李丹，黃寶俊，趙丹懿

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116027；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽110001）

遠端上游元件結(jié)合蛋白1在胃癌中的表達及其對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響

李丹1，黃寶俊2，趙丹懿1

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連116027；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽110001）

目的研究遠端上游元件結(jié)合蛋白1（FUBP1）在胃癌中的表達，探討其對胃癌細胞增殖侵襲能力的影響。方法采用實時PCR檢測FUBP1基因在胃癌組織中的表達。采用單因素方差分析分析FUBP1基因表達與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性。構(gòu)建FUBP1基因表達沉默載體pS-FUBP1并轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，實時PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。采用CCK8法及Transwell法檢測FUBP1基因表達沉默對于SGC7901細胞的增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果FUBP1基因在胃癌組織中表達顯著上調(diào)，且隨著分化水平的降低、浸潤深度和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量的增加，胃原發(fā)癌中FUBP1基因表達明顯增高。pS-FUBP1載體能夠顯著沉默F(xiàn)UBP1基因的表達。FUBP1表達沉默的SGC7901細胞的增殖及侵襲能力下調(diào)明顯。結(jié)論FUBP1基因在胃癌中高表達，與胃癌的發(fā)生進展相關(guān)，沉默其表達能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力。

胃癌；遠端上游元件結(jié)合蛋白1；增殖；侵襲

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高居各類腫瘤之首［1］。胃癌的治療策略是以手術(shù)為主結(jié)合放化療的綜合治療，但部分中晚期患者的預(yù)后不良，治療效果不佳，因此深入探究胃癌發(fā)生和進展的分子機制，尋找效果更佳、特異性更好的治療靶點和方法是胃癌研究的重點。人遠端上游元件結(jié)合蛋白（far upstream element binding protein 1，F(xiàn)UBP1）是在研究原癌基因c-myc時發(fā)現(xiàn)的遠端上游元件結(jié)合蛋白，與FUBP2和FUBP3共同組成FUBP家族，亦屬于單鏈DNA結(jié)合家族［2］。FUBP1基因在多種人體組織中存在廣泛的表達，與細胞增殖和凋亡相關(guān)因子關(guān)系密切［3-4］。目前發(fā)現(xiàn)FUBP1基因在多種腫瘤組織中存在表達和功能的異常，其高表達與多種腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)［5-7］。本研究擬檢測FUBP1基因在胃癌中的表達，明確其表達與胃癌發(fā)生進展的相關(guān)性，并探討FUBP1對胃癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇2013年至2015年于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科住院的胃癌患者71例，其中，男39例，女32例；年齡43～72歲，中位年齡61歲?；颊吲R床資料完整，術(shù)前均未接受放療和化療。本研究獲得患者的知情同意。人胃癌SGC7901細胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑：Trizol提取試劑及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國ThermoFisher公司，熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物合成及FUBP1沉默載體（pS-FUBP1）的構(gòu)建由上海生工公司完成，F(xiàn)UBP1抗體購自美國Abcam公司，CCK8試劑盒及Western blotting相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR：Trizol法提取組織標本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，按照試劑盒說明書擴增FUBP1基因。FUBP1上游引物序列為5’-GATGGGACAACACCCGAAAG-3’，下游引物序列為5’-CCAGTTGCCTTGACCTCTAC-3’。所得實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用比較Ct值法，即2-ΔΔCt法進行結(jié)果分析［6］。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組：將SGC7901細胞接種在6孔板中（5×104/孔），培養(yǎng)24 h。應(yīng)用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染pS-FUBP1及相應(yīng)的對照空載體pSilencer，轉(zhuǎn)染操作按照說明書進行。以未轉(zhuǎn)染的SGC7901細胞作為空白對照（control）組，以轉(zhuǎn)染pSilencer的SGC7901細胞為陰性對照（pS-NC）組，以轉(zhuǎn)染pS-FUBP1的SGC7901細胞為FUBP1沉默（pSFUBP1）組。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖能力：將處于對數(shù)生長期的SGC7901細胞常規(guī)消化、離心后，重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（密度為1×105/mL）。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔100 μL。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37℃孵育2 h，用酶標儀于490 nm處測定吸光度（A）值。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力：將處于對數(shù)生長期的SGC7901細胞常規(guī)消化、離心后，重懸于無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（密度為2×105/mL）。將100 μL細胞懸液加入預(yù)鋪Martigel膠的Transwell小室的上室，下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基100 μL。37℃孵育24 h。取出小室，棄上室內(nèi)培養(yǎng)基，水化基底膜基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。風(fēng)干后，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，輕輕擦去小室膜上表面尚未穿過的細胞。顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取平均值作為結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

