孔德培，屈凌波，張雪妍，劉記，王鵬，李付廣*

（1.河南工業(yè)大學／生物工程學院，鄭州450001；2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所／棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

亞洲棉EMS誘變條件優(yōu)化與突變體篩選

孔德培1,2，屈凌波1，張雪妍2，劉記2，王鵬2，李付廣2*

（1.河南工業(yè)大學／生物工程學院，鄭州450001；2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所／棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

【目的】明確適于亞洲棉誘變的甲基磺酸乙酯（EMS）最佳濃度和處理時間，創(chuàng)制優(yōu)異亞洲棉突變體?！痉椒ā坑皿w積分數(shù)0.4%～1.5%EMS溶液浸泡處理亞洲棉石系亞1號種子4～8 h，分析不同時間、不同濃度的EMS溶液處理對石系亞1號種子萌發(fā)和生長的影響，并對M1、M2代突變株的形態(tài)學特征進行了初步鑒定?！窘Y(jié)果】0.6%EMS溶液處理8 h，石系亞1號種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別為51%、18.84，誘變效果最佳。以該參數(shù)大規(guī)模誘變處理約23 000粒石系亞1號種子，共篩選獲得M1代變異材料5559株，突變頻率為48.37%；M2代變異材料825份，突變頻率為14.17%，其中葉型、株型的突變頻率最高，分別為8.0%，5.9%；M3代變異株系57個，變異性狀遺傳頻率為31.30%，M3代新增突變頻率為18.26%?！窘Y(jié)論】本研究建立了亞洲棉種子EMS誘變體系，構(gòu)建了亞洲棉石系亞1號M2突變?nèi)后w，獲得了36份可穩(wěn)定遺傳的突變體株系，為棉花功能基因組研究奠定了材料基礎。

甲基磺酸乙酯；亞洲棉；突變體庫；變異性狀；石系亞1號

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，棉花產(chǎn)業(yè)在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位。2015年，我國植棉面積287.3萬hm2，約占世界總面積的12.9%；平均總產(chǎn)量 648萬 t，占世界總產(chǎn)的24.8%，在世界棉花生產(chǎn)和國際貿(mào)易中占有重要地位[1]。但植棉機械化程度低，棉花品種抗病、抗逆性差，纖維品質(zhì)差等因素一直制約著我國棉花生產(chǎn)發(fā)展。隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，利用分子育種、全基因組設計改良棉花農(nóng)藝、經(jīng)濟性狀，已成為解決上述問題的重要手段。隨著雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、亞洲棉（Gossypium arboreum）及陸地棉（Gossypium hirsutum）全基因組測序工作的完成，棉花遺傳學研究進入功能基因組時代[2-4]。

突變體是功能基因組學研究的重要材料[5]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）[6-7]、水稻（Oryza sativa）[8-9]等模式植物的功能基因組研究證明，突變體庫的建立在基因組的研究、功能基因的挖掘方面具有重要作用。小麥（Triticum aestivum）[10]、玉米 （Zea mays）[11]、大豆 （Glycine max）[12]、煙草（Nicotiana tabacum）[13]、蕃茄 （Solanum lycopersicum）[14]等糧食經(jīng)濟作物突變體庫的建立，加快了其基因功能的解析及遺傳育種進程。

采用物理[15-16]、化學[5-14]、分子生物學[17-18]等誘變方法構(gòu)建基因飽和突變體庫，進而通過突變體分析鑒定基因功能，是研究基因功能最直接、最有效的方法。甲基磺酸乙酯 （Ethyl methanesulfonate，EMS）是植物誘變中最常用的高效化學誘變劑之一，它主要使鳥嘌呤烷基化，從而與胸腺嘧啶錯配（C/G→A/T），誘發(fā)高密度的點突變，在株型（如矮化）、葉型（如葉片大小、葉色等）、花器（花瓣顏色、苞葉顏色、花器大小等）、育性及抗逆性等性狀產(chǎn)生變異，生物學上廣泛運用EMS誘變來創(chuàng)建突變體庫和誘變育種[5-14]。McCallum等[5]將EMS誘變與高效液相檢測技術結(jié)合形成了點突變高效自動化篩選方法TILLING技術。Abe等[8]利用EMS誘變構(gòu)建了一個日本水稻品種的突變體庫，通過對突變體與野生型雜交F2群體測序與SNP多態(tài)性分析繪制了其基因突變圖譜，并定位挖掘了一個調(diào)控水稻葉色及株高性狀的關鍵基因OsCAO1，為突變體篩選鑒定及遺傳改良農(nóng)作物性狀開辟了新的途徑。Parry等[19]利用EMS誘導創(chuàng)制了普通小麥的突變體庫，篩選出106個突變體，并定位到淀粉品質(zhì)相關的基因Wx-A1和株高相關基因GA20ox1A。Uchida等[20]利用全基因組測序?qū)MS誘變的擬南芥群體進行了分析。高速發(fā)展的新一代測序技術將廣泛應用于突變體庫的篩選與分析，這將為功能基因組學研究的飛速發(fā)展奠定基礎。Eduardo等[21]對4個擬南芥anu缺失突變體進行全基因組重測序，挖掘到SECA2、TOC33、NAP14和CLPR1這4個調(diào)控葉片形狀與葉色的關鍵基因。

