龐英梁明亭馬建群楊永張靜

·論著·

重組人促紅細(xì)胞生成素對兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

龐英1梁明亭1馬建群2楊永1張靜3

目的觀察重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）對心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）兔心肌細(xì)胞凋亡及凋亡關(guān)鍵蛋白酶半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響，探討rhEPO對兔MI/RI損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法取新西蘭大白兔16只，隨機(jī)分為對照組（MI/RI組）和藥物組（rhEPO組）。結(jié)扎兔左冠狀動脈前降支制備MI/RI模型。rhEPO組于結(jié)扎左冠狀動脈前降支的同時注入rhEPO（1 000 U/kg），對照組注入等量的0.9%氯化鈉注射液。分別于缺血前、缺血60 min、再灌注60 min和再灌注180 min檢測肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的濃度；取缺血區(qū)心肌組織，檢測其凋亡指數(shù)以及凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3的表達(dá)水平；制作光鏡和電鏡標(biāo)本，觀察心肌組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果血清CK-MB濃度隨缺血及再灌注時間延長而增加（P＜0.01）；缺血前rhEPO組與MI/RI組血清CK-MB濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；缺血60 min、再灌注60 min、再灌注180 min時，rhEPO組血清CK-MB濃度均顯著低于MI/RI組（均P＜0.01）。與MI/RI組相比，rhEPO組缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降（P＜0.01），凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3表達(dá)水平亦顯著下降（P＜0.01）。rhEPO組心肌組織細(xì)胞大體形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微組織結(jié)構(gòu)損傷均較MI/RI組減輕。結(jié)論rhEPO對兔MI/RI具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、減少心肌酶釋放和抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)；rhEPO抑制心肌細(xì)胞凋亡可能通過抑制Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。

重組人促紅細(xì)胞生成素； 缺血再灌注損傷； 細(xì)胞凋亡； 半胱氨酸蛋白酶-3； 兔

冠心病的發(fā)病率在各類心血管疾病中居首位，在人口死亡原因中居第2位［1］。其也是全球醫(yī)療健康事業(yè)的首要負(fù)擔(dān)［2］。溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及外科冠狀動脈搭橋等再灌注療法通過恢復(fù)缺血區(qū)供血能有效挽救缺血心肌組織、減少梗死面積、改善心功能、減少泵衰竭發(fā)生率和患者病死率，是目前治療心肌缺血和梗死的有效措施［3］。但相關(guān)研究表明，經(jīng)歷一定時間缺血后心肌組織再恢復(fù)血流供應(yīng)時可能出現(xiàn)缺血性損傷進(jìn)一步加重現(xiàn)象，此種現(xiàn)象被稱為缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［4］。I/R損傷的發(fā)生機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等多種因素。

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是細(xì)胞生長因子超家族成員之一，廣泛分布于人體各個系統(tǒng)，主要用于促紅細(xì)胞生成而治療腎性貧血［5］。研究證實，EPO具有多種與促造血作用無關(guān)的非造血生物學(xué)作用，具有潛在的組織細(xì)胞保護(hù)作用［6］。既往研究證實EPO可通過抑制炎性反應(yīng)而減輕大鼠心肌I/R損傷［7］，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要因素之一。本研究主要探討重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）對心肌I/R的保護(hù)作用及其抗細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，從而為rhEPO在心血管疾病臨床應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物與分組：新西蘭大白兔16只，雄性，體重（2.0±0.3）kg，山東省農(nóng)科院提供，合格證號：SCXK（魯）20040013。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）組（對照組）和rhEPO組（藥物組，于結(jié)扎左冠狀動脈前降支的同時注入 rhEPO 1 000 U/kg），每組8只。

