劉鵬飛，張海濤，齊弘煒王楠楠，張博陽，袁彪，李田昌

（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)寧272000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心外科，河北承德067000；3.北京同仁醫(yī)院心外科，北京100730；4.海軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京100037）

過表達(dá)m icroRNA-486對大鼠心肌梗死后心臟功能損傷的改善

劉鵬飛1，張海濤2，齊弘煒3王楠楠4，張博陽4，袁彪3，李田昌4

（1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)寧272000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心外科，河北承德067000；3.北京同仁醫(yī)院心外科，北京100730；4.海軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京100037）

目的觀察直接心肌注射腺病毒搭載microRNA-486（miR-486）基因?qū)Υ笫笮募」Ｋ篮笮呐K功能損傷的影響。方法SD雄性大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、心肌梗死+生理鹽水組（MI組）、心肌梗死+空載腺病毒組（Ad組）、心肌梗死+miR-486腺病毒組（miR-486組）。于梗死區(qū)周圍心肌注射不同目標(biāo)物質(zhì)。于不同時間點(diǎn)利用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測量各組梗死周邊區(qū)域miR-486表達(dá)水平。4周時行超聲心動圖檢查，并取各組大鼠心臟行TTC染色，蘇木精-依紅（HE）染色，馬松（Masson）染色，Tunel染色和免疫組化染色。結(jié)果隨著心肌梗死時間延長miR-486在3組內(nèi)的含量有下降的趨勢，但miR-486組miR-486表達(dá)量均較MI組和Ad組明顯增加；超聲心動圖示miR-486組心功能優(yōu)于MI組和Ad組；miR-486組心肌梗死面積較MI組、Ad組明顯減少；Masson染色提示miR-486組、MI組和Ad組膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）明顯高于Sham組，但miR-486組CVF低于MI組和Ad組；MI組和Ad組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升但2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，miR-486組與MI組和Ad組相比心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，Sham組未見明顯心肌細(xì)胞凋亡；miR-486組微血管密度（MVD）顯著高于Sham組、MI組和Ad組，且MI組、Ad組心肌MVD顯著高于Sham組。結(jié)論miR-486的心肌注射可通過抑制大鼠心肌梗死后纖維化，減少心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)缺血區(qū)域微血管新生，進(jìn)而對心肌梗死后心臟功能有所改善。

心肌梗死；microRNA-486；心肌纖維化；心肌細(xì)胞凋亡；微血管新生

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種常見的心血管疾病，不僅可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、凋亡，還可誘發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理過程而導(dǎo)致心臟重構(gòu)，最終發(fā)展為心衰［1］。其中microRNA（miRNA）起到了重要的作用。miRNA是一種長約20～25個核苷酸的小分子單鏈RNA分子，通過與信使RNA（messenger RNA，mRNA）結(jié)合抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，對靶mRNA的穩(wěn)定及翻譯效率起到重要的調(diào)控作用，參與凋亡、增殖、分化和細(xì)胞周期等［2］。miR-486是一種高分布于心肌的miRNA［3］，且最近一項臨床研究發(fā)現(xiàn)急性S-T段抬高型心肌梗死患者血漿中miR-486含量較高［4］。然而國內(nèi)外關(guān)于miR-486對心肌梗死后的功能變化的影響及其作用機(jī)制報道較少。本研究采用大鼠心肌梗死模型，檢測心肌梗死交界區(qū)miR-486的表達(dá)情況，觀察過表達(dá)miR-486對大鼠心肌梗死后心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量230～250 g，隨機(jī)分成4組，假手術(shù)組（Sham組）、心肌梗死+生理鹽水組（MI組）、心肌梗死+空載腺病毒組（Ad組）、心肌梗死+miR-486腺病毒組（miR-486組），每組30只。

1.2 試劑及儀器

腺病毒載體Ad-miR486及空載腺病毒（上海漢恒生物公司）。Trizol、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green（美國Invitrogen公司）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）。馬松（Masson）染色試劑盒（南京森貝伽生物有限公司）。氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色試劑盒及Tunel原位末端標(biāo)記檢測試劑盒（德國Roche公司）。雙路小動物呼吸機(jī)ZS-V9A（北京眾實迪創(chuàng)公司），自動分析心電圖機(jī)FCP-Z155（北京福田電子醫(yī)療器械公司），超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)Vevo2100（美國FUJIFILM VisualSonics公司）