雖然棉花遺傳學研究進入功能基因組時代，但仍處于初級階段，目前僅在陸地棉中見到突變體的誘導[22-23]，且主要用于誘變育種。亞洲棉是古老的二倍體（AA，2n=26）栽培棉種，在世界棉花基因庫中占有極其重要的位置，具有早熟、適應性廣、抗逆等優(yōu)良特性，有很高的研究與應用價值，是功能基因組研究的經(jīng)典遺傳資源材料[24]，但目前國際上尚未見報道創(chuàng)建亞洲棉突變體庫。因此，本研究以亞洲棉石系亞1號種子為材料，建立了亞洲棉EMS誘變體系，構(gòu)建突變體庫，并對突變體的形態(tài)性狀進行了初步鑒定，為深入研究棉花功能基因組、挖掘抗逆性狀調(diào)控相關功能基因等提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用亞洲棉石系亞1號種子，為亞洲棉基因組測序用的高代（18代自交）自交純合株系[3]，由國家棉花種質(zhì)中期庫杜雄明研究員提供。種子經(jīng)濃硫酸脫絨，蒸餾水沖洗干凈后晾干，精選后備用。試驗于2015年5月—2016年11月在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗地（河南安陽）、南繁基地（海南三亞）進行。

EMS購自Sigma公司（M0880-5G）。

1.2 實驗方法

1.2.1EMS誘變參數(shù)優(yōu)化。種子于28℃下磷酸緩沖液（100 mmol·L－1，pH 7.0）預浸12 h。隨后用磷酸緩沖液配置體積分數(shù)分別為 0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.5%的EMS溶液 （因素A1—A6），28℃黑暗條件下分別處理4 h、8 h（因素B1、B2），期間翻轉(zhuǎn)輕搖。處理后用蒸餾水沖洗3次，每次30 min，以去除殘留的EMS。每個濃度4次重復，每個重復處理100粒種子。種子直接種在砂床發(fā)芽盒中，置于恒溫培養(yǎng)箱中（28℃，光照12 h/黑暗12 h）培養(yǎng)12 d，每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)。

發(fā)芽率 = （發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總數(shù)）× 100%；

發(fā)芽勢=（第四天發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=ΣGt/Dt，式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽時間（d）。

1.2.2EMS規(guī)模誘變與M1代種植與觀察。為構(gòu)建亞洲棉突變體庫，2015年8月共處理石系亞1號種子約23 000粒。種子用0.6%（V/V）的EMS溶液室溫（28℃）黑暗條件下處理8 h后，播種于中棉所南繁基地試驗田。試驗采取間比法排列，每12行設置對照1行 （磷酸緩沖溶液處理的石系亞1號種子，即野生型）。田間栽培模式為：起壟覆膜、膜上打孔，膜寬0.9 m，一膜兩行，膜間距0.7 m，株距0.2 m。人工點播（每穴2粒）后，拉噴帶滴水1 h。常規(guī)田間管理，花蕾期進行自交。分別在子葉期、苗期、現(xiàn)蕾期、花期、鈴期及吐絮期調(diào)查植株田間性狀變異情況。吐絮后，按單株收獲M1代種子。

成株率=成苗株數(shù)／處理種子數(shù)×100%；

突變頻率=變異株數(shù)／成苗株數(shù)×100%.