2.模型制作：經(jīng)兔耳緣注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）靜脈麻醉后，四肢與心電圖機(jī)連接，暴露頸靜脈以備抽血用。保持處于自然呼吸狀態(tài)，胸前區(qū)備皮并消毒。沿胸骨正中線切開皮膚，切斷肌肉附著處并向左游離肌肉至暴露左側(cè)肋骨。確認(rèn)2、3、4肋骨，于胸骨左緣約1 cm處每根肋骨下穿雙線后，將兩線分開向相反方向牽拉，拉開肋骨上附著的薄層肌肉并結(jié)扎肋骨，從兩線結(jié)扎中央剪斷肋骨開胸。開胸后用小止血鉗提起心包，將其縫置于兩側(cè)胸壁上，從中間剪開制作心包吊籃，將心臟提起。用棉棒將心臟逆時針轉(zhuǎn)位以充分暴露左冠狀動脈前降支，用3-0縫合線穿繞前降支中上1/3處放置硅膠管后一起結(jié)扎。心電圖顯示ST段明顯弓背向上抬高（≥0.2 mv），其供血區(qū)心肌顏色變暗。60 min后剪斷結(jié)扎線取出硅膠管，恢復(fù)前降支血流，心電圖顯示ST段回落1/2以上，標(biāo)志為再灌注成功，再灌注180 min。

3.標(biāo)本留?。悍謩e于缺血前、缺血60 min、再灌注60 min和再灌注180 min時抽取大白兔靜脈血2 ml，靜置后 4℃下離心（3 000 r/min）15 min，取上清液測定血清肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）含量。實驗結(jié)束后取結(jié)扎線下1 mm相同部位缺血區(qū)心肌組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋并切片，行HE染色以及采用免疫組織化學(xué)方法檢測缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、凋亡關(guān)鍵蛋白酶半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)水平。另取相同部位大小約1 mm×1 mm×1 mm缺血區(qū)心肌組織塊，放入預(yù)冷的2.5%戊二醛中4℃固定，待制作電鏡標(biāo)本。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：血清CK-MB值采用重復(fù)測量資料的方差分析，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)以及心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)的積分光密度采用單因素方差分析，運用SPSS 15.0軟件處理數(shù)據(jù)。以P＜0．05為差異顯著，以P＜0．01為差異非常顯著，均有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.心肌缺血再灌注過程中心電圖變化：持續(xù)心電監(jiān)測并記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，可見結(jié)扎兔冠狀動脈左前降支后，與缺血前（見圖1）相比，肢體Ⅱ?qū)?lián)ST段迅速弓背向上抬高（見圖2）；于缺血60 min時可見抬高的ST段與QRS波群融合，呈城垛型（見圖3）；再灌注后ST段下降（≥1/2），可見再灌注性心律失常（室速）（見圖4），標(biāo)志再灌注成功；再灌注60 min時ST段明顯下降，并出現(xiàn)病理性Q波；再灌注180 min時ST段已基本降至等電位線，T波倒置，病理性Q波持續(xù)存在。

圖1 正常心電圖

圖2 缺血5 min心電圖

圖3 缺血60 min心電圖

圖4 再灌注性心律失常（室速）

2.病理改變：（1）光鏡病理形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下可見MI/RI組大量心肌細(xì)胞空泡變性，心肌組織水腫，較多心肌凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮變小、胞漿嗜酸性變紅染、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對完整、大量炎性細(xì)胞浸潤等特征，正常心肌細(xì)胞存活明顯比rhEPO組少（見圖5）。rhEPO組少量心肌細(xì)胞空泡變性、心肌組織水腫輕，偶見心肌凋亡細(xì)胞，少見炎性細(xì)胞浸潤，大量正常心肌細(xì)胞尚存，病變程度較MI/RI組明顯減輕（見圖6）。

