傅碧玲，馮朝瑜，朱賽香，鄒世海，彭鑫

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東深圳518101)

氨基胍對乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細(xì)胞損傷及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

傅碧玲，馮朝瑜，朱賽香，鄒世海，彭鑫

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，廣東深圳518101)

目的研究氨基胍(AG)對乳酸鹽腹膜透析液(L-PDS)致人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV5)損傷及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法采用人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停譃闊o血清DMEM培養(yǎng)液對照組、L-PDS組(2.5%L-PDS)、L-PDS+AG組(2.5%L-PDS+10 mmol/LAG)、單純AG組(終濃度10 mmol/L)。各組以上不同干預(yù)因素與HMrSV5細(xì)胞共孵育。MTT法檢測各組細(xì)胞增殖、評估細(xì)胞活力，Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果MTT試驗(yàn)表明，L-PDS組OD值為(0.120±0.019)，明顯低于對照組的(0.298±0.031)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；L-PDS+AG組OD值為(0.289±0.022)，明顯高于L-PDS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot和RT-PCR結(jié)果均表明，與對照組比較，L-PDS組細(xì)胞中VEGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，與L-PDS組比較，PDS+AG組VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)明顯減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細(xì)胞損傷并下調(diào)VEGF的表達(dá)。

氨基胍；乳酸鹽腹膜透析液；人腹膜間皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

持續(xù)不臥床腹膜透析(CAPD)是目前最重要的腎臟替代治療手段之一，其中超濾衰竭是患者退出腹膜透析的重要原因。國內(nèi)外專家均積極探索在使用現(xiàn)有生物不相容性的腹膜透析液條件下防治腹膜透析失超濾的策略。目前國內(nèi)普遍使用的是低pH值、高糖、高滲、含葡萄糖降解產(chǎn)物(GDPs)的以乳酸鹽為緩沖堿的腹膜透析液(PDS)，乳酸鹽作為緩沖堿的缺點(diǎn)之一是降低腹膜間皮細(xì)胞的代謝及存活率，減低腹腔白細(xì)胞功能，使腹腔抵抗微生物入侵能力減弱[1]。同時，此類透析液能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腹膜血管新生，后者與PD超濾衰竭密切相關(guān)[2]。氨基胍(AG)作為糖基化終產(chǎn)物受體(RAGEs)的抑制劑，可以抑制糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的形成。已有試驗(yàn)證實(shí)，在建立的大鼠腹膜透析模型中，PD液中加入AG有助于抑制血管增生[3]。但AG能否抑制腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞損傷及影響細(xì)胞因子VEGF的表達(dá)，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。故本研究以體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞株(HMrSV5)為研究對象，觀察AG對L-PDS致HMrSV5損傷及VEGF表達(dá)的影響。為腹膜超濾衰竭的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基分別購自杭州四季青公司、美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，氨基胍(aminoguanidine，AG)，兔抗GAPDH抗體、小鼠抗人VEGF單抗均購自Sigma公司(美國)；RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV5)的培養(yǎng)使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HMrSV5(中科院上海細(xì)胞庫)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。換液間隔時間為2～3 d，實(shí)驗(yàn)達(dá)標(biāo)要求：細(xì)胞生長融合度達(dá)80%左右。實(shí)驗(yàn)時傳代細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用培養(yǎng)液(含1%小牛血清)進(jìn)行同步培養(yǎng)24 h，大部分細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。

1.2.2 細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)分為以下各組：(1)對照組：無血清DMEM培養(yǎng)液；(2)L-PDS組：含2.5% L-PDS(美國Baxter公司提供)；(3)L-PDS+AG組：含2.5%L-PDS及10 mmol/L AG；(4)單純AG組(終濃度10 mmol/L)。