1.3 方法

1.3.1 大鼠心肌梗死模型的制備及轉(zhuǎn)染：采用10%的水合氯醛溶液（3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠。氣管插管連接呼吸機(jī)，開胸后于左心耳下緣與肺動脈圓錐連線中點(diǎn)下2～3 mm處結(jié)扎前降支。結(jié)扎點(diǎn)靠心尖部左心室前壁呈灰白色，心電圖S-T段抬高則證明造模成功。Sham組不予任何干預(yù)。MI組、Ad組和miR-486組用微量注射器分別吸取75 μL生理鹽水、腺病毒載體溶液、攜帶miR-486腺病毒溶液，于心肌梗死周圍區(qū)域選取3點(diǎn)，直接注射入心肌內(nèi)。閉合肋間傷口，抽取胸腔負(fù)壓，縫合手術(shù)切口，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔出氣管插管。

1.3.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-486的含量：分別于1周、2周和4周時間點(diǎn)處死大鼠。以SD大鼠心肌梗死的邊帶為標(biāo)志［5］，剪取梗死交界區(qū)域，Trizol法提取各組心肌組織的RNA，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，特異性引物反轉(zhuǎn)miR-486和U6，SYBR Green熒光染料法檢測miR-486表達(dá)。將U6snRNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法計算miR-486相對表達(dá)水平。

1.3.3 小動物心臟超聲心動圖檢測：4周后，使用小動物超聲成像系統(tǒng)，記錄左心室收縮期末徑和左室舒張期末徑，計算出左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），取連續(xù)3個以上心動周期的平均值。

1.3.4 染色方法：（1）TTC染色，4周后處死大鼠后取出心臟，用PBS溶液沖洗血污，紗布吸干后放入-20℃冰箱中冷凍15 min，連續(xù)切片后置入1%的TTC溶液中，于水浴箱中37℃避光孵育15 min，染色完成后拍照。磚紅色為正常區(qū)域，灰白色為梗死區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0計算梗死面積，梗死百比分%=梗死面積/心臟切面總面積×100%。（2）HE染色、Masson染色及Tunel染色，4周后處死大鼠，將心臟置于多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片后脫蠟、脫水，應(yīng)用相應(yīng)的試劑染色制片。Masson染色后，通過Image Pro Plus 6.0采圖、分析，每張病例切片隨機(jī)選取5個心肌梗死周圍區(qū)域視野，膠原組織面積占所測視野面積的百分比的平均值即為膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。Tunel染色后，細(xì)胞系呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細(xì)胞，400倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片拍攝5個陽性視野，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotoc index，AI）=（凋亡心肌細(xì)胞系數(shù)/正常心肌細(xì)胞系數(shù)）×100%。

1.3.5 免疫組化法測定微血管密度（micro-vascular density，MVD）：切片后用小鼠抗大鼠CD31多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色［6］，內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕褐色。Weidner法計數(shù)MVD［7］，400倍光學(xué)顯微鏡下，在MI周圍區(qū)域隨機(jī)選取5個高倍視野計數(shù)微血管數(shù)目，求得計數(shù)的平均值作為該份標(biāo)本的MVD。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般情況

120只大鼠建模過程中死亡12只（Sham組2只、MI組3只、Ad組4只、miR-486組3只），飼養(yǎng)過程中死亡8只（MI組2只，Ad組3只，miR-486組3只），最終存活100只（Sham組28只、MI組25只、Ad組23只、miR-486組24只）。

2.2 各組大鼠在不同時間點(diǎn)miR-486表達(dá)量的比較

qRT-PCR測得，MI組、Ad組和miR-486組心肌梗死大鼠在1周、2周和4周時心肌組織miR-486的表達(dá)量隨時間推移逐漸下降。1周時4組之間相比較，miR-486的表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；MI組和Ad組miR-486的表達(dá)量低于miR-486組，但高于Sham組（P＜0.05），且MI組和Ad組之間miR-486的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。2周時4組之間相比較，miR-486的表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），且Sham組、MI組和Ad組的表達(dá)量低于miR-486組，但Sham組、MI組和Ad組3組之間miR-486的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。4周時4組之間相比較，miR-486的表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），MI組和Ad組miR-486的表達(dá)量低于Sham組和miR-486組，且MI組和Ad組miR-486的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.3 miR-486轉(zhuǎn)染改善大鼠心肌梗死后心功能

