劉曉穎，姚俊潔，劉文

（大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.老年醫(yī)學科；2.內(nèi)分泌科，遼寧大連116011）

白藜蘆醇對鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用

劉曉穎1，姚俊潔2，劉文1

（大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.老年醫(yī)學科；2.內(nèi)分泌科，遼寧大連116011）

目的探討白藜蘆醇在鏈脲霉素（STZ）誘導的糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用機制。方法通過STZ誘導糖尿病大鼠模型，預先腹腔內(nèi)注射白藜蘆醇（40 mg/kg）。在注射白藜蘆醇前和注射后1～4周對大鼠進行機械、冷和熱痛覺過敏刺激，同時檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中TRPA1和TRPM8的表達。結果白藜蘆醇能明顯抑制STZ引起的機械和冷痛覺過敏，但是對熱痛覺過敏沒有作用。STZ注射增加大鼠DRG神經(jīng)元中TRPM8的表達（P＜0.05），但不影響TRPA1的表達（P＞0.05）。白藜蘆醇能降低STZ引起的DRG神經(jīng)元中的TRPM8表達水平（P＜0.05）。結論白藜蘆醇對STZ引起的糖尿病大鼠有抗痛覺超敏作用，可能與DRG中的TRPM8表達相關。

白藜蘆醇；鏈脲霉素；糖尿?。淮笫?；神經(jīng)病理性疼痛

在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛是最常見的癥狀［1］。然而卻沒有一種有效的治療長期持續(xù)慢性疼痛的方法。系統(tǒng)性注射鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）對胰島β細胞有細胞毒性［2］，STZ誘導Ⅰ型糖尿病是一種研究糖尿病病理模型。白藜蘆醇（3，5，4’-trihydroxystilbene，resvera-trol）是一種天然多酚化合物，主要來源于花生、葡萄（紅葡萄酒）、虎杖、桑椹等植物。白藜蘆醇主要用于預防心血管疾病和癌癥，具有抗衰老作用［3-4］。近期有研究［5-7］報道白藜蘆醇能夠減輕神經(jīng)病理性疼痛。有研究［8］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過激活脊髓中的去乙?；?（sirtuin-1，SIRT1）降低神經(jīng)病理性疼痛。本研究通過STZ誘導建立糖尿病大鼠模型，探討白藜蘆醇對糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

21只SD大鼠（180～200 g，雄性）購于大連醫(yī)科大學實驗動物中心，室溫飼養(yǎng)，12 h照明/12 h黑暗，水與鼠糧自由飲用。動物在實驗前至少要適應實驗室環(huán)境2 h。動物使用遵照大連醫(yī)科大學動物管理委員會要求。將大鼠隨機均分為3組：正常組（腹腔注射生理鹽水）、STZ組［腹腔注射STZ（60 mg/kg）］、白藜蘆醇+STZ組［腹腔注射STZ（60 mg/kg），30 min后腹腔注射白藜蘆醇（40 mg/kg），RS組］。

1.2 糖尿病大鼠模型建立

使用生理鹽水配置STZ溶液，按照60 mg/kg劑量腹腔注射大鼠。每周稱量體質(zhì)量，取大鼠尾靜脈血，使用血糖儀（HEA-214，美國OMRON公司）測量大鼠血糖。血糖濃度＞240 mg/dL收入組，認為造模成功。

1.3 大鼠行為學測試

在大鼠STZ注射前及注射后1～4周進行行為學實驗。

1.3.1 機械痛敏反應：檢測大鼠左后足對Von Frey絲（直徑200 μm）刺激的縮足反應，使用機械縮足閾值衡量機械痛敏反應。大鼠放置在一個10 cm×10 cm×15 cm的透明玻璃屋中，底部是金屬網(wǎng)（0.5 cm× 0.5 cm）。當大鼠適應環(huán)境30 min后，采用電子Von Frey測痛儀測定。用Von Frey絲垂直刺激大鼠足底，逐漸增加刺激的強度，當大鼠后足突然縮足、揚足或舔足反應為陽性，每次刺激間隔10 min，每只大鼠重復測量5次。取5次平均值作為縮足反射機械刺激閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。

