朱莽，龍乾發(fā)，楊彥平，樊欣鑫，謝江濤，姜海濤

（1.西安市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710021；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710003；3.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西咸陽(yáng)712000；4.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710061）

冬凌草甲素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制的研究

朱莽1，2，龍乾發(fā)2，楊彥平2，樊欣鑫2，謝江濤3，姜海濤4

（1.西安市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710021；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710003；3.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西咸陽(yáng)712000；4.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安710061）

目的研究冬凌草甲素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制。方法采用CCK-8比色法繪制生長(zhǎng)曲線，冬凌草甲素分別以0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L觀察對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響；Hoehst33258和TUNEL染色法觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；通過(guò)Western blotting分析凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2在膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果冬凌草甲素作用膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且24 h和48 h細(xì)胞半抑制率（IC50）的濃度分別是7.865和4.74 μmol/L；Hoechst33258和TUNEL染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)形態(tài)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡變化；Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示冬凌草甲素誘導(dǎo)后，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，并激活了凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)。結(jié)論冬凌草甲素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，同時(shí)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)。

冬凌草甲素；膠質(zhì)瘤；SHG44細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤。膠質(zhì)瘤的治療當(dāng)前主要以手術(shù)切除為主，但療效差、易復(fù)發(fā)，目前臨床上還未有突破性進(jìn)展［1］。腦膠質(zhì)瘤化療藥物輔助治療是目前的研究熱點(diǎn)之一［2］，該治療方法可以提高患者生活質(zhì)量，同時(shí)延長(zhǎng)患者的生存期。近年來(lái)研究［3］發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素具有良好的抗癌活性，幾乎無(wú)不良反應(yīng)，但其在膠質(zhì)瘤方面的研究較少。本研究以高級(jí)別人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44為研究對(duì)象，探討冬凌草甲素對(duì)SHG44細(xì)胞增殖抑制的影響，并探索其可能的作用機(jī)制，為治療膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬凌草甲素購(gòu)自Sigma公司，DMSO配制100 μmol/L，分裝后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞株購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清、改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海鴻立生物技術(shù)有限公司、TUNEL試劑盒購(gòu)自羅氏公司，Hoechst33258熒光試劑盒、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自Sigma公司；Caspase3、Bcl-2、Bax和Actin兔的多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)ABcam公司。酶聯(lián)檢測(cè)儀和蛋白電泳設(shè)備裝置均為北京天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、傳代繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 CCK-8觀察細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SHG44細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度2×104/mL，終濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的冬凌草甲素作用SHG44細(xì)胞24 h、48 h，對(duì)照組給予等量的DMSO；每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)負(fù)孔并以空白孔調(diào)零，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換成不同濃度含有冬凌草甲素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。隨后每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)分析儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的光密度值（optical density，OD）。抑制率（%）=（OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD對(duì)照組×100%。

1.2.3 凋亡細(xì)胞的Hoechst33258熒光檢測(cè)：將細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，換成含0、5、10 μmol/L的冬凌草甲素的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照熒光染色試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行操作，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4 TUNEL染色：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG44細(xì)胞接種于15 mm蓋玻片上，分別以0、5、10 μmol/L的濃度給予冬凌草甲素處理24 h后，4%多聚甲醛固定30 min、0.15%Triton X-100破膜5～10 min，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)具體操作步驟逐步進(jìn)行，甘油封片后倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞并拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：分別設(shè)對(duì)照組和冬凌草甲素處理組（5、10 μmol/L），收集各組細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/mL，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次。后續(xù)按照Annexin V FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI輕柔振蕩混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。