1.2.3M2、M3代植株變異性狀鑒定。2016年4月，從M1代種子中挑選形態(tài)變異和無形態(tài)變異共5920份按單株單行條播種植于中棉所試驗田試驗田，行長5 m、行距0.8 m，每15行設置1行對照。2016年10月從M2代株系中挑選形態(tài)變異材料共計115份，按株系進行單行點播種植于中棉所南繁基地試驗田，行長5 m，覆膜噴灌，膜寬0.9 m、一膜兩行、膜間距0.7 m、株距0.2 m，每21行設置1行對照。全生育期調(diào)查記錄變異表型、變異株數(shù)量及比例，并對各突變表型進行拍照?；ɡ倨谶M行自交，分離的株系進行變異株單株收獲、非變異單株株行混收。

1.3 田間農(nóng)藝性狀指標調(diào)查

調(diào)查時期及性狀包括：（1）子葉期：子葉顏色；（2）苗期：葉色、葉形、株高、莖稈顏色；（3）蕾期：葉色、葉形、苞葉顏色、苞葉數(shù)、莖稈顏色；（4）花期：葉色、葉形、花瓣顏色；（5）鈴期：葉色、葉形、苞葉顏色、鈴型、棉鈴顏色；（6）吐絮期：棉纖維顏色、棉纖維長度。

1.4 亞州棉EMS誘變后代變異性狀可遺傳概率計算

EMS誘變農(nóng)藝性狀可遺傳突變率[25]=成株率×（M1代突變頻率×M1代變異性狀可遺傳比例+M2代突變頻率）×M2代變異性狀可遺傳比例。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行均值和標準差的計算及制圖，SAS 9.1軟件進行方差分析(ANOVA)與多重比較數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞洲棉EMS誘變參數(shù)的確定

對EMS誘變石系亞1號種子發(fā)芽試驗中EMS濃度和處理時間進行二因素多水平試驗設計，計算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)。結(jié)果顯示，EMS對石系亞1號棉花種子的萌發(fā)有抑制作用，隨著EMS濃度的增大、處理時間的延長，對種子發(fā)芽勢和活力的抑制作用越顯著、甚至致死。石系亞1號種子EMS誘變的最佳參數(shù)為：0.6%EMS溶液，28℃下黑暗處理8 h，此時種子的發(fā)芽勢為48%、發(fā)芽指數(shù)為18.84、發(fā)芽率為51%。

2.1.1EMS對種子萌發(fā)過程的影響。不同濃度的EMS處理后，種子活力降低，萌發(fā)延緩，抑制效應隨劑量的增大而增大，各處理間差異顯著 （P＜0.05）；隨EMS處理時間的延長，發(fā)芽率顯著降低（P＜0.05）。

發(fā)芽試驗結(jié)果顯示（表1）：當處理時間為B2時，種子萌發(fā)受抑制程度隨著EMS劑量提高而逐漸增大；當EMS濃度提升至A6水平以上時，種子活力、發(fā)芽勢及發(fā)芽率均接近為零，種子萌發(fā)抑制效應顯著 （P＜0.05）。當EMS濃度為A3時，種子萌發(fā)受抑制程度隨處理時間的延長而增大。其中處理時間水平由B1到B2時，發(fā)芽勢為由83%降至48%，發(fā)芽指數(shù)由47.19降至18.84，發(fā)芽率由84%降至51%，差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2亞洲棉EMS最佳誘變參數(shù)。EMS濃度和處理時長均顯著影響亞洲棉種子的萌發(fā)，二者間的交互作用對誘變處理的影響效應顯著。結(jié)果表明，A4B1、A2B2和A3B2處理，可作為亞洲棉種子EMS處理的適宜條件。鑒于通常使用對材料造成半致死效應的參數(shù)作為誘變的最佳參數(shù)[16]，本試驗選擇了A3B2處理，作為EMS最佳誘變參數(shù)用于后續(xù)的亞洲棉種子EMS突變體庫構(gòu)建。

表1 EMS不同濃度和處理時間對亞洲棉種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different concentrations of EMS and treat duration on seed germinationin Shixiya 1