4周后大鼠心肌梗死模型超聲結(jié)果示，與Sham組相比，miR-486組、MI組和Ad組的LVEF和LVFS明顯減低（P＜0.01）；miR-486組與MI組和Ad組比較，LVEF和LVFS明顯升高（P＜0.05）；而MI組和Ad組間，LVEF和LVFS無明顯差異（P＞0.05），見表2。

表1 不同時間點(diǎn)各組大鼠心臟梗死交界區(qū)m iR-486表達(dá)量的比較（x±s）Tab.1 Com parison of the expression o f m iR-486 in 4 groups atdifferent time points（x±s）

表2 術(shù)后4周時各組大鼠心功能超聲心動圖檢查結(jié)果（x±s）Tab.2 Com parison of the cardiac function of 4 groups measured by cardiac ultrasound at 4 weeks a fter surgery（x±s）

2.4 不同組大鼠心肌梗死面積的比較

圖1 4周后不同組大鼠心肌T T C染色Fig.1 TTC staining of 4 groups’m yocardium after 4 weeks

Sham組未見心肌梗死，其余3組可見明顯的乳白色梗死區(qū)域（圖1）。miR-486組心肌梗死面積［（30.75±1.96）%］明顯小于MI組和Ad組（P＜0.05），MI組［（35.81±1.51）%］與Ad組［（35.05± 1.75）%］心肌梗死面積無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.5 大鼠心臟組織病理學(xué)改變

心肌HE染色顯示：Sham組左心室前壁心肌細(xì)胞排列正常；MI組和Ad組左心室前壁心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮或碎裂，周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，存活心肌細(xì)胞呈島樣分布，周圍纖維肉芽組織增生，壞死心肌為纖維組織取代；miR-486組左室前壁梗死病變程度輕于MI組和Ad組，心肌纖維排列輕度紊亂，細(xì)胞形態(tài)較為均一，有少量炎癥細(xì)胞和纖維組織浸潤。見圖2。

2.6 大鼠心肌Masson染色

Sham組大鼠心肌組織形態(tài)正常，膠原纖維含量較少；心肌梗死后大鼠心肌組織排列紊亂，膠原纖維含量明顯增多，纖維化程度明顯。見圖3。通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)量化分析，與Sham組［（7.45±1.37）%］相比MI組、Ad組和miR-486組CVF含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且miR-486組CVF含量［（53.72±2.89）%］較MI組［（62.87±3.30）%］和Ad組［（64.38±5.25）%］降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），MI組和Ad組之間CVF無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 HE染色光鏡下不同組大鼠心肌組織切片×100Fig.2 HE staining of 4 groups’myocardium after 4 weeks under light m icroscope×100

圖3 Masson染色光鏡下不同組大鼠心肌組織切片×200Fig.3 Masson staining of 4 groups’myocardium after 4 weeks under light m icroscope×200

2.7 各組大鼠心肌Tunel染色

與Sham組AI值［（9.40±0.85）%］相比，MI大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多、AI值顯著增高（P＜0.05）。經(jīng)過miR-486治療，4周后miR-486組AI值［（38.78±2.64）%］明顯低于MI組［（44.41±4.80）%］和Ad組［（45.96±3.49）%］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且MI組與Ad組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

2.8 各組大鼠心肌MVD變化

圖4 Tune l染色光鏡下不同組大鼠心肌組織切片×400Fig.4 Tunel staining o f 4 groups’m yocardium a fter 4 weeks under light m icroscope×400

MI大鼠心肌MVD明顯高于Sham組［（58.8± 6.60）個/視野］（P＜0.05）。且miR-486組心肌MVD［（117.88±10.81）個/視野］高于MI組［（95.76±9.18）個/視野］和Ad組［（98.32±9.70）個/視野］（P＜0.05），MI組與Ad組之間心肌MVD無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）。見圖5。

3 討論

圖5 CD31染色光鏡下不同組大鼠心肌組織切片×400Fig.5 CD31 staining of 4 groups’myocardium after 4 weeks under light m icroscope×400

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是危害人類健康的常見疾病之一。本研究采用結(jié)扎大鼠心臟前降支的辦法構(gòu)建MI模型，很好的再現(xiàn)AMI的發(fā)病過程，為后續(xù)觀察心肌梗死后心臟的病理生理改變提供了良好的依據(jù)［8］。