1.3.2 熱超敏反應：用后足熱縮腿閾值（the paw thermal withdrawal latency，PWL）來測量熱超敏。將大鼠單獨放置于底部為0.22 mm玻璃的透明籠（20 cm×20 cm×40 cm）中，在安靜環(huán)境下適應30 min后，使用熱輻射疼痛刺激器（BME-410C，天津伯爾尼科技有限公司）照射大鼠后足底，大鼠產(chǎn)生縮足、揚足或舔足反應為陽性停止照射，記錄照射持續(xù)時間為縮足反射熱輻射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。每只大鼠重復測量5次，間隔＞5 min，取平均值作為PWTL。為避免給大鼠足底皮膚造成損傷，設置最高閾值為20 s。

1.3.3 冷刺激反應：使用丙酮法，將一滴丙酮輕輕滴于大鼠左后足。一共進行5次，每次間隔5 min。大鼠對丙酮刺激所產(chǎn)生的快速縮腿反應作為陽性結果。計算縮腿反應的次數(shù)。＞2次認為大鼠對冷痛覺過敏。

1.4 Western blotting檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元中TRPA1、TRPM8表達

所有蛋白取自大鼠L4和L5的DRG。每個樣品總蛋白30 μg，使用10%的SDS-PAGE進行電泳，在4℃轉(zhuǎn)膜到PVDF上，經(jīng)過3次TBST（20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，0.15 mol/L NaCl，0.05%Tween-20）沖洗，用含10%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，然后分別一抗TRPA（1∶1 000，美國Abcam公司）和TRPM8（1∶1 000，美國Abcam公司）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，使用發(fā)光試劑盒（英國ECL kit公司）進行信號檢測。所有實驗使用等量蛋白進行β-actin（1∶1 000，美國Sigma公司）檢測。TRPA1、TRPM8和βactin的特異性信號用Image J（美國NIH公司）軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠行為學結果比較

結果顯示，大鼠在進行藥物注射前對機械刺激的縮腿反射基礎閾值是21.5 g。注射STZ后，STZ組大鼠的機械縮腿閾值明顯高于正常組（P＜0.05），并表現(xiàn)為時間依賴性。RS組大鼠的機械縮腿閾值1～4周分別為20.5 g、19 g、19.5 g、20 g。RS組與STZ組比較，STZ組大鼠2～4周的機械縮腿閾值明顯減少（P＜0.05）。在注射STZ前30 min，腹腔注射40 mg/kg白藜蘆醇能夠明顯抑制STZ所引起的機械痛覺過敏。見圖1A。熱刺激反應結果顯示，與正常組比較，STZ組大鼠2～4周對熱刺激的縮腿反射時間明顯減少（P＜0.01）。RS組大鼠的熱刺激的縮腿反射時間1～4周分別為12 s、6 s、5 s、7 s。RS組與正常組比較，RS組大鼠2～4周的熱刺激的縮腿反射時間縮短（P＜0.01）。腹腔注射白藜蘆醇不能改變STZ引起的熱痛覺過敏（圖1B）。冷刺激反應結果顯示，與正常組比較，STZ組大鼠1周后對冷刺激的縮腿反射次數(shù)明顯增加（P＜0.05），持續(xù)到第4周。RS組與STZ組比較，RS組大鼠2～4周對冷刺激的縮腿反射次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。大鼠腹腔注射白藜蘆醇能明顯抑制STZ引起的冷痛覺過敏（圖1C）。

2.2 大鼠DRG中TRPA1和TRPM8蛋白的表達

結果顯示，注射STZ對大鼠DRG中TRPA1蛋白的表達沒有影響，TRPM8蛋白表達在4周后明顯增加，提前注射白藜蘆醇能夠抑制TRPM8蛋白表達，見圖2。

圖1 各組大鼠對機械與溫度刺激所產(chǎn)生的縮足反應比較Fig.1 Com parison o f the w ithd rawal response to m echanical and therm al stimu li in STZ-induced diabetic rats

