曹宇，董文亮，劉亮，蔡相軍

（中國人民解放軍第202醫(yī)院普外科，沈陽110003）

骨膜蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義

曹宇，董文亮，劉亮，蔡相軍

（中國人民解放軍第202醫(yī)院普外科，沈陽110003）

目的探討骨膜蛋白（PN）在乳腺癌組織及癌旁組織的表達及臨床意義。方法選取臨床確診為乳腺癌的女性患者50例，采用免疫組化二步法，測定不同年齡、TNM分期、SBR分級、病理類型、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素下，乳腺癌及癌旁組織中PN的高表達陽性率，并與正常乳腺組織中PN的表達進行比較。結(jié)果PN在乳腺癌及癌旁組織間質(zhì)中表達，并隨著TNM分期（P=0.024）、SBR分級（P=0.012）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.035）的變化，PN高表達陽性率升高；年齡、病理類型與PN的高表達陽性率無明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)論乳腺癌中PN的高表達陽性率與TNM分期、SBR分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且參與乳腺癌的病理進展過程，PN可能成為潛在的乳腺癌監(jiān)測指標。

乳腺癌；免疫組化；骨膜蛋白

乳腺癌是比較常見的女性惡性腫瘤，隨著自然和社會環(huán)境的不斷變化，其發(fā)病率有逐年上升趨勢，已成為危害現(xiàn)代女性健康的主要惡性腫瘤之一。腫瘤的發(fā)生受多種因素影響，骨膜蛋白（periostin，PN）是近10年來發(fā)現(xiàn)的影響因素之一。PN最早是TAKCSHITA等［1］在鼠成骨細胞系的cDNA文庫中通過減法雜交和微分篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定的一種新型骨膜素分子，主要由成骨細胞及其前體分泌產(chǎn)生，在骨形成中起重要作用，被稱為成骨細胞特異性因子2。由于它在骨膜和牙周韌帶的定位表達及在骨和牙齒的形成和結(jié)構(gòu)維持中扮演重要角色，故被命名為“骨膜蛋白”。TILMAN等［2］發(fā)現(xiàn)PN在人體多種正常組織中表達，其表達量可能與組織纖維原細胞數(shù)量呈正相關(guān)，如人外周血和脾臟極低表達，唾液腺和胸腺低表達，皮膚、乳腺和卵巢高表達且波動顯著，而胰腺、肝臟、淋巴結(jié)、肺、結(jié)腸等組織表達較均勻。在功能上，PN不僅參與骨、牙齒、心臟等組織的形成與結(jié)構(gòu)的維持，還在體內(nèi)機械應(yīng)力增加時，獲得性地高表達于富含膠原纖維的結(jié)締組織，促進組織損傷修復(fù)與重塑，參與人體的病理、生理過程［3］。近年來的研究［4］表明，PN在多種腫瘤中也表達，尤其是在腫瘤間質(zhì)中表達，與其在正常組織中表達有顯著差異，被認為與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究［5］發(fā)現(xiàn)PN可預(yù)測食管癌的預(yù)后，并促進食管癌侵蝕，而且IZUHARA等［6］在肺部病理實驗中發(fā)現(xiàn)，PN作為外周血中的標志物可以反映治療與疾病的進展。國內(nèi)外研究己表明多種惡性腫瘤患者血清中有PN的表達，且其水平與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率及存活率等相關(guān)。本研究的目的是探討PN在乳腺癌中的表達和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取我院2014年至2015年臨床確診為乳腺癌的50例女性患者的手術(shù)切除組織標本，選取癌組織、癌旁組織（距離癌組織3～5 cm以上）及淋巴組織，進行蠟塊包埋、切片。全部病例在診斷明確前均未進行化療、放療等治療。患者年齡為30～65歲，平均年齡42.5歲。其中病理診斷為浸潤性導(dǎo)管癌11例，黏液癌3例，導(dǎo)管內(nèi)癌12例，Paget病伴低級別導(dǎo)管內(nèi)癌5例，小葉癌6例，混合性（導(dǎo)管內(nèi)癌及小葉癌）13例。選取癌旁組織及淋巴結(jié)均無轉(zhuǎn)移的30例乳腺癌患者作為陰性對照。

