葉智衛(wèi) 蔡瑾 梅小剛 朱呂佶 高克加

上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 200002

在人們對(duì)自身健康、保健的意識(shí)不斷增強(qiáng)的現(xiàn)狀下，中、老人群中常見的疾病骨質(zhì)疏松癥也逐步出現(xiàn)增多趨勢[1-2]。不能夠早期診斷和及時(shí)干預(yù)治療，可發(fā)生各種嚴(yán)重的并發(fā)癥，并影響患者的生活質(zhì)量[3-5]。因此，關(guān)鍵在于早期的診斷方法和早期干預(yù)治療。

1 資料與方法

1.1 資料

制作骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)兔由上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供；動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)場所在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；核素骨骼顯像劑“99mTc-MDP”(锝-99m-亞甲基二膦酸鈉)由上海欣科藥業(yè)有限公司提供；治療藥物“99Tc-MDP”(锝-99-亞甲基二膦酸鈉)由成都云克藥業(yè)責(zé)任有限公司提供：其中A瓶為99Tc液(5.5 ug/5ml)，B瓶為MDP 5mg/瓶(用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨性疾病)；地塞米松磷酸鈉針劑(DX)5mg/1ml，上海信誼藥廠生產(chǎn)。儀器設(shè)備：骨密度測定儀(雙能X線骨密度儀LUNAR. DXP-L.USA)。骨生物力學(xué)測定(骨力學(xué)測試儀INSTRON-5543.USA)。核素骨骼顯像(SPECT Sopha DSX 法國產(chǎn))，使用低能通用平行孔準(zhǔn)直器。CT為飛利浦CT-SECURA，X線攝片、病理、骨形態(tài)計(jì)量檢測及生化儀均為常規(guī)設(shè)備。放射性標(biāo)準(zhǔn)源：Isotope Products Laboratories Radioactive Material(美國)Gd-153 100uCi(3.7MBq)取3枚(300 uCi)作為放射性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)源(radioactive standard source，RSF)。

1.2 方法

1.2.1制作兔模型的方法與分組：取健康新西蘭實(shí)驗(yàn)兔64只，平均體重(2.5±0.23)kg，采用肌肉注射DX誘導(dǎo)制作兔骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[6-7]。按隨機(jī)數(shù)字表形式安置實(shí)驗(yàn)兔并分為2個(gè)階段。(1)第1階段制作模型階段：將實(shí)驗(yàn)兔分為正常組(A組，16只)，肌肉注射0.9%注射用生理鹽水，用量為1 ml/kg；早期骨量減少模型組(B組，24只)，肌肉注射DX量為2 mg/kg，每周2次，時(shí)間為2 w，第3周開始肌肉注射DX 量為2 mg/kg，每周1次，以作維持；骨質(zhì)疏松模型組(C組，24只)，肌肉注射DX量為2 mg/kg，每周2次，模型制作時(shí)間為6 w。第7周處死A、B、C組各8只，進(jìn)行病理骨組織學(xué)、骨密度等各指標(biāo)比較，顯示正常組與早期骨量減少模型組、骨質(zhì)疏松模型組之間的差別，以證實(shí)模型成立。(2)第2階段將原A組余下的8只實(shí)驗(yàn)兔設(shè)為治療階段正常對(duì)照組(D組)，將B組余下的16只實(shí)驗(yàn)兔設(shè)為早期骨量減少模型對(duì)照組(E組)和早期骨量減少模型治療組(F組)，將C組余下的16只實(shí)驗(yàn)兔設(shè)為骨質(zhì)疏松模型對(duì)照組(G組)和骨質(zhì)疏松治療組(H組)。所有模型組實(shí)驗(yàn)兔注射DX量改為2 mg/kg，每周1次，維持模型至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，總觀察療程為14w。在治療結(jié)束時(shí)進(jìn)行核素“99mTc-MDP”骨骼顯像以及相關(guān)檢測。骨骼顯像條件采用低能高分辨平行孔準(zhǔn)直器，矩陣128×128，取靜態(tài)俯臥位，采集時(shí)間10min。F組、H組治療方法：采用非放射性核素藥物99Tc-MDP治療，用量參考臨床成人用量。將A瓶中99Tc液5ml注入B瓶內(nèi)，搖勻1min后，稀釋于0.9%注射用生理鹽水中，以0.2mg/(5ml·kg)的稀釋濃度對(duì)F組、H組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行耳靜脈推注治療，每周一次。