每組實驗重復(fù)5次。應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以x±s表示。FUBP1 mRNA在胃癌與癌旁組織中表達差異的比較分析采用配對t檢驗，其在胃癌組織不同分組中表達差異的比較分析采用t檢驗和單因素方差分析；而實驗組與對照組中FUBP1mRNA表達和細胞增殖、侵襲能力的比較分析采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌與癌旁組織FUBP1mRNA表達水平的比較

實時PCR結(jié)果經(jīng)比較Ct值法分析進行相對定量，胃癌和癌旁組織之間的ΔΔCt為-1.627。FUBP1在胃癌組織中呈現(xiàn)顯著的高表達，為癌旁正常組織中FUBP1表達量的308.87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 胃癌組織FUBP1mRNA表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

分化程度低、浸潤程度深、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量多的患者胃癌組織中FUBP1mRNA表達明顯升高（P均＜0.01）?；颊叩男詣e及癌灶大小對胃癌組織FUBP1mRNA表達均無影響（P均＞0.05）。見表1。

2.3 pS-FUBP1對SGC7901細胞中FUBP1表達的影響

實時PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，pS-FUBP1的轉(zhuǎn)染能夠顯著沉默SGC7901細胞中FUBP1 mRNA的表達（圖1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 FUBP1沉默對SGC7901細胞增殖能力及侵襲能力的影響

表1 根據(jù)不同臨床信息分組后胃癌組織中FUBP1基因表達的比較分析Tab.1 The com parative analysis of FUBP1 gene expression in gastric cancer a fter grouping w ith different clinical in form ation

圖1 pS-FUBP1對SGC7901細胞中FUBP1表達的影響Fig.1 Effect o f pS-FUBP1 on the expression o f FUBP1 in SGC7901 cells

在轉(zhuǎn)染72 h及96 h后，與對照組相比，F(xiàn)UBP1表達沉默的SGC7901細胞的增殖能力明顯下調(diào)（圖2），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Transwell實驗中FUBP1表達沉默的SGC7901細胞的穿膜細胞數(shù)為13.7±2.3，與對照組相比顯著減少（圖3），細胞侵襲能力顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖2 FUBP1沉默對SGC7901細胞細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect o f FUBP1 silence on ce ll pro liferation in SGC7901 ce lls

FUBP1基因?qū)儆谶h端上游元件結(jié)合蛋白家族的成員，能夠與已激活的遠端上游元件（far upstream element，F(xiàn)USE）結(jié)合，促進具有FUSE元件的基因轉(zhuǎn)錄表達，進而參與細胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)［8-10］。FUBP1基因的表達和功能異常已被證明與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，近年來有關(guān)報道逐年增加。

圖3 FUBP1沉默對SGC7901細胞細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect o f FUBP1 silence on the ce ll invasion in SGC7901 cells

本研究首先檢測胃癌及相應(yīng)癌旁組織中FUBP1mRNA的表達，明確了FUBP1基因在胃癌組織中高表達，提示其可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。進一步的統(tǒng)計分析顯示，F(xiàn)UBP1基因高表達與胃癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，隨著分化水平的降低、浸潤深度和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量的增加，胃原發(fā)癌中FUBP1基因表達明顯增高，但患者的性別及癌灶大小對胃癌組織FUBP1mRNA表達均無影響。ZHANG等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UBP1基因在胃癌中高表達，且與胃癌患者的總生存率、淋巴及遠處轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)。這些報道與本研究結(jié)果相符，因此推測FUBP1在胃癌的惡性進展及浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用。但FUBP1基因的表達異常是否參與胃癌細胞的增殖及侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)目前尚不清楚，亦無相關(guān)研究報道。

本研究構(gòu)建了FUBP1表達沉默載體，轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細胞，結(jié)果顯示其能夠有效地沉默F(xiàn)UBP1基因，進一步的檢測發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)UBP1基因能夠顯著抑制胃癌SGC7901細胞的增殖能力。DING等［8］報道，F(xiàn)UBP1在腦膠質(zhì)瘤中高表達，且與膠質(zhì)瘤的高分級和不良預(yù)后相關(guān)，沉默其表達能夠抑制膠質(zhì)瘤U87MG細胞的增殖。此外，沉默F(xiàn)UBP1基因還能夠降低胃癌SGC7901細胞的侵襲能力，這與本研究中組織表達檢測結(jié)果相符，浸潤程度深、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量多的患者胃癌組織中FUBP1基因表達上調(diào)更為顯著。上述結(jié)果證實FUBP1基因與胃癌相關(guān)，在胃癌中作為癌基因發(fā)揮作用，沉默其表達能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖及侵襲能力。

綜上所述，F(xiàn)UBP1基因在胃癌中發(fā)揮癌基因的作用，但其中的具體作用機制尚不清楚，需要進一步深入研究。

［1］INOKUCHI M，OTSUKI S，F(xiàn)UJIMORI Y，et al.Clinical significance of MET in gastric cancer［J］.World J Gastrointest Oncol，2015，7（11）：317-327.DOI：10.4251/wjgo.v7.i11.317.

