郭家雁，張霞，丁喜蓮，李娟，鄧莉，陳全家，孫國清，曲延英*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

不同處理誘導(dǎo)新海16號體細胞胚胎同步化發(fā)生

郭家雁1，張霞1，丁喜蓮1，李娟1，鄧莉1，陳全家1，孫國清2*，曲延英1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院／農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

【目的】旨在探索誘導(dǎo)海島棉體細胞胚胎同步化發(fā)生的有效方法?！痉椒ā恳院u棉品種新海16號的胚性愈傷組織為材料，研究了低溫、饑餓和滲透處理誘導(dǎo)體細胞胚胎同步化發(fā)生的效果?！窘Y(jié)果】在低溫處理組中，4℃誘導(dǎo)時體細胞胚胎發(fā)生的數(shù)量隨著低溫誘導(dǎo)時間的延長而顯著增加；10℃誘導(dǎo)時，不同誘導(dǎo)時間下各處理體細胞胚胎發(fā)生的數(shù)量差異不顯著，但都顯著高于對照（28℃）；缺磷、缺氮、缺肌醇3種饑餓處理的體細胞胚胎的數(shù)量都隨著處理時間的延長而減少；滲透處理組中，在含40 g·L－1葡萄糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)7 d的效果最佳?！窘Y(jié)論】4℃處理3 d、缺磷處理5 d、缺氮處理5 d以及40 g·L－1葡萄糖誘導(dǎo)7 d可以顯著促進新海16號的體細胞胚胎同步化發(fā)生，其中4℃處理3 d的誘導(dǎo)效果最佳。

海島棉；體細胞胚胎；誘導(dǎo)；同步化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是在棉花的遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用較多的方法，但是這種方法需要1套高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)（簡稱“組培”）再生體系作支撐，以便為遺傳轉(zhuǎn)化提供大量優(yōu)質(zhì)的受體材料[1]。

棉花組培再生的相關(guān)報道始見于20世紀70年代[2]，至今已經(jīng)有多個種類的棉屬植物通過組培途徑獲得了再生植株，其中以陸地棉品種居多[3]；海島棉品種僅占20%左右[4]，屬于較難組培再生的棉花種類[5]。新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室研究建立了包括新海16號在內(nèi)的多個海島棉品種的組培再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)開展海島棉轉(zhuǎn)基因工作打下了良好基礎(chǔ)[4,6-8]。但是在已經(jīng)建立的海島棉再生體系中仍然存在諸多亟待改良的技術(shù)難點，體細胞胚胎發(fā)生的不同步就是其中之一。

體細胞胚胎（又叫體胚、胚狀體等）發(fā)生是海島棉組培再生的重要環(huán)節(jié)[9]，建立1套高頻、同步化的體胚發(fā)生體系對于深入研究海島棉體胚的發(fā)育機理、獲得生長整齊的轉(zhuǎn)基因植株、擴大生產(chǎn)規(guī)模等均有重要意義[10]。

目前，已有關(guān)于鋪墊濾紙[11]、肌醇饑餓[12]對陸地棉體胚同步化發(fā)生影響的研究，但關(guān)于海島棉體胚同步化誘導(dǎo)的研究鮮有報道。在其他植物的相關(guān)研究中，已報道的方法有蔗糖梯度密度離心、饑餓培養(yǎng)、添加植物生長調(diào)節(jié)劑以及使用藥物短暫阻斷細胞分裂周期[13-19]等。這些方法各有利弊：有的誘導(dǎo)效率較低；有的則步驟繁瑣，容易造成污染；還有的則可能毒害細胞，引起遺傳變異甚至致死[20]。因此，本試驗考慮降低材料突變概率、批量處理的可操作性以及保證操作人員安全等方面的因素，選擇通過低溫、饑餓和改變培養(yǎng)基滲透壓這3種方法誘導(dǎo)海島棉的體胚同步化發(fā)生，為今后開展海島棉轉(zhuǎn)基因工作以及海島棉體胚發(fā)育機理研究打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用新海16號胚性愈傷組織由新海16號的下胚軸誘導(dǎo)獲得，誘導(dǎo)方法參見文獻[8]。材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)條件