1.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察檢測指標(biāo)：核素骨骼掃描感興趣區(qū)(region of interest，ROI)值半定量測定、病理骨組織學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量、骨密度、生物力學(xué)試驗(yàn)、X線、CT攝片以及血清BALP、BGP等指標(biāo)，分析各組之間的差異和“99mTc-MDP”骨骼顯像的特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)兔的第1階段和第2階段結(jié)束后均取其腰椎、股骨頭及股骨行病理細(xì)胞學(xué)、骨形態(tài)計(jì)量(骨小梁體積%)、骨密度(分別采用整體股骨、單個(gè)椎體進(jìn)行檢測骨密度，g/cm2)、生物力學(xué)試驗(yàn)(分別以股骨三點(diǎn)彎曲、腰椎壓縮方法、最大壓縮載荷試驗(yàn)，單位為N)檢測。處死前進(jìn)行X線攝片、CT攝片、核素骨骼顯像ROI值[8](骨骼顯像取骨代謝功能變化明顯、攝取放射性相對(duì)最高的區(qū)域?yàn)楦邤z取ROI：第3腰椎、股骨頭、膝關(guān)節(jié)、股骨中段與攝取放射性與體外固定RSF進(jìn)行比值對(duì)照)。處死時(shí)取血清行BALP、BGP骨代謝指標(biāo)檢測。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)模型評(píng)判設(shè)想和療效評(píng)價(jià)

1.3.1模型評(píng)判：(1)正常組：病理骨細(xì)胞學(xué)骨小梁排列規(guī)則、均勻，無斷裂、無形態(tài)破壞，骨形態(tài)計(jì)量、骨密度、生物力學(xué)試驗(yàn)、X線、CT攝片、核素骨骼掃描以及血清BALP、BGP所取得的結(jié)果為相對(duì)正常對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)；(2)早期骨量減少組：病理骨細(xì)胞學(xué)骨小梁輕度變細(xì)，排列較均勻，但無破壞形態(tài)，骨形態(tài)計(jì)量、骨密度、骨力學(xué)、X線、CT攝片與正常對(duì)照組比較應(yīng)變化不明顯，但核素骨骼顯像ROI比值和血清BALP、BGP升高；(3)骨質(zhì)疏松組：病理骨細(xì)胞學(xué)骨小梁排列不規(guī)則、明顯稀疏，存在骨小梁斷裂現(xiàn)象，骨形態(tài)計(jì)量、骨密度、生物力學(xué)降低明顯，核素骨骼顯像ROI比值與正常組比較明顯增高，血清BALP、BGP升高，X線、CT攝片隱見骨小梁存在稀疏現(xiàn)象。

