王聰，陶維晨，李琦，吳澤揚(yáng)，郭鎮(zhèn)豪，趙敏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽(yáng)110004）

純化兔血清對(duì)氧磷酶1與傳統(tǒng)方法對(duì)敵敵畏所致大鼠肝臟損傷的療效比較

王聰，陶維晨，李琦，吳澤揚(yáng)，郭鎮(zhèn)豪，趙敏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽(yáng)110004）

目的探討純化兔血清對(duì)氧磷酶1（PON1）對(duì)敵敵畏中毒大鼠肝損傷的療效是否優(yōu)于傳統(tǒng)方法。方法將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組（A組）、敵敵畏染毒組（B組）、傳統(tǒng)治療組（C組）、PON1治療組（D組）、聯(lián)合治療組（E組），每組6只。B、C、D、E組均給予敵敵畏（9 mg/kg）腹腔注射染毒，C組在染毒后立即（＜2 min）給予阿托品（10 mg/kg）+碘解磷定（45 mg/kg）腹腔注射，D組在染毒前30 min給予PON1 9 600 U/kg尾靜脈注射，E組染毒前30 min給予PON1 9 600 U/kg尾靜脈注射，染毒后立即（＜2 min）給予阿托品（10 mg/kg）+碘解磷定（45 mg/kg）腹腔注射，A組給予等量的生理鹽水對(duì)照。各組于造模前（0 min）、造模后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h分別頸內(nèi)動(dòng)脈取血，運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)血清乙酰膽堿酯酶活性。各組分別于造模后12 h取肝臟組織，HE染色觀察不同組肝臟的病理改變，運(yùn)用免疫組化及Western blotting檢測(cè)不同組肝臟4-羥基壬烯醛（4-HNE）的定性及定量表達(dá)。結(jié)果B組膽堿酯酶明顯下降，光鏡下出現(xiàn)肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變、核固縮等病理改變，可見(jiàn)4-HNE高度表達(dá)；C、D、E組上述各指標(biāo)改變均較B組輕，且各組與B組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；D、E組病理改變較C組輕，上述指標(biāo)與C組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；E組較D組病理改變稍輕，上述指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論P(yáng)ON1對(duì)急性敵敵畏中毒大鼠肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)治療。

對(duì)氧磷酶1；敵敵畏中毒；肝損傷；氧化應(yīng)激；4-羥基壬烯醛

農(nóng)藥中毒是目前關(guān)乎全球人類健康的重要問(wèn)題。在過(guò)去30年里，每年均有成千上萬(wàn)人死于農(nóng)藥中毒，據(jù)統(tǒng)計(jì)有機(jī)磷中毒所致死亡率占據(jù)其中的首位［1］。有機(jī)磷農(nóng)藥既可以直接通過(guò)消化道、呼吸道、黏膜等吸收損傷肝臟，也可以通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化以及改變抗氧化酶的活性導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生肝臟毒性，進(jìn)而可出現(xiàn)肝功能紊亂、肝功能衰竭，甚至導(dǎo)致死亡［2］。傳統(tǒng)的有機(jī)磷中毒治療方法是聯(lián)合阿托品及解磷定對(duì)癥治療，無(wú)法真正清除有機(jī)磷毒物以及減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）是由肝臟產(chǎn)生的一種能夠特效水解有機(jī)磷的生物酶，它被認(rèn)為是最有前途預(yù)防和治療有機(jī)磷中毒的酶類［3］。本研究通過(guò)建立急性敵敵畏中毒大鼠肝損傷模型，觀察PON1對(duì)于敵敵畏中毒肝損傷是否有保護(hù)作用及其可能的保護(hù)機(jī)制，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量300～400 g，購(gòu)自北京華阜康有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2014-0004，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑：77.5%敵敵畏乳油（河南省春光農(nóng)化有限公司），膽堿酯酶（AChE）試劑盒（南京建成生物工程研究所），4-羥基壬烯醛（4-hydroxy 2-nonenal，4-HNE）兔抗鼠多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔SP檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），純化的兔血清PON1（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院代提純）等。