圖2 各組大鼠DRG中TRPA1和TRPM8蛋白表達比較Fig.2 TRPA1 and TRPM 8 protein expression levels in the dorsal root ganglia of rats

3 討論

白藜蘆醇能夠減輕神經(jīng)病理性疼痛［5-7］，但是關于其對機械痛敏與溫度痛敏的研究并不多見。TRPA1與TRPM8都是能夠被冷溫度激活的瞬間受體電位離子通道。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，STZ會引起大鼠對機械與溫度的痛覺異常。通過提前注射白藜蘆醇能夠抑制機械與冷痛覺異常，而對熱痛覺異常沒有作用。REGE等［3］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過對細胞內(nèi)的氧化應激反應進行調(diào)控，從而對阿爾茲海默小鼠起到神經(jīng)保護作用。因此，白藜蘆醇有可能在DRG的神經(jīng)元細胞中具有相似的功能，調(diào)控氧化應激反應，從而保護DRG中的神經(jīng)元細胞，防止神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。

白藜蘆醇通過降低NF-κBp65乙?；軌蚓徑釲5神經(jīng)結扎大鼠的神經(jīng)病理性疼痛［9］。白藜蘆醇通過抑制MIF/ERK信號通路治療Ⅰ型復雜性區(qū)域疼痛綜合征［10］。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗動脈硬化和抗心律失常的作用。本研究結果顯示，STZ注射可以引起大鼠DRG中TRPM8蛋白的表達增加，但是不影響TRPA1蛋白的表達。白藜蘆醇有可能通過增加TRPM8蛋白的表達，從而調(diào)控下游的信號通路，引起ERK-κBp65的磷酸化，發(fā)揮緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用，這與以往研究［9-10］結果一致。

綜上所述，白藜蘆醇能夠減輕STZ所引起的糖尿病機械痛與冷痛敏感，但對STZ所引起的糖尿病熱痛沒有作用。白藜蘆醇能夠作用TRPM8通道，緩解糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛，本實驗為臨床糖尿病患者治療疼痛提供了一個新的作用靶點，有可能指導臨床用于緩解糖尿病患者的疼痛。

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（編輯武玉欣）

Effects of Resveratrol on Streptozotocin-induced Diabetic Neuropathic Pain in Rats

LIU Xiaoying1，YAO Junjie2，LIU Wen1

（1.Department of Geriatric Medicine，The First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China；2.Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

Objective To investigate the effects of resveratrol on diabetic neuropathic pain induced by streptozotocin（STZ）in rats.Methods The subjects were pretreated with resveratrol（40 mg/kg）intraperitoneally，30 min before an intraperitoneal injection of STZ（60 mg/kg）. Mechanical and cold allodynia were tested before and 1 to 4 weeks after the drug administration.Thermal hyperalgesia was also investigated.In addition，the transient receptor potential（TRP）Ankyrin 1（TRPA1）and TRP melastatin 8（TRPM8）expression levels in the dorsal root ganglia（DRG）were evaluated.Results Pretreatment with resveratrol significantly inhibited STZ-induced mechanical and cold allodynia，but not thermal hyperalgesia.The STZ injection increased TRPM8 expression levels（P＜0.05），but not TRPA1（P＞0.05）expression levels，in the DRG. Pretreatment with resveratrol decreased STZ-induced TRPM8 expression levels in the DRG（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrated that pretreatment with resveratrol had strong anti-allodynic effects in STZ-induced diabetic rats，which might be associated with TRPM8 located in the DRG.

resveratrol；streptozotocin；diabetics；rat；neuropathic pain

R587.1

A

0258-4646（2017）07-0591-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.004

國家自然科學基金（81300671）

劉曉穎（1981-），女，主治醫(yī)師，碩士.

劉文，E-mail：liuwen197701@163.com

2016-12-12

網(wǎng)絡出版時間：