼠做皮膚破損處理(于給藥前24 h用8%硫化鈉將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為體表面積的10%；破損皮膚的制作采用粗砂紙摩擦，以滲血為度)，然后分別一次性給予復(fù)方薰衣草油膏1.500、0.750、0.375 g/kg和基質(zhì)4.000 g/kg。連續(xù)觀察14 d，包括動物體質(zhì)量變化、飲食、外觀、行為、分泌物[10]等，如有死亡應(yīng)作大體解剖。

2.2 長期毒性實(shí)驗

將80只大鼠隨機(jī)分為基質(zhì)對照組和復(fù)方薰衣草油膏高、中、低劑量組，每組20只(雌雄各半)，依次給予基質(zhì)6.0 g/kg和復(fù)方薰衣草油膏1.8、0.9、0.3 g/kg(相當(dāng)于70 kg成人每日每公斤體質(zhì)量臨床用量的4 690、14 070、28 140倍)。給藥時將復(fù)方薰衣草油膏及基質(zhì)均勻涂布于100 g大鼠已剃毛3 cm×3 cm的背皮上，連續(xù)給藥90 d。觀察大鼠的一般情況，每周測定1次體質(zhì)量。在連續(xù)給藥90 d后，每組取10只大鼠，麻醉后腹主動脈取血，測定血常規(guī)、凝血功能指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)；然后頸椎脫臼處死并解剖大鼠，進(jìn)行主要臟器的肉眼觀察、臟器系數(shù)計算及組織病理學(xué)檢查。于停藥第30日，將剩余大鼠按上述要求進(jìn)行同樣處理。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 急性毒性實(shí)驗結(jié)果

各組豚鼠體質(zhì)量變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察期間，各組豚鼠飲食、活動正常，無異常分泌物，藥物涂抹部位皮膚未見紅斑和水腫情況，也未觀察到有色素沉著、出血點(diǎn)，無死亡情況。參考類似研究[12-13]，可認(rèn)為復(fù)方薰衣草油膏無明顯皮膚毒性。

3.2 長期毒性實(shí)驗結(jié)果

3.2.1 一般情況：給藥期間，各組大鼠除給藥部位外均未出現(xiàn)肉眼可見的異常，且在給藥至停藥第30日的觀察期間內(nèi)未出現(xiàn)死亡。除基質(zhì)對照組外，其余組大鼠在給藥第1日后出現(xiàn)不同程度的打噴嚏、不安反應(yīng)，并于給藥第5日后消失。給藥后，基質(zhì)對照組3只和復(fù)方薰衣草油膏低劑量組6只、中劑量組3只、高劑量組2只大鼠出現(xiàn)不同程度的皮膚破損、結(jié)痂，其中9只在給藥期間內(nèi)癥狀自行消失，4只在給藥結(jié)束癥狀未消失，1只停藥第30日觀察期結(jié)束時癥狀依然存在。

3.2.2 對體質(zhì)量及進(jìn)食量的影響：(1)給藥期間，各時段各組大鼠體質(zhì)量均值均有所增長；復(fù)方薰衣草油膏低劑量組中，第4、5、11、13周雌性大鼠的體質(zhì)量均值明顯低于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05)；復(fù)方薰衣草油膏中劑量組中，第4、5、14、15周雌性大鼠，第8—13周雄性大鼠的體質(zhì)量均值明顯低于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05)；復(fù)方薰衣草油膏高劑量組中，第4、15周雌性大鼠體質(zhì)量均值明顯低于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。(2)給藥期間，與基質(zhì)對照組比較，復(fù)方薰衣草油膏各劑量組雌性大鼠的進(jìn)食量總體在18～35 g浮動、雄性大鼠在20～38 g浮動；復(fù)方薰衣草油膏低劑量組中，第1、4、5、9周雌性大鼠進(jìn)食量明顯低于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05)，第17周雌性大鼠、第10周雄性大鼠的進(jìn)食量均明顯高于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05、P<0.01)；復(fù)方薰衣草油膏中劑量組中，第5、9周雌性大鼠的進(jìn)食量明顯低于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05)，第10、11周雌性大鼠，第11、12周雄性大鼠的進(jìn)食量均明顯高于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05、P<0.01)；復(fù)方薰衣草油膏高劑量組中，第10、11、14周雌性大鼠，第2、5、6、10—12周雄性大鼠的進(jìn)食量均明顯高于相應(yīng)時段基質(zhì)對照組(P<0.05、P<0.01)。