2.2 亞洲棉種子EMS誘變M1代農(nóng)藝性狀鑒定

2015年8月，采用A3B2處理，對約23 000粒石系亞1號種子進行EMS處理，播種后獲得11 493棵M1代單株，成株率49.97%。分別在子葉期、苗期、蕾期、花期、鈴期及吐絮期，對誘變?nèi)后w的農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，篩選表型變異株。M1代植株表型豐富多樣，但多表現(xiàn)為畸形生長（圖1），M1代突變頻率為48.37%，其中主要為株型變異，占成苗株數(shù)的41.66%；其次是葉型變異，突變株頻率為6.24%（表2）。3354株M1代幼苗表現(xiàn)生長抑制，占成苗株數(shù)的29.18%，占株型變異株數(shù)的70.05%。兩個及以上性狀變異的株數(shù)為435，突變頻率為3.78%。由于EMS的毒害作用，大部分突變植株未能開花結(jié)鈴，最終收獲突變單株359份。

2.3 亞洲棉種子EMS誘變M2代農(nóng)藝性狀鑒定

2016年4月，從M1代單株種子中挑選359個變異單株和5561個表型正常的單株的種子共計5920份，按株行種植于中棉所試驗田，全生育期進行農(nóng)藝性狀鑒定。結(jié)果顯示（表2）：M1代變異性狀可遺傳比例為10.31%，主要為株型中的成熟莖稈紫化（M2株型變異材料中15株（4.18%），同時表現(xiàn)出花瓣及苞葉顏色紫化現(xiàn)象）；M2代新出現(xiàn)變異株數(shù)為788；變異類型主要還是葉型，如葉色黃化（突變頻率6.46%）、葉色白化（突變頻率1.03%）、葉片皺縮（突變頻率0.45%）等；其次是矮化、無莖尖等。

2.4 亞洲棉穩(wěn)定遺傳突變體的獲得

為了篩選穩(wěn)定遺傳的突變體，從M2變異株系中挑選115份表型明顯的材料，種于海南三亞，全生育期系統(tǒng)調(diào)查其后代M3代性狀。結(jié)果顯示，36份突變體表型與M2代表型一致。其中，葉色突變體24個，包括葉片黃斑化、葉片白化、葉片黃化3類（圖2 B-D）；株型突變體2個，包括在亞洲棉中發(fā)現(xiàn)零式果枝突變體1個 （圖2 F）；矮化突變體1個（圖2 G）；葉形突變體2個，分別為葉片皺縮和葉片卷曲；其他類型突變體8個，包括黃色棉鈴（圖2 E）、紫色莖稈和苞葉（圖 2 J）等。另外，這36個突變體收獲后，于2017年4月種于安陽，M4代表型與M3代表型完全一致 （數(shù)據(jù)未發(fā)表），表明這些變異可穩(wěn)定遺傳，是本次誘變獲得的新型突變體。

2.5 亞洲棉突變體變異性狀的可遺傳概率分析

根據(jù)EMS誘變成株率49.97%、M1代突變頻率48.37%、M1代突變株變異性狀可遺傳比例10.31%、M2代突變頻率14.17%及M2代突變株變異性狀可遺傳比例31.30%計算確定，在A3B2誘變處理條件下，亞洲棉石系亞1號種子后代發(fā)生可遺傳突變率為3.00%。從理論上講，每處理10 000粒種子，可獲得300份穩(wěn)定遺傳的突變體材料，這為后續(xù)棉花功能基因組的研究提供了支撐。

圖1 M1代典型突變體表型Fig.1 Representative mutant in M1plants

3 討論

種質(zhì)資源是作物育種和研究功能基因的重要基礎。人工誘變可以創(chuàng)制出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、矮化、早熟、抗逆等優(yōu)異農(nóng)藝性狀的新型種質(zhì)資源，豐富育種與遺傳研究的基礎材料。在諸多的誘變技術體系中，EMS誘變技術是發(fā)展最成熟、應用最廣泛的技術之一。

本研究以亞洲棉石系亞1號為試驗材料，探索了EMS誘變劑對亞洲棉種子萌發(fā)及植株形態(tài)的影響。通過誘變參數(shù)優(yōu)化、形態(tài)學鑒定及數(shù)據(jù)分析，初步建立了亞洲棉種子EMS誘變技術體系，并構(gòu)建了亞洲棉石系亞1號EMS突變?nèi)后w。0.6%EMS處理8 h，石系亞1號種子突變頻率高達48.37%，可遺傳突變率為3.00%，說明亞洲棉是較適合采用EMS誘變創(chuàng)制突變體庫的作物。本研究初步獲得了825份M2代突變體材料、36份可穩(wěn)定遺傳的M3代突變體材料，包含株型、葉型、花器、旱敏感等多種突變類型，是今后棉花功能基因組研究的寶貴材料。