［2］WEBER A，KRISTIANSEN I，JOHANNSEN M，et al.The FUSE binding proteins FBP1 and FBP3 are potential c-myc regulators in renal，but not in prostate and bladder cancer［J］.BMC Cancer，2008，8：369.DOI：10.1186/1471-2407-8-369.

［3］JANG M，PARK BC，KANG S，et al.Far upstream element-binding protein-1，a novel caspase substrate，acts as a cross-talker between apoptosis and the c-myc oncogene［J］.Oncogene，2009，28（12）：1529-1536.DOI：10.1038/onc.2009.11.

［4］JACOB AG，SINGH RK，MOHAMMAD F，et al.The splicing factor FUBP1 is required for the efficient splicing of oncogene MDM2 premRNA［J］.J Biol Chem，2014，289（25）：17350-17364.DOI：10.1074/jbc.M114.554717.

［5］JIA MY，WANG YJ.Far upstream element-binding protein 1（FUBP1）expression differs between human colorectal cancer and non-cancerous tissue［J］.Neoplasma，2014，61（5）：533-540. DOI：10.4149/neo_2014_065.

［6］SHENG H，YING L，ZHENG L，et al.Down expression of FBP1 is a negative prognostic factor for non-small-cell lung cancer［J］.Cancer Invest，2015，33（5）：197-204.DOI：10.3109/07357907.2015. 1020385.

［7］LIU ZH，HU JL，LIANG JZ，et al.Far upstream element-binding protein 1 is a prognostic biomarker and promotes nasopharyngeal carcinoma progression［J］.Cell Death Dis，2015，6：e1920.DOI：10.1038/ cddis.2015.258.

［8］DING Z，LIU X，LIU Y，et al.Expression of far upstream element（FUSE）binding protein 1 in human glioma is correlated with c-Myc and cell proliferation［J］.Mol Carcinog，2015，54（5）：405-415.DOI：10.1002/mc.22114.

［9］MA J，CHEN M，XIA SK，et al.Prostaglandin E2 promotes liver cancer cell growth by the upregulation of FUSE-binding protein 1 expression［J］.Int J Oncol，2013，42（3）：1093-1104.DOI：10.3892/ ijo.2013.1782.

［10］MüLLER B，BOVET M，YIN Y，et al.Concomitant expression of far upstream element（FUSE）binding protein（FBP）interacting repressor（FIR）and its splice variants induce migration and invasion of non-small cell lung cancer（NSCLC）cells［J］.J Pathol，2015，237（3）：390-401.DOI：10.1002/path.4588.

［11］ZHANG F，TIAN Q，WANG Y.Far upstream element-binding protein 1（FUBP1）is overexpressed in human gastric cancer tissue compared to non-cancerous tissue［J］.Onkologie，2013，36（11）：650-655.DOI：10.1159/000355659.

（編輯王又冬）

Expression of Far Upstream Element Binding Protein 1 in Gastric Cancer and Its Effect on Proliferation and Invasion of Gastric Cancer Cells

LI Dan1，HUANG Baojun2，ZHAO Danyi1

（1.Department of Oncology，Affiliated Second Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116027，China；2.Department of Surgical Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the expression of far upstream element binding protein 1（FUBP1）gene in gastric cancer，and analyze its effect on proliferation and invasion of gastricc cancer cells.Methods The expression of FUBP1 in gastric cancer tissues was detected by real-time PCR.The relationship between FUBP1 expression and clinic pathological factors of gastricc cancer was analyzed by one-way ANOVA.The silence vector for FUBP1 was constructed and transfected into gastricc cancer SGC7901 cells，and the transfected effects were then detected by real-time PCR.The influence of FUBP1 silence on cell proliferation and invasion in SGC7901 cells were detected by CCK8 method and Transwell assay.Results FUBP1 expression was increased markedly in gastricc cancer tissues.Following the depressing of differentiation and the increase of invasion depth and metastatic lymph nodes，the FUBP1 expression was up-regulated in primary gastric carcinoma significantly.The pS-FUBP1 vector could silence the FUBP1 expression in SGC7901 cells.FUBP1 silence inhibited SGC7901 cell proliferation amd invasion.Conclusion FUBP1 was high-expressed in gastricc cancer，and related with genesis and progress of gastric cancer，silence of FUBP1 expression can inhibit the cell proliferation and invasion in gastric cancer cells.

gastric cancer；FUBP1；proliferation；invasion

R735.2

A

0258-4646（2017）07-0587-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.003

國家自然科學(xué)基金（81272716）

李丹（1979-），女，副主任醫(yī)師，博士.

趙丹懿，E-mail：danyizhao2000@163.com

2016-07-25

網(wǎng)絡(luò)出版時間：