A.雄鼠；B.雌鼠A.male rats；B.female rats圖1 各組大鼠平均體質(zhì)量增長情況Fig 1 Growth of average body mass of rats for CLO

3.2.3 對血常規(guī)的影響：給藥第92日，與基質(zhì)對照組比較，復(fù)方薰衣草油膏低劑量組雄性大鼠血小板計數(shù)(PLT)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但無量效關(guān)，且仍在正常值范圍內(nèi)，故考慮與給藥無關(guān)。

3.2.4 對血清生化學(xué)的影響：給藥第92日，與基質(zhì)對照組比較，復(fù)方薰衣草油膏中劑量組雄性大鼠UREA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；停藥第30 d，與基質(zhì)對照組比較，復(fù)方薰衣草油膏小劑量組雄性GLU明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但以上指標(biāo)的變化均無量效關(guān)系，且均在正常值范圍，故考慮與給藥無關(guān)。

3.2.5 對大鼠臟器質(zhì)量和系數(shù)的影響：給藥第92日，復(fù)方薰衣草油膏各組雌性大鼠腎臟、子宮質(zhì)量明顯低于基質(zhì)對照組(P<0.05)；復(fù)方薰衣草油膏低劑量組雌性大鼠胸腺臟器系數(shù)明顯高于基質(zhì)對照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。停藥第30 d，復(fù)方薰衣草油膏中劑量組雌性大鼠腎臟臟器系數(shù)明顯高于基質(zhì)對照組(P<0.05)；各組大鼠臟器質(zhì)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但以上指標(biāo)的變化均無量效關(guān)系，且均在正常值范圍，故考慮與給藥無關(guān)。

3.2.6 大體解剖觀察：給藥第92日及停藥第30 d，處死各組大鼠，進(jìn)行大體解剖觀察，均未見肉眼可見的明顯異常。

3.2.7 病理學(xué)檢查：本研究中，給藥期間，基質(zhì)對照組2只雄性大鼠出現(xiàn)皮膚的炎癥反應(yīng)，復(fù)方薰衣草油膏高劑量組大鼠的各臟器組織未發(fā)現(xiàn)與給藥相關(guān)的毒性病理改變；停藥4周后，基質(zhì)對照組與復(fù)方薰衣草油膏高劑量組大鼠均未見蓄積及遲發(fā)性毒性病理改變。

4 討論

長期毒性實(shí)驗中，除基質(zhì)對照組外，復(fù)方薰衣草油膏各組大鼠在給藥后第1日出現(xiàn)不同程度的打噴嚏、不安反應(yīng)，并于給藥后第5日消失，可能是該藥有較濃重的薰衣草香氣，大鼠剛開始無法適應(yīng)所致。給藥期間，基質(zhì)對照組及復(fù)方薰衣草油膏各組共14只大鼠出現(xiàn)不同程度的皮膚破損、結(jié)痂，其中9只在給藥期間癥狀自行消失，4只在給藥結(jié)束后癥狀未消失，1只停藥第30日癥狀依然存在。雖然大鼠在給藥及恢復(fù)期均有皮膚破損癥狀，但在一段時間內(nèi)大部分大鼠均可自行恢復(fù)，且停藥后亦有1只大鼠皮膚破損、結(jié)痂，推測該癥狀與給藥無關(guān)。