1.3.2相對(duì)療效的評(píng)判：根據(jù)骨細(xì)胞學(xué)、骨密度、骨形態(tài)計(jì)量上升或下降，結(jié)合對(duì)早期骨量減少敏感指標(biāo)核素“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值結(jié)果的增高或降低，同時(shí)觀察X線、CT攝片的骨小梁密度增加或稀疏以及血清BALP、BGP的變化相對(duì)區(qū)分為治療顯效、有效和無效。(1)顯效：F組在E組模型的基礎(chǔ)上，病理骨細(xì)胞學(xué)接近正常對(duì)照組，核素骨骼顯像ROI比值降低、血清BALP、BGP在原來的基礎(chǔ)上有所降低；H組在G組模型的基礎(chǔ)上，病理骨細(xì)胞學(xué)在骨小梁斷裂、破壞狀態(tài)有所修復(fù)，骨小梁增多、增粗，骨密度、骨形態(tài)計(jì)量增加>5%，生物力學(xué)升高、核素骨骼顯像ROI比值降低>5%，血清BALP、BGP在原來的基礎(chǔ)上降低>15%，X線、CT攝片骨質(zhì)密度有所改善；(2)有效：F組在E組的基礎(chǔ)上略有改善，而H組在對(duì)應(yīng)模型的基礎(chǔ)上，主要指標(biāo)中有一項(xiàng)改善，病理骨細(xì)胞學(xué)骨小梁增粗，排列及密度有所升高，斷裂、破壞形態(tài)得到修復(fù)，骨密度、骨形態(tài)計(jì)量、生物力學(xué)升高<5%，>0%，核素骨骼顯像ROI比值降低<5%，>0%，血清BALP、BGP在原來的基礎(chǔ)上降低<15%，>0%，X線、CT攝片基本無改變；(3)無效：F組和H組在病理骨細(xì)胞學(xué)無改變，H組骨小梁斷裂明顯，呈骨破壞形態(tài)。骨密度、骨形態(tài)計(jì)量、生物力學(xué)、核素骨骼顯像ROI比值、血清BALP、BGP、X線、CT攝片在原來的基礎(chǔ)上沒有改變或加重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

在第1階段制作模型結(jié)束，病理檢查結(jié)果顯示：A組股骨頭或腰椎的骨小梁排列規(guī)則，分布均勻，骨組織和關(guān)節(jié)表面未見骨質(zhì)破壞；而C組則表現(xiàn)為軟骨破壞，骨小梁稀疏、斷裂，骨母細(xì)胞消失等明顯骨破壞現(xiàn)象；早期骨量減少模型組(B組)則表現(xiàn)為骨小梁存在略有變細(xì)，也無斷裂現(xiàn)象。3組實(shí)驗(yàn)兔“99mTc-MDP”骨骼顯像結(jié)果均存在差異，與外界固定RSF的比值更能顯示差異(見表1)。

表13組實(shí)驗(yàn)兔的相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果
Table1Results of the test index in the three groups of experimental rabbits

組別左股骨頭骨密度(g/cm2)第4腰椎骨密度(g/cm2)左股骨頭骨力學(xué)(N)第4腰椎骨力學(xué)(N)骨形態(tài)計(jì)量(%)血清BALP(30～120IU/L)血清BGP(0 5～5 0ng/ml)第3腰椎放射性/標(biāo)準(zhǔn)源股骨頭放射性/標(biāo)準(zhǔn)源膝關(guān)節(jié)放射性/標(biāo)準(zhǔn)源股骨中段放射性/標(biāo)準(zhǔn)源A組(n=8)0 294±0 016⊕0 302±0 021⊕405 341±51 300﹡⊕750 875±82 733﹡⊕131 501±27 225⊕12 375±4 391﹡⊕115 296±16 595﹡⊕2 976±0 403﹡⊕2 949±0 393﹡⊕2 863±0 457﹡⊕1 346±0 172B組(n=8)0 287±0 277﹟0 290±0 036﹟338 200±51 623﹡﹟493 729±72 541﹡﹟126 786±18 629﹟18 571±6 872﹡﹟138 080±17 823﹡﹟4 165±0 585﹡﹟4 208±0 329﹡﹟4 115±0 286﹡﹟1 047±0 121C組(n=8)0 238±0 150﹟⊕0 236±0 152﹟⊕265 914±48 859﹟⊕369 671±57 658﹟⊕66 230±10 043﹟⊕45 000±6 771﹟⊕168 080±16 139﹟⊕4 845±0 475﹟⊕5 445±0 942﹟⊕5 189±1 083﹟⊕1 740±0 333