圖5 MI/RI組心肌HE染色（×400）

圖6 rhEPO組心肌HE染色（×400）

（2）電鏡病理形態(tài)學(xué)觀察：透射電鏡下可見 MI/RI組心肌中肌原纖維排列紊亂、部分肌絲溶解斷裂，肌節(jié)模糊，線粒體廣泛變性，表現(xiàn)為嵴排列紊亂，間隙加寬，甚至溶解、消失、線粒體空泡化；核旁線粒體輕度水腫，胞漿內(nèi)糖原顆粒顯著減少，細(xì)胞核形狀不規(guī)則、固縮，染色質(zhì)邊聚、凝結(jié)成塊狀等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（見圖7）。rhEPO組病變顯著減輕，肌原纖維排列較整齊，肌節(jié)較清晰，少量肌絲溶解，線粒體形態(tài)基本正常，核膜完整，染色質(zhì)密度有所增加、邊聚現(xiàn)象較少（見圖8）。

圖7 MI/RI組心肌結(jié)構(gòu)（TEM×15 000）

3.各組血清 CK-MB濃度變化：MI/RI組與rhEPO組血清CK-MB濃度均隨缺血及再灌注時間延長而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；缺血前rhEPO組與MI/RI組組血清CK-MB濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；缺血60 min、再灌注60 min、再灌注180 min時，rhEPO組血清CK-MB濃度均顯著低于 MI/RI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1。

4.TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果：凋亡心肌細(xì)胞的胞核呈深棕（褐）色，多位于梗死區(qū)中心及周邊，正常心肌細(xì)胞胞核為藍(lán)色。TUNEL結(jié)果顯示，MI/RI組心肌中可見大量凋亡細(xì)胞（見圖9），心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（52.91±6.83）%；rhEPO組心肌凋亡細(xì)胞較MI/RI組明顯減少 （見圖10），其心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（34.76±8.35）%，較 MI/RI組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（見表2）。

圖8 rhEPO組心肌結(jié)構(gòu)（TEM×15 000）

表1 血清CK-MB濃度變化（U/L±s）

表1 血清CK-MB濃度變化（U/L±s）

注：a與前一時間點比較，P＜0.01；b與同時段對照組比較，P＜0．01

組別 例數(shù) 缺血前 缺血60 min 再灌注60 min 再灌注180 min MI/RI組 8 660.08±148.86 2142.68±197.84a 3585.03±371.40a 4910.63±298.83arhEPO組 8 628.16±159.90 1519.94±220.95ab 2654.94±92.59ab 3887.11±155.79ab

圖9 MI/RI組TUNEL陽性細(xì)胞較多（×400）

圖10 EPO組TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少（×400）

表2 兩組心肌凋亡指數(shù)比較（%，±s）

表2 兩組心肌凋亡指數(shù)比較（%，±s）

注：a與 MI/RI組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)MI/RI組52.91±6.83 rhEPO組 8 34.76±8.35 8 a

5.Caspase-3蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果：Caspase-3蛋白陽性染色顆粒主要在細(xì)胞漿，也有少數(shù)在細(xì)胞核，呈黃色至棕褐色顆粒。MI/RI組陽性染色細(xì)胞顯著增加，多位于梗死區(qū)中心及周邊，與TUNEL法所示心肌細(xì)胞凋亡區(qū)域一致（見圖11），其Caspase-3蛋白表達(dá)為（4071.91±887.50）IOD；rhEPO組Caspase-3蛋白陽性染色的細(xì)胞較MI/RI組明顯減少（見圖12），其Caspase-3蛋白表達(dá)為（2669.61±82.67）IOD，較MI/RI組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（見表3）。