給藥期及停藥恢復(fù)期，部分大鼠PLT升高、UREA降低、GLU降低，腎臟、子宮質(zhì)量降低，腎臟臟器系數(shù)、胸腺臟器系數(shù)升高，但以上指標(biāo)的變化均無量效關(guān)系，且均在正常值范圍，故考慮與給藥無關(guān)。

給藥期及停藥恢復(fù)期，復(fù)方薰衣草油膏各組大鼠的體質(zhì)量均值自第4周開始低于基質(zhì)對照組；部分時段的體質(zhì)量與基質(zhì)對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但未呈現(xiàn)出與劑量的相關(guān)性；部分時段的體質(zhì)量均值低于基質(zhì)對照組。可能的原因是：芳香氣味被吸入后，能抑制大腦中的下丘腦，減少饑餓信息的釋放，其中薰衣草能讓人減少對油膩食物的欲望，薄荷能提神醒腦、控制食欲。未見其他血液學(xué)、血生化[14]、臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)、病理學(xué)檢查方面的異常。

綜上所述，在本實(shí)驗條件下，Wistar大鼠皮膚反復(fù)給予不同劑量復(fù)方薰衣草油膏90 d，未見明顯毒性反應(yīng)；復(fù)方薰衣草油膏1.8 g/kg劑量組中，2只大鼠出現(xiàn)皮膚破損(可自行恢復(fù))，該組大鼠平均體質(zhì)量輕微下降，但不顯著，推測非藥物毒性作用所致，因此，認(rèn)為1.8 g/kg為外用安全劑量。另外，急性毒性實(shí)驗也驗證了復(fù)方薰衣草油膏屬無明顯皮膚毒性的外用藥物。

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Study on Acute and Long-term Toxicity of Compound Lavender OintmentΔ

ZHANG Qun1,SUN Yan1,SUN Yuhua2

(1.Dept.of Pharmacy,Ili Kazak Autonomous Prefecture Friendship Hospital,Xinjiang Yining 835000,China; 2.Pharmacology Room,the Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medica,Xinjiang Wulumuqi 830001,China)

OBJECTIVE: To investigate the acute and long-term toxicity of the compound lavender ointment(CLO),so as to provide experimental evidence for its application safety in clinic. METHODS: (1) Acute toxicity. 50 guinea pigs were randomly divided into blank control group,CLO high,medium and low dose group and matrix control group,with 10 cases in each group. Except for blank group,other groups were treated with broken skin treatment,and were respectively given CLO of 1.500,0.750 and 0.375 g/kg and matrix of 4.000 g/kg,and observation was continued for 14 d after dosing. (2) Long-term toxicity. 80 Wistarm rats were randomly divided into matrix control group and CLO high,medium and low dose group,with 20 cases in each(half male and half female),respectively treated with matrix of 6.0 g/kg and CLO of 1.8,0.9 and 0.3 g/kg,with administration on skin,qd,and observation was continued for 92 d after dosing. RESULTS: According to acute toxicity,there was no statistical significance in changes of body mass in 5 groups of guinea pig(P>0.05). During observation,the rats were eating or moving normally,there were no abnormal secretions,no erythema and edema at the administration site,no pigmentation and bleeding,as well as no death. In terms of long-term toxicity test,there were no statistically significant difference among 4 groups in general condition,behavior,food-intake,body weight,peripheral hemogram,routine urine parameters,blood biochemistry,organ index as well as pathologic histology(P>0.05). CONCLUSIONS: The CLO has no obvious toxicity to skin,and no untoward effects for percutaneous drug delivery for 92 d. The maximum safe dose in rats is 1.8 g/kg.

Compound lavender ointment; Acute toxicity; Long term toxicity

新疆自治區(qū)科技支撐計劃項目(No.201433102)

R99

A

1672-2124(2017)08-1028-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.008

2017-04-18)

*主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：924167490@qq.com