組織培養(yǎng)間溫度為（28±2）℃，光照周期為光照16 h、黑暗8 h。

用于誘導(dǎo)體胚的胚性愈傷組織初時接種于固體MSB培養(yǎng)基上，MSB的配制參考賀雅婷[7]的方法，其中各成分質(zhì)量濃度分別為葡萄糖30g·L－1，硝酸鉀3.8 g·L－1，硝酸銨1.65 g·L－1，磷酸二氫鉀0.17 g·L－1，肌醇0.1 g·L－1。

1.3 試驗方法

1.3.1預(yù)處理。為了獲得體積相近、受誘導(dǎo)程度相似的胚性愈傷組織，在同步化誘導(dǎo)之前先進行懸浮預(yù)處理：取生長旺盛，色澤淡黃、疏松的胚性愈傷組織作為材料于28℃，105 r·min－1搖床上培養(yǎng)2 d，使團塊充分分散[21]。之后將含有胚性愈傷組織的培養(yǎng)液分別過10目（孔徑2 mm）和18目（孔徑1 mm）的細胞篩，選取10目篩下、18目篩上的、體積相近的胚性愈傷組織做誘導(dǎo)處理。

?。?.10±0.05）g（鮮物質(zhì)質(zhì)量）經(jīng)過預(yù)處理的胚性愈傷組織，接種到1個培養(yǎng)瓶中，作為1次重復(fù)，用電子天平稱取初始接種量（g）并記錄。

1.3.2低溫誘導(dǎo)。為了觀察不同的低溫水平以及低溫誘導(dǎo)的時間對體胚同步化發(fā)生的影響，試驗設(shè)4℃和10℃兩個低溫水平，將經(jīng)過預(yù)處理并稱量后的胚性愈傷組織在相應(yīng)的低溫水平下分別誘導(dǎo)處理1、2、3 d，每處理設(shè)8次重復(fù)，誘導(dǎo)完成后轉(zhuǎn)回正常條件下培養(yǎng)。對照培養(yǎng)溫度為28℃。

1.3.3饑餓誘導(dǎo)。饑餓誘導(dǎo)分為培養(yǎng)基中缺磷、缺氮和缺肌醇3個處理，誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分變化如下：（1）缺磷培養(yǎng)基：除去固體MSB培養(yǎng)基中的磷酸鹽（磷酸二氫鉀），以氯化鉀補足磷酸二氫鉀中的鉀離子（以物質(zhì)的量計），防止造成鉀缺乏；（2）缺氮培養(yǎng)基：除去固體MSB培養(yǎng)基中的硝酸銨和硝酸鉀，并以氯化鉀補足硝酸鉀中的鉀離子（以物質(zhì)的量計），防止缺鉀；（3）缺肌醇培養(yǎng)基：除去固體MSB培養(yǎng)基中的肌醇。

將預(yù)處理和稱量后的胚性愈傷組織接種于不同的饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在每種培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)5、7、9、11 d，以觀察不同誘導(dǎo)時間對體胚同步化發(fā)生的影響，每處理8次重復(fù)，誘導(dǎo)完成后轉(zhuǎn)回正常條件下培養(yǎng)。對照組在正常固體MSB上培養(yǎng)。