表3 兩組心肌Caspase-3表達(dá)積分光密度比較（IOD，±s）

表3 兩組心肌Caspase-3表達(dá)積分光密度比較（IOD，±s）

注：a與 MI/RI組比較，P＜0．01

組別 例數(shù) Caspase-3蛋白表達(dá)的積分光密度MI/RI組8 4071.91±887.50 rhEPO組 8 2669.61±82.67a

圖11 MI/RI組 Caspase-3蛋白陽性染色細(xì)胞較多（×400）

圖12 EPO組Caspase-3蛋白陽性染色細(xì)胞明顯減少（×400）

討 論

MI/RI會引起再灌注性損傷，主要表現(xiàn)為室性心動過速及心室顫動，心肌收縮、舒張功能障礙，心肌細(xì)胞壞死、凋亡等，另外可導(dǎo)致冠狀動脈血流中斷、冠狀動脈痙攣以及內(nèi)皮功能失調(diào)等。其機(jī)理復(fù)雜，涉及多個環(huán)節(jié)，隨著對心肌I/R損傷研究的深入，越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡是造成損傷的重要機(jī)制之一［8］。因此，抑制細(xì)胞凋亡可預(yù)防和減輕I/R損傷。

EPO是一種刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，天然存在的EPO主要來源于腎臟及胎肝，有α和β兩種類型，由193個氨基酸組成，分子量為34 kDa。成人EPO主要由腎臟皮質(zhì)髓質(zhì)交界處的腎小管旁細(xì)胞分泌。EPO在體內(nèi)不能儲存，主要由血氧含量的變化來調(diào)節(jié)其生成［9］。有關(guān)EPO治療心肌梗死效果的動物實驗結(jié)果表明，EPO可以改善心臟功能，減小梗死面積和增加毛細(xì)血管密度［10］。

本研究中，光鏡下可見：MI/RI組大量心肌細(xì)胞空泡變性，心肌組織水腫，較多的心肌凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核濃縮變小、胞漿嗜酸性變紅染、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對完整、大量炎性細(xì)胞浸潤等，正常心肌細(xì)胞存活明顯比EPO組少。EPO組少量心肌細(xì)胞空泡變性、心肌組織水腫輕，偶見心肌凋亡細(xì)胞，少見炎性細(xì)胞浸潤，大量正常心肌細(xì)胞尚存，病變程度明顯輕于MI/RI組。透射電鏡下可見：EPO組病變顯著減輕，肌原纖維排列較整齊，肌節(jié)較清晰，少量肌絲溶解，線粒體形態(tài)基本正常，核膜完整，染色質(zhì)密度有所增加，邊聚現(xiàn)象較少。以上所述均表明EPO能維護(hù)心肌組織細(xì)胞大體形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的完整性，對MI/RI損傷心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

EPO是細(xì)胞生長因子超家族成員之一，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病的細(xì)胞保護(hù)［5-7］。但EPO對心肌細(xì)胞的抗凋亡作用研究尚少。本實驗采用TUNEL檢測法直接顯示MI/RI中凋亡心肌細(xì)胞，結(jié)果表明缺血再灌注損傷的心肌確實存在心肌細(xì)胞凋亡，與既往研究相符［7］；MI/RI組心肌中可見大量凋亡心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（52.91±6.83）%，rhEPO組心肌凋亡細(xì)胞較 MI/RI組明顯減少，其心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（34.76±8.35）%，較 I/R組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。初步表明rhEP0具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

細(xì)胞凋亡涉及多種基因及其表達(dá)的復(fù)雜變化，其中，凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是Caspase家族的激活［11］。ICE/CED-3蛋白酶家族均具有半胱氨酸蛋白酶類和特異性酶切天門冬氨酸氨基位點兩大特點［12］。1996年 Alnemri等［13］將人類和哺乳動物ICE/CED-3蛋白酶統(tǒng)一命名為Caspase，其中最引人注目的是Caspase-3。普遍認(rèn)為Caspase-3是哺乳類動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。

本實驗采用Caspase-3蛋白表達(dá)的積分光密度來充分反應(yīng)其表達(dá)情況，積分光密度＝相同視野下陽性表達(dá)平均光密度×陽性表達(dá)總面積，既包含Caspase-3蛋白表達(dá)的強(qiáng)度信息，又包含Caspase-3蛋白表達(dá)的面積信息，因此，可以客觀精確地反應(yīng)Caspase-3蛋白表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，MI/RI組Caspase-3蛋白表達(dá)的積分光密度顯著高于rhEPO組Caspase-3蛋白表達(dá)的積分光密度；并且Caspase-3蛋白陽性表達(dá)心肌細(xì)胞多位于缺血區(qū)中心及周圍區(qū)域，這與TUNEL法顯示的細(xì)胞凋亡區(qū)域相同。說明rhEPO可通過降低Caspase-3表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而起到抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步證實了rhEPO對MI/RI心肌的保護(hù)作用。