1.1.3 儀器：圖像采集軟件（NIS-Elements F3.0），圖像分析軟件（NIS-Elements BR3.0），顯微鏡（NikonE800）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立：將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（A）組、敵敵畏染毒（B）組、傳統(tǒng)治療（C）組、PON1治療（D）組、聯(lián)合治療（E）組，每組6只。B組給予敵敵畏9 mg/kg腹腔注射；C組給予敵敵畏9 mg/kg腹腔注射，后立即（＜2 min）給予阿托品（10 mg/kg）+碘解磷定（45 mg/kg）腹腔注射；D組給予PON1 9 600 U/kg尾靜脈注射30 min后，敵敵畏9 mg/kg腹腔注射；E組給予PON1 9 600 U/kg尾靜脈注射30 min后，敵敵畏9 mg/kg腹腔注射，隨后立即（＜2 min）給予阿托品（10 mg/kg）+碘解磷定（45 mg/kg）腹腔注射；A組給予等量的生理鹽水對(duì)照。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè)：5組分別于造模前（0 min）、造模后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h于頸內(nèi)動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，取血清，-80℃保存待測(cè)。各組分別于造模后12 h取肝臟左葉小塊肝臟組織（約1 cm×1 cm×0.5 cm），4%多聚甲醛固定待測(cè)。

1.2.3 記錄各組大鼠的中毒癥狀以及評(píng)分：中毒癥狀包括毒蕈堿樣（M樣）癥狀，流涎、大小便失禁、氣促；煙堿樣（N樣）癥狀，肌束顫動(dòng)、肌無(wú)力；中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（CNS癥狀），煩躁不安、共濟(jì)失調(diào)、昏迷。其中肌束震顫評(píng)分參考Bleeckler標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。0分，無(wú)肌束震顫；1分，口周肌肉出現(xiàn)震顫，其他肌肉偶見(jiàn)震顫；2分，腹肌、后肢肌多處出現(xiàn)震顫；3分，腹肌、后肢肌頻繁出現(xiàn)多發(fā)性震顫。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)：取頸內(nèi)動(dòng)脈血離心后，取上清液，按照膽堿酯酶試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清乙酰膽堿酯酶的活力。

1.2.5 肝臟HE染色：取肝臟左葉小塊組織，行組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木素、伊紅染色，樹(shù)膠封片，光鏡下觀察病理改變。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)4-HNE在肝臟中的表達(dá)：取肝臟左葉小塊組織進(jìn)行固定、脫水、透明、包埋、切片，二甲苯脫蠟，微波爐熱修復(fù)，過(guò)氧化氫孵育，血清封閉，加入兔抗大鼠4-HNE抗體，4℃過(guò)夜，加二抗孵育，DAB顯色，染色后封片光鏡觀察，每張切片隨機(jī)挑選4個(gè)視野，以平均吸光度表示4-HNE的表達(dá)水平。

1.2.7 Western blotting觀察4-HNE在肝臟中的表達(dá)：肝組織經(jīng)充分研磨、裂解、離心后，取上清液測(cè)蛋白濃度，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，封閉洗滌后與兔抗大鼠4-HNE抗體，4℃過(guò)夜，加二抗孵育，發(fā)光，應(yīng)用Quantity One分析軟件分析4-HNE的表達(dá)水平。GAPDH作內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

A組未出現(xiàn)中毒癥狀，一般狀態(tài)良好；B組出現(xiàn)小便失禁、流涎、氣促癥狀，肌束震顫評(píng)分3分，并伴有肌無(wú)力、煩躁不安癥狀；C組出現(xiàn)流涎、氣促，肌束震顫評(píng)分2分；D組僅出現(xiàn)輕微肌束震顫，肌束震顫評(píng)分1分；E組未出現(xiàn)中毒癥狀。

2.2 膽堿酯酶檢測(cè)結(jié)果

B組血清膽堿酯酶明顯降低，2 h下降原來(lái)值的94%，C組下降程度較染毒組輕，D組膽堿酯酶在2 h僅下降原來(lái)的21%，與C組膽堿酯酶下降程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與E組下降程度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 病理變化