1.3.4滲透誘導(dǎo)。試驗以葡萄糖作為滲透調(diào)節(jié)劑，通過改變培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量濃度從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。試驗設(shè)置20 g·L－1、40 g·L－1、50 g·L－1共3個葡萄糖質(zhì)量濃度水平，胚性愈傷組織在每種培養(yǎng)基上分別進行5、7、9、11 d的誘導(dǎo)處理，以觀察不同誘導(dǎo)時間對同步化的影響，每處理8次重復(fù)，完成誘導(dǎo)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)回正常條件下培養(yǎng)。對照在正常的固體MSB上培養(yǎng)。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)處理完成后轉(zhuǎn)回正常條件下培養(yǎng)的第1個繼代周期（20 d）中，經(jīng)過誘導(dǎo)處理的胚性愈傷組織中沒有可辨認的體胚出現(xiàn)；而在第2個繼代周期，經(jīng)過誘導(dǎo)處理的胚性愈傷組織集中分化出體胚，表現(xiàn)出同步化效應(yīng)。由于同步化的目的在于一段時間內(nèi)集中收獲體胚，因此，本試驗采用第2個繼代周期的體胚數(shù)量作為研究同步化效應(yīng)的依據(jù)，所列處理結(jié)果均為誘導(dǎo)處理后第2次繼代培養(yǎng)20 d時統(tǒng)計的數(shù)據(jù)。

在1個培養(yǎng)周期（20 d）結(jié)束時，統(tǒng)計誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚的數(shù)量（胚性愈傷組織和體胚的形態(tài)區(qū)分參見曹景林[11]），結(jié)合對應(yīng)的初始接種量，計算出單位質(zhì)量（g）胚性愈傷組織發(fā)生的體胚的數(shù)量。

應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件分析數(shù)據(jù)及繪圖。利用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進行方差分析，并用Duncan's新復(fù)極差法進行多重比較，檢驗誘導(dǎo)效果之間的差異。對于出現(xiàn)0.00值的處理組，先做對數(shù)轉(zhuǎn)換，然后再進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理

低溫誘導(dǎo)時間為1 d時，4℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量與對照（28℃）沒有顯著差異，10℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量則顯著多于前兩者（圖1）。當(dāng)誘導(dǎo)時間為2 d時，4℃、10℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量沒有顯著差異，但二者的誘導(dǎo)結(jié)果均顯著高于對照。誘導(dǎo)時間達到3 d時，4℃誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量顯著高于10℃處理和對照組。

圖1 低溫誘導(dǎo)新海16號體胚同步化發(fā)生的效應(yīng)比較Fig.1 Comparison of the synchronization effects induced by low temperature

從同一溫度水平來看，4℃條件下，隨著處理時間的延長，體胚的數(shù)量顯著增加；而10℃處理1、2、3 d的體胚數(shù)量差異并不顯著，但都顯著高于對照。

總體來看，4℃誘導(dǎo)3 d得到的體胚數(shù)量顯著多于其他處理，是低溫處理組中的最佳組合。

2.2 饑餓處理

饑餓誘導(dǎo)時間為5 d時，缺磷誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量比其他條件下的更多，且差異顯著；缺氮誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量也顯著地多于對照和缺肌醇處理組（圖2）。饑餓誘導(dǎo)7 d時，缺磷和缺氮處理的體胚數(shù)量與對照均沒有顯著差異，而缺肌醇處理的結(jié)果顯著低于對照。饑餓誘導(dǎo)9 d時，缺磷、缺氮和缺肌醇誘導(dǎo)出的體胚顯著少于對照。當(dāng)饑餓誘導(dǎo)時間達到11 d時，缺磷和缺氮處理后的胚性愈傷組織在轉(zhuǎn)回正常培養(yǎng)基進行后續(xù)培養(yǎng)時，組織顏色逐漸變灰白，長勢較弱，在統(tǒng)計時沒有體胚出現(xiàn)并且有少量愈傷組織褐化死亡；缺肌醇處理尚有少量體胚出現(xiàn)，但其數(shù)量顯著少于對照。

從相同的饑餓處理、不同誘導(dǎo)時間來看，缺磷、缺氮、缺肌醇3種處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量都隨著處理時間的延長而減少。

總體來看，缺磷誘導(dǎo)5 d、缺氮誘導(dǎo)5 d產(chǎn)生的體胚數(shù)量顯著高于對照和其他處理，是饑餓處理組內(nèi)較好的組合，其中缺磷誘導(dǎo)5 d是本組處理中的最佳組合。