1.2 試劑

一抗選用兔多克隆抗體PN，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，適用于免疫組化的濃度為1∶100～1∶1 000，本研究選取的濃度為1∶1 000。二抗為Ultra-SensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠/兔），購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色：石蠟切片脫蠟和水化后，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3 min。切片滴加1滴或者50 μL過氧化物酶阻斷溶液，室溫10 min，以阻斷過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min?？乖迯?fù)。切片浸入枸櫞酸緩沖液中，放入高壓鍋中，達最大壓強2.5 min，之后高壓鍋放入水池沖淋，沖涼后取出，自然冷卻到室溫10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。切片滴加山羊血清后，至于封閉盒中20 min。去除血清后，滴加一抗4℃過夜。復(fù)溫20 min后，去除一抗，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加二抗置于封閉盒中15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加三抗置于封閉盒中15 min，PBS沖洗4次，每次5 min。去除PBS，滴加DAB，顯微鏡觀察3 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍。梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.2 陽性判定標準：以顯色位置中電鏡下所見藍色染顆粒為準，強度超過背景內(nèi)的非特異著色則標記陽性。任意選擇5個400倍視野，并且任意抽取100個細胞進行觀察。評估陽性表達個數(shù)占全部數(shù)量的比率以及染色程度。采用經(jīng)典的染色強度與陽性細胞數(shù)比值雙評分相乘法進行最終評定，并將最終評級作為統(tǒng)計學(xué)分析的依據(jù)。染色程度評分：基本不著色為0分，淡藍色為1分，藍色為2分，深藍色為3分。陽性細胞個數(shù)比值評分：染色細胞個數(shù)占總細胞個數(shù)比值≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。以染色程度評分與陽性個數(shù)比值評分相乘后的分數(shù)為依據(jù)進行分級判定：≤3分為陰性（-），4～5分為弱陽性（+），6～7分為陽性（++），＞8分為強陽性（+++）。（-）～（+）為低表達，（++）～（+++）為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PN蛋白在不同年齡乳腺癌患者中的表達

50例患者根據(jù)年齡分為＞50歲組和≤50歲組，＞50歲組PN蛋白的高表達陽性率為87.0%（20/23），≤50歲組PN蛋白的高表達陽性率為85.2%（23/27），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.032，P＞0.05）。見表1。

2.2 PN蛋白在不同TNM分期乳腺癌患者中的表達

隨著TNM分期的不斷增高，PN蛋白在乳腺癌癌細胞間質(zhì)中的表達明顯增高，其中T1期、T2期PN蛋白的高表達陽性率為73.9%（17/23），T3期PN蛋白的高表達陽性率為96.3%（26/27），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.065，P＜0.05）。見圖1、表1。

2.3 PN蛋白在不同SBR分級乳腺癌患者癌組織中的表達

SBR分級為Ⅰ、Ⅱ級（高分化）時PN蛋白的高表達陽性率為71.4%（15/21），SBR分級為Ⅲ級（低分化）時PN蛋白的高表達陽性率為96.6%（28/29），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.257，P＜0.05）。見表1。

2.4 PN蛋白在不同病理類型乳腺癌患者組織中的表達

在不同的病理分型中，PN蛋白在癌及癌旁組織的高表達陽性率也不同。PN蛋白在黏液腺癌中的高表達陽性率為33.3%，在導(dǎo)管癌中的高表達陽性率為91.7%，在浸潤性導(dǎo)管癌中的高表達陽性率為81.8%，在乳頭濕疹樣癌中的高表達陽性率為100.0%，在小葉癌和混合性癌中的高表達陽性率分別為82.3%和92.3%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.670，P＞0.05）。見表1。

圖1 PN在不同TNM分期的乳腺癌及其癌旁組織中的表達×400Fig.1 Expression of PN in breast cancer of various TNM stages and adjacent tissue×400

表1 乳腺癌中PN的表達與臨床因素之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression of periostin and clinical factors in breast cancer