表1 膽堿酯酶檢測(cè)結(jié)果（x±s，U/L）Tab.1 Results o f AChE（x±s，U/L）

A組肝細(xì)胞排列整齊，胞核完整，胞質(zhì)染色正常；B組肝細(xì)胞排列及其紊亂，伴嚴(yán)重脂肪變性，胞質(zhì)淡染，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量核固縮，碎裂；C組肝細(xì)胞排列稍紊亂，伴中度脂肪變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量細(xì)胞核固縮、碎裂，損傷較B組減輕；D組肝細(xì)胞排列稍整齊，伴有輕度脂肪變性，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮；E組肝細(xì)胞排列整齊，極輕度脂肪變性，偶有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮。見(jiàn)圖1。

2.4 免疫組化結(jié)果

圖1 各組肝臟HE染色×400Fig.1 HE staining o f liver ce lls×400

用免疫組化染色平均吸光度值表示4-HNE的表達(dá)情況。結(jié)果顯示A組可見(jiàn)少量的4-HNE表達(dá)；B組可見(jiàn)胞質(zhì)及胞核內(nèi)4-HNE高表達(dá)，C組亦可見(jiàn)胞質(zhì)及胞核內(nèi)4-HNE高表達(dá)，且與B組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；D組可見(jiàn)少量的4-HNE表達(dá)，與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與E組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。2.5 Western blotting結(jié)果

圖2 各組肝臟4-HNE免疫組化×400Fig.2 Imm unohistochem ical staining analysis of 4-HNE in liver cells×400

Quantity One分析軟件結(jié)果顯示A組可見(jiàn)少量4-HNE的表達(dá)；B組表達(dá)高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與C組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；D組可見(jiàn)少量4-HNE表達(dá)，與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與E組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組肝臟4-HNE表達(dá)Western blotting結(jié)果Fig.3 Western b lotting for liver 4-HNE expression in each group

3 討論

目前普遍公認(rèn)的有機(jī)磷中毒機(jī)制為乙酰膽堿酯酶抑制學(xué)說(shuō)，有機(jī)磷酸酯抑制膽堿酯酶的活性，主要是使絲氨酸殘基磷酸化，影響膽堿酯酶活性部位，使膽堿酯酶失去水解乙酰膽堿的能力，導(dǎo)致大量乙酰膽堿蓄積于突觸間隙，產(chǎn)生一系列癥狀［4］。PON1是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種與高密度脂蛋白相結(jié)合的鈣依賴性酯酶［5-6］，其在有機(jī)磷代謝中具有重要作用，能夠催化磷酸酯鍵的水解，降解有機(jī)磷酸酯［7］。本研究觀察了大鼠的中毒癥狀及檢測(cè)血清膽堿酯酶的活性，結(jié)果顯示，PON1治療組療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)治療組，且單獨(dú)應(yīng)用PON1與聯(lián)合治療效果未見(jiàn)明顯差異。

有機(jī)磷既可以直接損傷肝細(xì)胞，亦能通過(guò)氧化磷酸化解偶聯(lián)抑制線粒體ATP的生成，導(dǎo)致大量氧自由基的產(chǎn)生［8］，從而使正常肝細(xì)胞發(fā)生水腫及脂肪變性、凋亡和自噬等損傷。有關(guān)研究［9-10］證明PON1可參與多種疾病的氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，PON1治療組肝臟損傷較染毒組及傳統(tǒng)治療組輕，與聯(lián)合治療組的病理?yè)p傷相差不大，證明PON1對(duì)敵敵畏所致大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，且保護(hù)作用優(yōu)于傳統(tǒng)治療。

敵敵畏中毒導(dǎo)致的氧化應(yīng)激主要出現(xiàn)在中毒的早期。脂質(zhì)過(guò)氧化是指脂類的氧化降解，其過(guò)程是自由基從細(xì)胞膜的脂質(zhì)中掠奪電子，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化的最終臨床物為活性醛［11］，4-HNE是脂質(zhì)過(guò)氧化醛基產(chǎn)物中最具代表性的物質(zhì)。4-HNE可快速與細(xì)胞內(nèi)的親核物質(zhì)反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙，并且可以通過(guò)加成反應(yīng)修飾細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的聚集、活化，刺激活性氧、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等，引起炎癥反應(yīng)［12］。有機(jī)磷中毒過(guò)程中4-HNE表達(dá)增加，進(jìn)一步加重肝組織的損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡，肝組織的炎癥反應(yīng)及纖維化。PON1可以保護(hù)低密度脂蛋白不被氧化［6］，減少過(guò)量的過(guò)氧化物酶、氧化型磷脂的生成［13］，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，并可通過(guò)水解氧化磷脂來(lái)刺激膽固醇的增高，從而可以有效的緩解有機(jī)磷中毒導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，染毒組肝組織4-HNE的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，證明氧化應(yīng)激確實(shí)參與了有機(jī)磷中毒過(guò)程。而PON1組4-HNE的表達(dá)明顯減少，減少程度與傳統(tǒng)治療組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且病理?yè)p傷較輕，證明其保護(hù)作用優(yōu)于傳統(tǒng)治療。預(yù)測(cè)可能與PON1減輕了機(jī)體的氧化應(yīng)激有關(guān)。