2.3 滲透處理

統(tǒng)計分析顯示，當(dāng)誘導(dǎo)時間為5 d時，處理B誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量顯著多于對照和其他處理，處理C的與對照差異不顯著，處理D的顯著低于對照（圖3）。當(dāng)誘導(dǎo)時間為7 d時，處理C誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚數(shù)量比其他處理都多，且差異顯著；處理B和D的顯著少于對照。誘導(dǎo)時間為9 d時，與對照相比，其他3個處理的體胚數(shù)量都顯著減少，三者間的差異也都達到了顯著水平。當(dāng)誘導(dǎo)時間延長至11 d時，處理B和D都沒有體胚出現(xiàn)，處理C誘導(dǎo)出的體胚也比對照顯著減少。

在含20 g·L－1葡萄糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)11 d以及在含50 g·L－1葡萄糖的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)9 d后的胚性愈傷組織，在轉(zhuǎn)回正常培養(yǎng)基后均生長緩慢，顏色逐漸轉(zhuǎn)為灰白，到統(tǒng)計時沒有觀察到體胚，部分愈傷組織褐化死亡。在50 g·L－1葡萄糖條件下誘導(dǎo)11 d的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)回到正常培養(yǎng)基后1周左右，即出現(xiàn)大量胚性愈傷組織褐化的情況，到第1次繼代時即完全死亡（圖4-f）。

從相同葡萄糖濃度水平來看，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為20和50 g·L－1時，誘導(dǎo)出的體胚的數(shù)量隨著誘導(dǎo)時間的延長而減少。

圖2 饑餓處理誘導(dǎo)新海16號體胚同步化發(fā)生的效果Fig.2 Synchronization of Xinhai 16 somatic embryogenesis induced by starvation

總體來看，在40 g·L－1葡萄糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)7 d是本處理組中的最佳組合。

2.4 各種處理最佳組合誘導(dǎo)體胚同步化發(fā)生的效果比較

如圖5所示，4℃誘導(dǎo)3 d的體胚數(shù)量顯著高于其他處理，為本研究的最佳組合。

3 討論

為解決體胚發(fā)生的不同步問題，研究者嘗試了多種方法。曹景林[11]報道了在培養(yǎng)基表面鋪墊濾紙，可以顯著促進陸地棉體胚的同步化發(fā)生。本實驗室在海島棉的體胚誘導(dǎo)階段也一直采用在培養(yǎng)基表面鋪墊濾紙的方式進行培養(yǎng)，以改善胚性愈傷組織的通氣情況[22]。本研究所有處理的固體培養(yǎng)基都鋪墊了濾紙，結(jié)果表明一定的低溫、饑餓或者滲透處理誘導(dǎo)海島棉體胚同步化發(fā)生的效應(yīng)顯著優(yōu)于僅在培養(yǎng)基表面鋪墊濾紙的效應(yīng)。

圖3 滲透處理誘導(dǎo)新海16號體胚同步化發(fā)生的效果Fig.3 Synchronization of Xinhai 16 somatic embryogenesis induced by different osmotic pressure

本研究結(jié)果表明，適度低溫處理對誘導(dǎo)新海16號的體胚同步化發(fā)生有顯著的促進效應(yīng)，這與許多研究的結(jié)果相同，如針對紅豆杉、枸杞、半夏、蠶豆和小麥[16-18,23-24]的研究均發(fā)現(xiàn)低溫脅迫有提高細胞同步分裂及體胚同步化發(fā)生的效果。低溫促進體胚同步化發(fā)生的原因可能是低溫使細胞的分裂進程被阻滯在一定時期，在恢復(fù)正常培養(yǎng)溫度后，大量細胞從相近的階段開始繼續(xù)細胞分裂，從而達到同步化的目的[25]。