注：t檢驗(yàn)顯示：﹡、﹟、?為組與組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

B、C組與A組之間“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但A組與B組間在骨密度、骨形態(tài)計(jì)量指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但骨力學(xué)和血清BALP、BGP之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與C組間骨密度、骨形態(tài)計(jì)量、骨生物力學(xué)、血清BALP、BGP檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此實(shí)驗(yàn)兔輕度骨質(zhì)疏松模型和骨質(zhì)疏松模型成立。

第2階段，經(jīng)14 w治療和觀察，可見D、E、G組3組骨組織病理切片、骨密度等指標(biāo)檢測結(jié)果分別與制模6w時(shí)的A、B、C組的結(jié)果基本相似。經(jīng)過干預(yù)治療后，F(xiàn)組在E組的基礎(chǔ)上骨病理學(xué)顯示：股骨頭的骨小梁排列基本規(guī)則，骨小梁有所增粗；而H組在G組的基礎(chǔ)上，骨病理則表現(xiàn)為骨小梁略有增粗，骨小梁粗細(xì)不均勻，但無斷裂現(xiàn)象(見圖1)。

圖1 各階段實(shí)驗(yàn)兔股骨頭組織病理學(xué)骨小梁的變化(HE染色，10×40)。A：正常組；B：早期骨量減少組；C：骨質(zhì)疏松組；D：早期骨量減少治療組；E：骨質(zhì)疏松治療組Fig.1 The change of the trabecular bone of the femoral head in different stages (HE staining, 10×40). A：Normal group；B：Early bone reduction group；C：Osteoporosis group；D：Early bone reduce treatment group；E：Osteoporosis treatment group

經(jīng)治療后，“99mTc-MDP”骨骼顯像ROI比值也出現(xiàn)降低(見圖2)，骨密度、骨形態(tài)計(jì)量、骨生物力學(xué)、血清ALP、BGP檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)組、H組分別在E、G組的基礎(chǔ)上得到了改善，F(xiàn)組各項(xiàng)指標(biāo)接近于D組，而H組尚不能達(dá)到D組的水平。以骨生物力學(xué)升高明顯(見表2)。

圖2 各階段實(shí)驗(yàn)兔核素骨顯像的變化。顯示各組實(shí)驗(yàn)兔骨骼對(duì)放射性骨顯像劑“99mTc-MDP”攝取量程度不一樣，E、F組的股骨頭、膝關(guān)節(jié)攝取99mTc-MDP明顯增高(P<0.05)。A：正常組；B：早期骨量減少組；C：骨質(zhì)疏松組；D：早期骨量減少治療組；E：骨質(zhì)疏松治療組Fig.2 Changes in radionuclide bone imaging in rabbits at different stages. The experimental results show that the intake of radioactive bone imaging agent “99mTc-MDP” is not the same in each group. The intake of 99mTc-MDP significantly increased the femoral head and knee joint in E and F group (P<0.05). A：Normal group；B：Early bone reduction group；C：Osteoporosis group；D：Early bone reduce treatment group；E：Osteoporosis treatment group

表2 治療14 w后F組、H組與其他各組的實(shí)驗(yàn)室檢測比較Table 2 Comparison of laboratory indexes between F, H groups and other groups after 14-week treatment