表2 亞洲棉EMS誘變變異類型及頻率Table 2 Phenotype and frequency of EMS mutants of Shixiya 1

薛守旺等[26]指出，高濃度的EMS溶液造成植物損傷和不育，處理后的種子在發(fā)芽時生長停滯或死亡。EMS誘變時，劑量和處理時間不同，誘變效果不同。劑量越大、處理時間越長，致死率越高，突變?nèi)后w就會太少；劑量過低、處理時間過短，則變異不明顯，篩選效率太低。因此，根據(jù)不同的試驗條件，選擇最優(yōu)的誘變劑濃度和處理時間組合極為重要。此外，不同作物對EMS的敏感程度不同，EMS誘變的頻率也差異極大。葉俊等[9]利用0.4%EMS處理水稻種子8 h，創(chuàng)建了水稻“9311”突變體庫，突變頻率為5.62%。徐艷花等[27]利用0.8%EMS誘變處理普通小麥豫農(nóng)201種子12 h，突變頻率達11.44%。Herring等[22]利用3%的EMS處理陸地棉種子2 h，篩選獲得了纖維發(fā)育相關突變體材料。而穆國俊等[23]利用0.5%EMS處理陸地棉冀棉20種子4 h，篩選獲得了纖維改良突變體材料。本研究在前人研究基礎上，采用A3B2處理誘變亞洲棉種子，此時的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別為51%、18.84，可獲得3.0%的穩(wěn)定遺傳突變體，是石系亞1號的最佳誘變參數(shù)。

與其他作物EMS誘變結(jié)果相似，石系亞1號M1代的形態(tài)變異中，株型和葉型突變頻率最高，達41.66%和6.24%。大部分株型矮化變異是由于EMS毒性損傷引起，最后只收獲到71份株型矮化和1份旺盛生長的M1變異材料。下一代種于安陽后，只有10份材料的矮化性狀在M2代中可遺傳但有分離，M2代中新增320份植株矮化突變體；旺盛生長的單株后代生長依舊旺盛。由于EMS引起的變異多為隱性突變，且M1代容易形成嵌合體，不能穩(wěn)定遺傳[7,14]，因此在 M2代篩選尤為重要。此外，亞洲棉屬于二倍體，突變體在M2代即可純合，大大縮短了獲得穩(wěn)定突變體的年限。經(jīng)過3代篩選，本次誘變共獲得穩(wěn)定遺傳突變體36份，其中葉色、葉型變異最多，占67%。目前，棉花零式果枝突變體僅在四倍體棉屬中報道[28]，本次誘變得到的亞洲棉零式果枝突變體是首次在二倍體棉屬中發(fā)現(xiàn)，進一步豐富了棉花種質(zhì)資源庫，是棉花果枝發(fā)育機理研究的重要材料。更為重要的是，EMS誘變機理明確[20]，結(jié)合二代測序技術容易明確突變位點[7-8,29]，對于進一步定位和克隆相關基因以及棉花功能基因組研究具有重要意義。

圖2 部分EMS突變體表型Fig.2 New mutants from Shixiya 1 by EMS mutagenesis

受研究時間、工作量等因素限制，本研究僅分析鑒定了部分可見表型的突變體，下一步將針對產(chǎn)量（單株結(jié)鈴性、鈴重、籽指、衣分等）、品質(zhì)（纖維品質(zhì)、棉籽含油量、蛋白質(zhì)含量等）、抗逆（鹽堿、高溫、耐漬等）及抗病（棉花黃萎病和枯萎?。┑戎匾誀钸M行鑒定及變異率分析，進一步豐富棉花種植資源庫。

4 結(jié)論

本研究通過參數(shù)優(yōu)化建立了亞洲棉種子EMS誘變體系，構(gòu)建了亞洲棉石系亞1號M2突變?nèi)后w，篩選獲得了36份可穩(wěn)定遺傳的突變體株系，不僅豐富了棉花種質(zhì)資源，也為棉花功能基因組研究提供了寶貴材料。

[1]毛樹春,李付廣.當代全球棉花產(chǎn)業(yè)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2016:3-59.Mao Shuchun,Li Fuguang.Contemporary world cotton[M].Beijing:China Agriculture Press,2016:3-59.