饑餓誘導(dǎo)促使細胞分裂趨于同步化的原理與低溫誘導(dǎo)相似，當(dāng)細胞處于氮素饑餓時，可獲得G1期的同步化細胞，而處于磷和碳饑餓時，?？色@得G1和G2期的同步化細胞[26]。Kumar等[12]報道了肌醇饑餓可以促進陸地棉的體胚同步化發(fā)生，其作用可能與抑制了植物體內(nèi)磷酸肌醇的合成有關(guān)。本研究中，磷和氮饑餓誘導(dǎo)5 d都表現(xiàn)出了促進體胚同步化發(fā)生的效應(yīng)，但肌醇饑餓沒有表現(xiàn)出該效應(yīng)。滲透脅迫誘導(dǎo)植物體胚發(fā)生已在多種植物培養(yǎng)中有報道[27]，但其機理不明確。本研究以葡萄糖作為滲透調(diào)節(jié)劑進行脅迫，對新海16號體胚同步化發(fā)生的誘導(dǎo)效應(yīng)不如其他2組處理顯著。今后可以嘗試更換滲透調(diào)節(jié)劑。

作者經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織在同步化誘導(dǎo)處理后的第1次繼代培養(yǎng)期間沒有分化出可見的體胚，而對照組則始終有體胚發(fā)生。這可能是由于誘導(dǎo)處理對胚性愈傷組織的生長形成脅迫，暫時抑制了其發(fā)育所致；而到第2個繼代周期，隨著抑制效應(yīng)逐漸解除，體胚開始集中形成，表現(xiàn)出同步化誘導(dǎo)效應(yīng)。

圖4 不同處理誘導(dǎo)新海16號體胚同步化發(fā)生Fig.4 Synchronization of somatic embryogenesis of Xinhai 16 induced by different treatments

4 結(jié)論

4℃誘導(dǎo)3 d、缺磷誘導(dǎo)5 d、缺氮誘導(dǎo)5 d和40 g·L－1葡萄糖誘導(dǎo)7 d在各自的處理組中表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效應(yīng)，其中4℃誘導(dǎo)3 d后產(chǎn)生的體胚數(shù)量最多，對于新海16號的體胚同步化發(fā)生有最佳誘導(dǎo)效果。

圖5 誘導(dǎo)新海16號體胚同步化發(fā)生的最佳處理效應(yīng)Fig.5 Effects comparison of four treatments on inducing synchronization of somatic embryogenesis of Xinhai 16

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Synchronized Somatic Embryogenesis of'Xinhai 16'Induced by Different Treatments

Guo Jiayan1,Zhang Xia1,Ding Xilian1,Li Juan1,Deng Li1,Chen Quanjia1,Sun Guoqing2*,Qu Yanying1*
(1.College of Agriculture/Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,China;2.Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China)

[Objective]The aim of this study was to develop an efficient method for synchronizing the somatic embryogenesis ofGossypium barbadenseL.[Method]We attempted to synchronize the somatic embryogenesis ofG.barbadenseL.cv.'Xinhai 16' embryonic calli.The somatic embryos induced by low temperature,starvation,and osmotic pressure were counted and analyzed.[Result]In the low-temperature treatment group,the number of somatic embryos increased significantly at 4℃.While,there were no significant differences in the number of somatic embryos between treatment times at 10℃.Nevertheless,more somatic embryos were produced at 10℃than at 28℃ (control temperature).Somatic embryogenesis was inhibited by the nutrient starvation treatment(i.e.,phosphate,nitrogen,or inositol deficiency).In the osmotic stress group,the best results were observed following a 7-day culture in medium containing 40 g·L-1glucose.[Conclusion]'Xinhai 16'somatic embryogenesis can be synchronized by incubating calli at 4℃for 3 days,simulating phosphate or nitrogen starvation conditions for 5 days,or maintaining calli in a medium containing 40 g·L-1glucose for 7 days.The low-temperature treatment may provide optimal synchronization conditions.

Gossypium barbadenseL.;somatic embryogenesis;inducement;synchronization

S562.01

A

1002-7807(2017)04-0385-08

10.11963/1002-7807.gjyqyy.20170531

2017-01-19

郭家雁（1983―），女，碩士研究生，gjy1311@126.com。*通信作者：孫國清，sunguoqing1120@126.com；曲延英，xjyyq5322@126.com

國家自然科學(xué)基金（31660078）；棉花生物學(xué)國家重點實驗室開放課題基金（CB2015A24）