綜上所述，rhEPO通過抑制細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用，從而對在體兔MI/RI發(fā)揮保護(hù)作用，rhEPO可能對防治MI/RI有一定的臨床應(yīng)用價值。

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Protective effects and mechanism s of recombinant human erythropoietin on myocardial ischem ia/reperfusion injury in rabbits

Pang Ying1，Liang Mingting1，Ma Jianqun2，Yang Yong1，Zhang Jing3．

1Department of Cardiology， Liaocheng People′ s Hospital， Liaocheng， 252000，China；2Department of Cardiology，The Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan，250031，China；3Department of Pediatrics，Shenxian People′s Hospital，Liaocheng，252000，China

Ma Jianqun，Email：mjianqun＠163．com

ObjectiveTo investigate the influence of Recombinant Human Erythropoietin（rhEPO）on cardiac myocyte apoptosis and the expressing level of Caspase-3 protease which is critical in apoptosis in Myocardial ischemia/reperfusion injury（MI/RI）rabbits in order to explore the protective effects of rhEPO on MI/RI rabbit and itsmechanisms of action.MethodsSixteen New Zealand rabbits were randomly divided into two groups：control group（MI/RI group）and drug group（rhEPO group）.Rabbits were subjected to descending coronary artery（LAD）occlusion to establish rabbit MI/RI models.When the left anterior descending coronary arteries were ligated，RhEPO（1 000 U/kg）were injected in rabbits of rhEPO group，the rabbits of control group were injected saline equivalently.Serum abstracted from the blood for testing the concentration of CK-MB at the following points：5 minutes before occlusion，60 minutes after occlusion，60 minutes and 180 minutes after reperfusion；At180 minutes after reperfusion，The apoptotic index of the corresponding ischemic myocardial cell and the level of Caspase-3 in ischemic region were tested；The specimens of lightmicroscope and electron microscopy were made to observe the general myocardial tissue morphosis and ultramicro organizational structure.ResultsThe Serum CK-MB concentration increasedgradually with protraction of the ischemia and reperfusion time（P＜0.01）.Before ischemia the serum CKMB concentration were no significant difference between rhEPO group and the MI/RIgroup（P＞0.05）.The increased level of CK-MB concentration in rhEPO group weremarkedly lower than those in the I/R group at 60 minutes after ischemia，60minutes after reperfusion and 180minutes after reperfusion.The differencewas statistically significant（P＜0.01）.Compared to the MI/RI group，both the ischemic myocardial apoptotic index and the expressing level of Caspase-3 in rhEPO group decreased significantly（P＜0.01）.The impaired changes of the generalmorphosis and the ultrastructure atMI/RIareas in the MI/RIgroup were severer than that in the rhEPO group.ConclusionRhEPO has visible protective effects on the MI/RI rabbits.The mechanism of cardioprotection may be associated with stabilizing themyocardium cellmembrane structure to decrease the release of myocardial enzyme and inhibit cardiac myocyte apoptosis.RhEPO can inhibit the cardiac myocyte apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury through downregulation of the Caspase-3 protein expression.

Recombinant Human Erythropoietin； Myocardial ischemia/reperfusion injury；Apoptosis； Caspase-3； Rabbit

10.3877/cma.j.issn.2095-6568.2017.01.001

252000 山東聊城，山東省聊城市人民醫(yī)院心內(nèi)科1；250031 山東濟(jì)南，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科2；252000 山東聊城，山東省莘縣人民醫(yī)院兒科3

馬建群，Email：mjianqun＠163.com