臨床傳統(tǒng)治療有機(jī)磷農(nóng)藥中毒過(guò)程中易出現(xiàn)阿托品過(guò)量，醫(yī)生很難把握其用量，本研究提示PON1單一治療即可達(dá)到預(yù)期治療效果。研究［13，15］表明，PON1作為有機(jī)磷中毒的有效預(yù)防用藥，其對(duì)有機(jī)磷的清除作用是催化有機(jī)磷的酶促反應(yīng)，顯著優(yōu)點(diǎn)是不鈍化，可以水解成千上萬(wàn)個(gè)有機(jī)磷分子，直至酶本身失活，并且可以通過(guò)目標(biāo)定向于紅細(xì)胞表面，從而可以延長(zhǎng)循環(huán)的時(shí)間，這一方案可以用于研究一種預(yù)防用藥來(lái)長(zhǎng)期保護(hù)有機(jī)磷神經(jīng)毒氣危害及農(nóng)藥中毒。

綜上所述，PON1不僅能夠通過(guò)水解有機(jī)磷保護(hù)有機(jī)磷中毒時(shí)的肝組織損傷，并且可能夠通過(guò)減輕氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)肝臟組織，且保護(hù)效果優(yōu)于傳統(tǒng)治療。

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（編輯北辰）

Use of Purified Rabbit Serum Paraoxonase 1 Compared with the Traditional Method of Curative Effect on Dichlorvos-induced Liver Injury in Rats

WANG Cong，TAO Weichen，LI Qi，WU Zeyang，GUO Zhenhao，ZHAO Min
（Emergency Department，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To explore whether the use of purified rabbit serum paraoxonase 1（PON1）for the treatment of dichlorvos-induced liver injury in rats is superior to traditional method.Methods Thirty male SD rats were randomly divided into the followint 5 groups，with 6 rats in each group:control group（A group），dichlorvos group（B group），traditional treatment group（C group），PON1 treatment group（D group），combined treatment group（E group）.Rats in groups B，C，D and E were adminstered dichlorvos by intraperitoneal injection 9 mg/kg.In group C，atropine 10 mg/kg and iodine solution 45 mg/kg were injected intraperitoneally within 2 min after dichlorvos administration.In group D，PON1 was injected intravenously at a dose of 9 600 U/kg，30 min prior to poisoning.In group E，PON1 was injected intravenously at a dose of 9 600 U/kg，30 min prior to poisoning，followed by in travenous injection of atropine 10 mg/kg and iodine solution 45 mg/kg within 2 min after poisoning.Rats in A group

normal saline.Blood was collected at different time points to examine the acetyl cholinesterase（AChE）-levels by ELISA method.Liver tissue were collected at 12 hours after model establishment to observe the pathological changes.The expression of 4 hydroxy 2-nonenal（4-HNE）in the liver tissue was detected by immunohistochemistry and Western blotting.Results In group B，AChE levels decreased significantly，liver cells showed severe fatty degeneration，karyopyknosis and other pathological changes，and 4-HNE expression increased.The pathological changes of group D and group E were less obvious than those of group C，and the 4-HNE expression in the group D and group E were significantly different from that in the group C（P＜0.05）.Conclusion PON1 plays a protective role in dichlorvos-induced liver injury in rats，and this protection is better than that offered by traditional treatment.

paraoxonase 1；dichlorvos poisoning；liver injury；oxidative stress；4-hydroxy 2-nonenal

R575.5

A

0258-4646（2017）07-0582-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81671898）；盛京自由研究者計(jì)劃（201207）

王聰（1992-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

趙敏，E-mail：zhaom@sj-hospital.org

2016-10-25

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