1.2.3 MTT法檢測HMrSV5的增殖胰酶消化細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/mL，接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種要求為每孔100 μL細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后再用培養(yǎng)液(含1%小牛血清)同步24 h，使大部分細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，每組設(shè)3個重復(fù)孔，各組加入相應(yīng)的處理因素100 μL，分別與HMrSV5作用45～60 min。棄去培養(yǎng)液(處理因素)，PBS洗兩遍，加入5%小牛血清培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，每個培養(yǎng)孔均加入MTT(100 μL)，使其終濃度保持在0.5 mg/mL，調(diào)零組則不加，振蕩然后繼續(xù)孵育4 h。將培養(yǎng)液棄去，每孔加入100 μL DMSO，搖勻大概10 min左右，當(dāng)結(jié)晶被完全溶解后，在Bio-Rad550酶標(biāo)儀上測定各組的平均吸光度值(OD值)，將波長設(shè)定為570 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 免疫印跡(Western-blot)技術(shù)檢測VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以105/孔的密度，細(xì)胞長至80%融合時，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為培養(yǎng)液(1%小牛血清DMEM)，同步24 h后，各組加入相應(yīng)的處理因素2.5 mL，與HMrSV5共孵育60 min。然后將各組細(xì)胞予以收集、裂解，取其上清液，對蛋白濃度進(jìn)行測定，取30 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行配置，要求為配成等體積等量，放置于沸水中予以煮5 min，電泳分離(10%SDS-聚丙烯酰胺)，將蛋白通過電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用5%無脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗孵育雜交過夜，為小鼠抗人VEGF單抗，洗膜后在抗鼠IgG中孵育1 h，其中抗鼠IgG是由過氧化物酶標(biāo)記的；最后結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法以X線片自顯影進(jìn)行顯示。圖像經(jīng)圖像分析軟件Quantity One(BioRad公司)對特異性條帶進(jìn)行灰度掃描分析，求得各組蛋白電泳條帶灰度與內(nèi)參GAPDH的比值，反映為VEGF表達(dá)含量變化，從而半定量比較目的蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測VEGF mRNA的表達(dá)同樣在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將細(xì)胞以105/孔進(jìn)行接種，再細(xì)胞長至80%融合時，對細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行更換分組培養(yǎng)。各組加入相應(yīng)的處理因素2.5 mL，分別與HMrSV5作用60 min后，將各組細(xì)胞予以收集，對細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，擴(kuò)增產(chǎn)物以RT-PCR法得到，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳及分析：凝膠在UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描以對結(jié)果進(jìn)行觀察、拍照，對電泳帶灰度進(jìn)行分析，計(jì)算VEGF mRNA相對表達(dá)量也就是VEGF mRNA特異性擴(kuò)增帶灰度/內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增帶灰度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞增殖的影響L-PDS組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；L-PDS+AG組OD值明顯高于L-PDS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞增殖的影響

表1AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞增殖的影響

注：與對照組比較，aP＜0.01；與L-PDS組比較，bP＜0.01。

組別OD值對照組L-PDS組L-PDS+AG組單純AG組F值P值0.298±0.031 0.120±0.019a0.289±0.022b0.302±0.028 289.200＜0.01

2.2 AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，L-PDS組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.62，P＜0.05)；而單純AG組沒有顯著影響細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)(t=0.75，P＞0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 5.17，P＜0.05)，見圖1。

2.3 AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響與對照組比較，L-PDS組細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 4.91，P＜0.05)；而單純AG組，沒有影響細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)(t=0.71，P＞0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF mRNA的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.09，P＜0.05)，見圖2。

圖1 四組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的情況

圖2 四組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的情況

3 討論

在我國，血液透析(HD)和腹膜透析(PD)是終末期腎臟病(ESRD)患者腎臟替代治療的兩種主要方式。隨著國家政策的扶持，PD技術(shù)的推廣，PD患者生存期的延長，腹膜透析液(PDS)的非生物相容性問題日益凸顯。血液透析有多種透析器可供選擇，且為一次性使用，不再復(fù)用。而腹膜透析利用的是生物膜，無可替代或轉(zhuǎn)換，腹膜持續(xù)或重復(fù)地暴露于非生物相容性的透析液，更易于損傷。

目前普遍使用的仍然是以乳酸鹽為載體的高糖、高滲、低pH、含葡萄糖降解產(chǎn)物(GDPs)的透析液。pH中性、低GDPS的新型PDF雖具有更好的生物相容性、可減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)腹膜功能、有更好的超濾能力和代謝效益，但對減少腹膜炎的發(fā)生、提高遠(yuǎn)期技術(shù)存活效率和生存率方面待更大樣本的RCT證實(shí)[4]，且較昂貴，我國尚未能推廣使用。故在現(xiàn)有乳酸鹽腹膜透析液的條件下，仍需要積極探索防治腹膜透析超濾衰竭的方法，減少PD患者的退出。腹膜透析超濾衰竭與腹膜血管新生、間皮細(xì)胞損傷以及腹膜的纖維化等因素密切相關(guān)。