2.5 PN蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中的表達

50例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PN蛋白的高表達陽性率為93.8%（30/32），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PN蛋白的高表達陽性率為72.2%（13/18），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.434，P＜0.05）。見表1。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)PN在乳腺癌中的高表達與其臨床分期、細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，這一結(jié)果與RATAJCZAK-WIELGOMAS等［7］的研究結(jié)果相似，其研究報道乳腺癌中PN的高表達與腫瘤惡性程度相關(guān)。本研究中免疫組化結(jié)果證實，PN主要表達于乳腺癌細胞的間質(zhì)中，在癌細胞的胞膜及胞質(zhì)中表達為陰性，但在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中有少量的PN表達。這提示在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中PN的表達具有某種生物學(xué)作用，可能參與了乳腺腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移病理過程。在動物實驗中，WANG等［8］在小鼠實驗中證實，去除小鼠PN mRNA后，缺少PN表達的腫瘤細胞其FAK和Akt/PKB信號通路激活減少，并出現(xiàn)腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移減緩的現(xiàn)象，并由此推斷PN可能是乳腺癌轉(zhuǎn)移不可或缺的因子。KYUTOKU等［9］在深入研究PN結(jié)構(gòu)及其搭載的外顯子后，在小鼠內(nèi)體內(nèi)注入抗PN和其抗外顯子編碼的肽，結(jié)果顯著抑制了小鼠乳腺癌細胞的增殖、遷移和入侵。而在人類細胞研究中，WANG等［10］也進一步證實，PN可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進人類乳腺上皮細胞向乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)化，抗PN的治療可以延緩乳腺癌病理的發(fā)展，使其成為一種潛在的靶點。因此有理由推斷，高表達的PN參與乳腺癌的病理過程，并為其提供適合腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。

FIELD、ISHIBA等［11-12］的研究證明，PN可以通過整合素αvβ3激活A(yù)kt/PKB通路促進腫瘤細胞的運動和入侵，使得PN在乳腺癌細胞中高表達，誘導(dǎo)正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，并在動物實驗中對比人表皮生長因子受體2后發(fā)現(xiàn)，PN的表達不僅可以監(jiān)測腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，還可以監(jiān)測人表皮生長因子受體2的狀態(tài)。血液檢測也有類似的發(fā)現(xiàn)，NUZZO等［13］發(fā)現(xiàn)血清中PN的水平與癌癥死亡率之間有特異相關(guān)性。因此，PN可能成為潛在的臨床乳腺癌監(jiān)測指標。

綜上所述，PN主要在乳腺癌細胞的間質(zhì)中表達，并參與乳腺癌的病理過程，具有一定的生物學(xué)作用，其高表達陽性率與乳腺癌的TNM分期、SBR分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為一種潛在的乳腺癌監(jiān)測指標。

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（編輯陳姜）

Expression and Clinical Significance of Periostin in Breast Cancer

CAO Yu，DONG Wenliang，LIU Liang，CAI Xiangjun

（Department of General Surgery，Chinese People’s Liberation Army 202 Hospital，Shenyang 110003，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of periostin（PN）in breast cancer and its adjacent tissues.Methods We evaluated 50 women with breast cancer.We determined PN expression by immunohistochemistry and analyzed positive expression in the tumors and adjacent tissue by patient age，TNM stage，SBR type，pathological type，lymph node metastasis，and other factors.Results PN expression in breast cancer and cancer adjacent tissues was associated with an increase in TNM staging（P=0.024），SBR type（P=0.012），and lymphatic metastasis（P=0.035）.However，there was no significant correlation between age or pathological type（P＞0.05）.Conclusion Expression of PN in breast cancer is associated with TNM staging，SBR type，and lymph node metastasis，and is involved in the pathological progression of breast cancer.PN may be a potential prognostic marker for breast cancer.

breast cancer；immunohistochemistry；periostin

R737.9

A

0258-4646（2017）07-0628-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.012

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2013225089）

曹宇（1987-），男，醫(yī)師，碩士.

蔡相軍，E-mail：caixiangjun61@126.com

2017-01-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：