研究［9］發(fā)現(xiàn)miRNA對心臟的發(fā)育過程中有著精細(xì)的調(diào)控。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，以直接心肌注射腺病毒搭載miR-486的形式，提高心肌中miR-486的表達(dá)水平，并通過一系列檢測證明，心肌過表達(dá)miR-486后可以減少心肌梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，增加微血管密度，從而改善了MI大鼠的心功能。

miR-486在心肌細(xì)胞中高豐度表達(dá)［10］，但miR-486減少心肌梗死面積和改善心肌重構(gòu)和心功能的機(jī)制尚不明確。通過miRNA靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫TargetScan的生物信息學(xué)分析以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)miR-486的靶基因為Pten和FoxO1a［3，10］。FoxO家族參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，包含促進(jìn)細(xì)胞分化、增生、代謝，且FoxO1a在血管形成中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)血管生成、分支增生，改善心肌供血，提高心肌細(xì)胞有氧代謝，抑制心肌細(xì)胞凋亡［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-486組的心梗大鼠新生血管明顯增多，AI值明顯降低。miR-486通過抑制靶基因的mRNA表達(dá)，有效提高PI3K/Akt信號通路的表達(dá)，抑制心肌纖維化改善心室重構(gòu)［3，11］，這在本研究中得到證實，miR-486組大鼠膠原纖維含量較MI組大鼠膠原纖維含量明顯降低，進(jìn)一步行心臟超聲檢查提示，miR-486組的心肌梗死大鼠心功能明顯優(yōu)于MI組和Ad組，可見miR-486對心肌梗死后性能的改善是有效的。

綜上所述，本研究證明通過提高心肌中miR-486的表達(dá)水平改善心肌梗死后心臟功能是安全的、有效的，因而miR-486有可能為心肌梗死后基因治療提供新的線索和治療的靶點(diǎn)。

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（編輯北辰）

Overexpression of m icroRNA-486 Improves the Cardiac Function in Rats w ith M yocardial Infarction

LIU Pengfei1，ZHANG Haitao2，QI Hongwei3，WANG Nannan4，ZHANG Boyang4，YUAN Biao3，LI Tianchang4

（1.Department of Cardiology，Jining First People’s Hospital，Jining 272000，China；2.Department of Cardiac Surgery，Affiliated of Chengde Medical College，Chengde 067000，China；3.Department of Cardiac Surgery，Beijing Tongren Hospital，Beijing 100730，China；4.Department of Cardiology，Navy General Hospital，Beijing 100037，China）

Objective To investigate the effects of microRNA-486（miR-486）expression on the cardiac function in rats with myocardial infarction（MI），through direct injection of an adenovirus carrying the miR-486 gene into the myocardium.Methods Totally 120 male rats were divided into 4 groups.Different target materials were infused into the surrounding areas of MI after building a successful disease model.Expression of miR-486 in the surrounding areas of left ventricular MI was detected using real-time PCR at different time points.Cardiac function was measured by cardiac ultrasound at 4 weeks.Using TUNEL，TTC，Masson，and CD31 staining to measure the organic changes in heart tissues.Results The expression of miR-486 in miR-486 group was higher than the other three groups.The expression of miR-486 in the three groups decreased when the time of MI in rats was prolonged.The cardiac function of the miR-486 group was better than that of the MI and AD groups.The MI area in the miR-486 group was smaller than that in the other two groups.Compared to the Sham group，the CVF at the infarct border zone was increased in the MI，Ad，and miR-486 groups.The AI in the MI and Ad groups was significantly increased compared to that in the miR-486 group.MVD was increased in the miR-486 group compared to that in the Sham，MI，and Ad groups.Conclusion miR-486 improved the cardiac function after MI in rats，through lightening collagen deposition，inhibiting apoptosis，and inducing angiogenesis in ischemic regions.

myocardial infarction；microRNA-486；collagen；apoptosis；microvessel density

R541.4

A

0258-4646（2017）07-0595-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.005

國家自然科學(xué)基金（81370237）

劉鵬飛（1989-），男，醫(yī)師，碩士.

李田昌，E-mail：ltc909@aliyun.com

2016-11-03

網(wǎng)絡(luò)出版時間：