乳酸鹽腹膜透析液可使腹膜間皮細(xì)胞活力下降、損傷，細(xì)胞因子(VEGF)表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞損傷、腹膜血管新生。VEGF通過活化間皮細(xì)胞的RAGEs刺激血管的形成[5]，并可通過與一氧化氮合酶(NOS)同工酶的反應(yīng)使毛細(xì)血管通透性增加[6]。RAGEs的阻斷劑，可以干預(yù)上述進(jìn)程。在大鼠腹膜透析模型的體內(nèi)試驗(yàn)中證實(shí)，AG(RAGEs的阻斷劑)有助于抑制血管增生[3]。

本研究使用MTT法觀察不同干預(yù)因素對HMrSV5細(xì)胞增殖的影響。L-PDS對于體外培養(yǎng)的HMrSV5增殖具有明顯抑制作用。與對照組比較，L-PDS組OD值明顯減小(P＜0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組OD值明顯增大，說明AG對L-PDS誘導(dǎo)的HMrSV5損傷具有一定保護(hù)作用。因此，本研究為運(yùn)用AG對抗乳酸鹽PDF對腹膜間皮細(xì)胞損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Western blot和RT-PCR結(jié)果分別從蛋白及mRNA水平證實(shí)，與對照組比較，L-PDS組細(xì)胞中VEGF蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05)；與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)明顯減低(P＜0.05)，說明AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞VEGF的表達(dá)。VEGF是促進(jìn)血管新生的主要因素和始動因子。VEGF在腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)不斷增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)形成新生血管，增加了腹膜對小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，加快了透析液葡萄糖的吸收，減弱了跨膜滲透壓梯度，最終使超濾減少甚至引起超濾能力喪失。動物模型中，與使用傳統(tǒng)乳酸鹽PDF組比較，使用中性的、低GDP含量(neutral pH，low-GDP，NpHLGDP)的PDS組，其流出液的VEGF水平、VEGF染色、血管新生等明顯降低[7]。腹膜間皮細(xì)胞可能受到前炎癥因子和AGEs影響，而非葡萄糖本身的刺激從而產(chǎn)生(合成)VEGF[8]。AG具有抑制NOS活性和AGEs形成的作用，可以顯著降解GDPs以及明顯抑制L-PDS所致的AGEs堆積。本研究在體外試驗(yàn)證實(shí)，AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞VEGF過表達(dá)。為運(yùn)用AG對抗L-PDS對腹膜間皮VEGF表達(dá)上調(diào)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細(xì)胞損傷并下調(diào)VEGF的表達(dá)，可能與其阻斷了RAGE受體通路有關(guān)。

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Effect of aminoguanidine on damage in human peritoneal mesothelial HMrSV5 cells caused by lactate peritoneal dialysis solution andexpression of VEGF.

FU Bi-ling,FENG Zhao-yu,ZHU Sai-xiang,ZOU Shi-hai,PENG Xin. Department of Nephrology,Shenzhen Baoan District People's Hospital,Shenzhen 518101,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of aminoguanidine(AG)on damage in human peritoneal mesothelial cells(HMrSV5)caused by lactate peritoneal dialysis solution(L-PDS)and expression of vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsDepending on the culture of the cell,the cultured HMrSV5 cells were divided to control group(cultured in DMEM),L-PDS group(2.5%L-PDS),L-PDS+AG group(2.5%L-PDS+10 mmol/LAG),and AG group(at a final concentration of 10 mmol/L).MTT assay was used to assess the viability and proliferation of the cells. VEGF protein was determined by western blot,and VEGF mRNA was determined by RT-PCR.ResultsThe optical density(OD)value in L-PDS group was(0.120±0.019),significantly lower than(0.298±0.031)in the control group(P＜0.05).The OD value in L-PDS+AG group was(0.289±0.022),which was significantly higher than that in L-PDS group (P＜0.05).Expression of VEGF protein and mRNA increased significantly in L-PDS group as compared with those in control group(P＜0.05),while the expression decreased significantly in PDS+AG group as compared with those in L-PDS group(P＜0.05).ConclusionAG can antagonize the injury of HMrSV5 caused by L-PDS and down-regulate the expression of VEGF.

Aminoguanidine(AG);Lactate peritoneal dialysis solution(L-PDS);Human peritoneal mesothelial cells(HMrSV5);Vascular endothelial growth factor(VEGF)

R459.5

A

1003—6350（2017）14—2251—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.005

2017-04-05)

廣東省深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃社會公益項(xiàng)目(編號：2013027)

傅碧玲。E-mail：13226686502@139.com