注：經(jīng)抗骨質(zhì)疏松治療的F、H組分別與相應(yīng)對(duì)照組E、G組相比較，療效明顯(P<0.05)。

表2顯示，F(xiàn)、H組分別在E、G組的基礎(chǔ)上各項(xiàng)檢測指標(biāo)得到不同程度的改善，而與D組比較，F(xiàn)、H組分別在股骨頭骨密度差異為1.33%(P>0.05)和9.27%(P<0.05)；椎體骨密度差異為0.33%(P>0.05)和9.45%(P<0.05)；股骨頭生物力學(xué)差異為2.47%(P<0.05)和15.91%(P<0.05)；椎體生物力學(xué)差異為1.44%(P<0.05)和10.03%(P<0.05)；骨形態(tài)計(jì)量差異為1.64%(P>0.05)和25.27%(P<0.05)；核素骨骼顯像ROI比值差異為21.94%(P<0.05)和55.76%(P<0.05)；血清BALP差異為25%(P<0.05)和147.62%(P<0.05)，BGP降低4.54%(P<0.05)和16.99%(P<0.05)。F組與H組比較各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相對(duì)療效的評(píng)判均為顯效，以F組更明顯。但X線、CT攝片改變不明顯，可能與動(dòng)物模型較小有關(guān)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的診斷目前主要是依靠骨密度儀檢測。但是，骨密度的檢測范圍值是在一定數(shù)量人群的統(tǒng)計(jì)均值，也僅是一個(gè)參考值[9-11]，對(duì)于不同種族、不同地區(qū)、不同的生活習(xí)慣、從事不同工種以及個(gè)體差異等的因素與骨密度的參考值存在差異，如何克服各種因素及個(gè)體差異，能夠早期評(píng)估骨質(zhì)疏松(早期骨量減少)將是有益于臨床早期判斷個(gè)體的骨吸收已經(jīng)開始和防治的關(guān)鍵。

核素骨骼顯像是一種利用與骨組織存在特異親合力的顯像劑，在短時(shí)間內(nèi)到達(dá)全身骨組織參與骨代謝并能夠顯示骨組織成骨功能的變化，提示異常骨鈣流失的功能診斷技術(shù)。骨骼顯像劑“99mTc-MDP”屬一種雙膦酸鹽類的化合物，進(jìn)入人體后能夠馬上吸附在骨組織的羥基磷灰石表面[12]，當(dāng)骨鈣流失加快、成骨功能相對(duì)增強(qiáng)時(shí)，該部位骨組織攝取“99mTc-MDP”即增加，能較直觀、及時(shí)地反映骨組織功能代謝的現(xiàn)狀[13-14]，因此，不論種族、生活習(xí)慣、職業(yè)等，在早期骨量減少時(shí)，尚未發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)結(jié)構(gòu)(骨密度)明顯改變或只要出現(xiàn)骨鈣流失加快、成骨功能相對(duì)增強(qiáng)時(shí)，“99mTc-MDP”骨顯像即能夠表現(xiàn)為骨組織代謝增強(qiáng)，動(dòng)物模型可見早期骨量減少組和骨質(zhì)疏松組骨顯像結(jié)果即如此。當(dāng)早期骨量減少，骨密度改變不明顯時(shí)，“99mTc-MDP”骨顯像即能發(fā)現(xiàn)骨組織代謝異常，是早期骨量減少的診斷提供依據(jù)。

治療藥物“99Tc-MDP”與核素骨骼顯像劑“99mTc-MDP”的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但其物理性質(zhì)不同，僅在化學(xué)結(jié)構(gòu)上少一個(gè)“m”，沒有“m”即不含放射性，是一種治療骨質(zhì)疏松的雙膦酸鹽藥物，但二者在聚集到骨質(zhì)損傷或破壞部位的羥基磷灰石表面的生理作用相同，也是一種靶向性治療藥物。當(dāng)骨質(zhì)疏松部位骨組織攝取骨骼顯像劑“99mTc-MDP”增加時(shí)，同樣攝取治療性藥物“99Tc-MDP”也增加，起到抑制骨吸收作用外，同時(shí)還存在調(diào)節(jié)免疫功能，保護(hù)過氧化歧酶(SOD)的活力，防止自由基對(duì)組織的破壞，并對(duì)炎性介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子白介素Ⅰ(IL-1)的產(chǎn)生有抑制作用[15-16]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，早期骨量減少的F組經(jīng)治療性藥物“99Tc-MDP”治療后，療效明顯優(yōu)于骨質(zhì)疏松的H組。由此可見，核素99mTc-MDP骨骼顯像對(duì)早期成骨性骨代謝異常敏感性強(qiáng)。另顯示在早期骨量減少期給予早期干預(yù)治療將得到更滿意的療效。