1.2.6 Western blotting：將對(duì)數(shù)期細(xì)胞正常培養(yǎng)組設(shè)對(duì)照，然后換液加入稀釋好的5、10 μmol/L冬凌草甲素藥物干預(yù)設(shè)48 h，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS漂洗細(xì)胞，用SDS裂解液裂解細(xì)胞，冰浴超聲提取蛋白，并進(jìn)行蛋白定量分析。制備SDS-PAG凝膠，在電壓的作用下分離蛋白，在將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，分別參照抗體說(shuō)明書(shū)比例，稀釋一抗Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax和Actin兔抗人的多克隆抗體，4℃冰箱孵育過(guò)夜。然后加入標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育2 h，暗室，曝光并進(jìn)行掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度冬凌甲草素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的抑制作用

以0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L濃度冬凌草甲素作用于膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞24、48 h后，CCK-8檢測(cè)藥物對(duì)SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著抑制SHG44細(xì)胞增殖，有明顯的時(shí)間、劑量依賴性。各濃度處理24、48 h后細(xì)胞的OD值及抑制率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），冬凌草甲素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞半數(shù)抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為24 h，7.865 μmol/L和48 h，4.74 μmol/L，見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞凋亡后Hoechst33258染色形態(tài)改變

用含有0、5、10 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)膠質(zhì)瘤SHG44 48 h后，Hoechst33258細(xì)胞染色結(jié)果顯示，隨著藥物作用濃度的增加，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞凋亡明顯增多，見(jiàn)圖2。

2.3 TUNEL染色觀察冬凌草甲素誘導(dǎo)SHG44細(xì)胞凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示，SHG44細(xì)胞經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理48 h產(chǎn)生凋亡改變，正常的SHG44細(xì)胞無(wú)熒光激活，見(jiàn)圖3。

圖1 冬凌草甲素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Oridonin on proliferation of SHG44 ce lls

2.4 AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和5、10 μmol/L冬凌草甲素處理48 h后SHG44細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組SHG44細(xì)胞相比，經(jīng)藥物處理后的SHG44細(xì)胞隨藥物濃度增高發(fā)生凋亡數(shù)量增多（包括凋亡早期和晚期），凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖4。

2.5 Western blotting結(jié)果

在冬凌草甲素誘導(dǎo)作用48 h后，SHG44細(xì)胞有凋亡發(fā)生，Western blotting結(jié)果顯示，SHG44細(xì)胞中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)隨藥物作用濃度增高而減弱，而cleaved Caspase-3和Bax在冬凌草甲素5 μmol/L濃度時(shí)蛋白表達(dá)增高，10 μmol/L時(shí)蛋白表達(dá)減弱。見(jiàn)圖5。

圖2 冬凌草甲素作用下膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的形態(tài)變化×200Fig.2 Morphologica l changes in SHG 44 ce lls a fter Oridonin treatm ent×200

圖3 冬凌草甲素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響×100Fig.3 Apop tosis-inducing e ffects of Oridonin in SHG44 ce lls×100

3 討論

冬凌草甲素是唇形香茶屬植物冬凌草的最主要抗腫瘤成分，是貝殼杉烯骨架的四環(huán)二菇類(lèi)化合物［4］，1967年其顯著抗細(xì)胞增殖活性被首次報(bào)道［5］。目前多項(xiàng)研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。YE等［8］研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可誘導(dǎo)小鼠纖維肉瘤L929細(xì)胞發(fā)生自噬，其作用機(jī)制與一氧化氮（NO）-ERK-p53正反饋環(huán)信號(hào)通路有關(guān)；WANG等［9］研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素還可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。高級(jí)別膠質(zhì)瘤由于生長(zhǎng)速度快，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全根除，且對(duì)放、化療均不敏感，患者生存期短、預(yù)后差。越來(lái)越多研究者在高級(jí)別膠質(zhì)瘤的綜合治療方面一直在不斷地探索尋找新的途徑與治療方法，提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期［10］。尹波等［11］在C6大鼠腦膠質(zhì)瘤裸鼠移植模型中發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對(duì)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤增殖具有抑制效果，且隨著藥物劑量增加，抑制率逐漸上升，具體機(jī)制不明。因此，本研究探討冬凌草甲素對(duì)體外人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的作用及其機(jī)制。調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，活化Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過(guò)促進(jìn)人膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的凋亡發(fā)揮其抗腫瘤的重要作用。

圖4 冬凌草甲素誘導(dǎo)SHG44細(xì)胞凋亡Fig.4 Results for Oridonin-induced SHG 44 ce ll apoptosis

表1 冬凌草甲素對(duì)SHG44細(xì)胞凋亡的影響（x±s）Tab.1 Results for Annexin V-FITC staining（x±s）

圖5 Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase l-3、cleaved Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)Fig.5 Western b lotting ana lysis of Caspase-3，cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax protein expression in each group of cells

冬凌草甲素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制途徑各不相同，說(shuō)明冬凌草甲素可能通過(guò)多種途徑作用于腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮其抗腫瘤作用，且與某些化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能夠增強(qiáng)化療藥物療效［12］，但是冬凌草甲素在小鼠體內(nèi)半衰期較短［13］，目前尚無(wú)其能否通過(guò)血腦屏障的報(bào)道，這些都是未來(lái)探索的方向。

綜上所述，冬凌草甲素對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞具有顯著的抑制生長(zhǎng)的作用，這種作用與其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞凋亡的效應(yīng)有關(guān)，且有望成為治療腦膠質(zhì)瘤的有效新藥。冬凌草甲素作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的機(jī)制和調(diào)控的其他途徑，及能否通過(guò)血腦屏障等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，體外冬凌草甲素在不同濃度、不同時(shí)間對(duì)人膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用，Hoechst33258、TUNEL細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果從形態(tài)和數(shù)據(jù)上均相互印證人膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與細(xì)胞凋亡有關(guān)，且抑制增殖和凋亡與冬凌草甲素呈時(shí)間和濃度依賴性。為了進(jìn)一步檢測(cè)冬凌草甲素促進(jìn)人膠質(zhì)瘤SHG44凋亡機(jī)制，通過(guò)Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平情況，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可能通過(guò)促進(jìn)Bax的表達(dá)和下

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（編輯于溪）

Mechanism of Oridonin-induced Apoptosis of Glioma SHG44 Cells

ZHU Mang1，2，LONG Qianfa2，YANG Yanping2，F(xiàn)AN Xinxin2，XIE Jiangtao3，JIANG Haitao4

（1.Department of Neurosurgery，The Third Hospital of Xi’an，Xi’an 710021，China；2.Department of Neurosurgery，Central Hospital of Xi’an，Xi’an 710003，China；3.Department of Neurosurgery，Central Hospital of Xian yang，Xianyang 712000，China；4.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University，Xi’an 710061，China）

Objective To study the molecular mechanism of oridonin-induced apoptosis of glioma SHG44 cells.Methods A growth curve was plotted using CCK-8 colorimetric method with different concentrations of oridonin（0，1.25，2.5，5，10，20，and 40 μmol/L）to observe its effect on the growth of SHG44 cells.Hoechst33258 and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling（TUNEL）staining were used to examine the changes in cell morphology and flow cytometry was used to detect cell apoptosis.Western blotting was used to analyze the expression of apoptosis-related proteins（Caspase-3，cleaved Caspase-3，Bax，and Bcl-2）in SHG44 cells.Results SHG44 cell proliferation was significantly suppressed after 24 and 48 h Oridonin treatment，with a half-maximal inhibitory concentration of 7.865 and 4.74 μmol/L，respectively. Hoechst33258 and TUNEL staining showed changes in cell morphology such as shrinkage and nucleus fragmentation and morphogenesis，which are indicative of apoptosis.Western blotting analysis showed that oridonin inhibited the expression of Bcl-2 and activated the expression of Caspase-3 and Bax.Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SHG44 cells by regulating the expression of apoptosis-related proteins.

oridonin；glioma；SHG44 cells；cell apoptosis

R739.41

A

0258-4646（2017）07-0604-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301216）

朱莽（1985-），男，主治醫(yī)師，碩士.

朱莽，E-mail：mzfly@126.com

2016-10-26

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