[2]Wang K B,Wang Z W,Li F G,et al.The draft genome of a diploid cottonGossypium raimondii[J].Nature Genetics,2012, 44(10):1098-1104.

[3]Li F G,Fan G Y,Wang K B,et al.Genome sequence of the cultivated cottonGossypium arboretum[J].Nature Genetics,2014,46 (6):567-574.

[4]Li F G,Fan G Y,Lu C R,et al.Genome sequence of cultivated upland cotton(Gossypium hirsutumTM-1)provides insights into genome evolution[J].Nature Biotechnology,2015,33(5):524-532.

[5]McCallum C M,Comai L,Greene E A,et al.Targeting induced locallesionsingenomes(TILLING)for plant functional genomics [J].Plant Physiology,2000,123(2):439-442.

[6]Greene E A,Codomo C A,Taylor N E,et al.Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen inArabidopsis[J].Genetics,2003,164(6):731-740.

[7]Martín B,Ramiro M,José M Z,et al.A high-density collection of EMS-induced mutations for TILLING in Landsbergerectagenetic background ofArabidopsis[J].BMC Plant Biology,2009,9 (1):147.

[8]Abe A,Kosugi S,Yoshida K,et al.Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J].Nature Biotechnology,2012,30(2):174-179.

[9]葉俊,吳建國,杜婧,等.水稻“9311”突變體篩選和突變體庫構(gòu)建[J].作物學報,2006,32(10):1525-1529.Ye Jun,Wu Jianguo,Du Jing,et al.The screening of mutants and construction of mutant population for cultivar"9311"in rice(O-ryza sativaL.)[J].Acta Agronomica Sinica,2006,32(10): 1525-1529.

[10]Botticella E,Sestili F,Antonio H L,et al.High resolution melting analysis for the detection of EMS induced mutations in wheatSbellagenes[J].BMC Plant Biology,2011,11:156.

[11]祝麗英,池書敏,劉志增,等.甲基磺酸乙酯（EMS）在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應用[J].玉米科學,2001,9(3):14-17.Zhu Liying,Chi Shumin,Liu Zhizeng,et al.Application of EMS to create corn new germplasm[J].Journal of Maize Sciences,2001,9(3):14-17.

[12]韓鎖義,張恒友,楊瑪麗,等.大豆“南農(nóng)86-4”突變體篩選及突變體庫的構(gòu)建[J].作物學報,2007,33(12):2059-2062.Han Suoyi,Zhang Hengyou,Yang Mali,et al.Screening of mutants and construction of mutant population in soybean"Nannong 86-4"[J].Acta Agronomica Sinica,2007,33(12):2059-2062.

[13]劉曉蓓,吳賡,張芊,等.煙草突變體庫的創(chuàng)建策略及其應用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2010,12(6):28-35.Liu Xiaobei,Wu Geng,Zhang Qian,et al.Strategy and application for construction tobacco mutant library[J].Journal of Agricultural Science and Technology,2010,12(6):28-35.

[14]Shirasawa K,Hirakawa H,Nunome T,et al.Genome-wide survey of artificial mutations induced byethylmethanesulfonate and gamma rays in tomato[J].Plant Biotechnology Journal,2016, 14(1):51-60.

[15]Mesken M,Veen J V.The problem of induced sterility:a comparison between EMS and X-rays inArabidopsis thaliana[J].E-uphytica,1968,17:363-370.

[16]Kaul M L,Bhan A K.Mutagenic effectiveness and efficiency of EMS,DES and gamma-rays in rice[J].Theoretical and Applied Genetics.1977,50(5):241-246.

[17]Michielse C B,Hooykaas P,Hondel C,et al.Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J].Current Genetics,2005,48(1):1–17.

[18]Yang Z R,Zhang C J,Yang X J,et al.PAG1,a cotton brassinosteroid catabolism gene,modulates fiber elongation[J].New Phytologist,2014,203(2):437-448.

[19]Parry M,Madgwick P,Bayon C,et al.Mutation discovery for crop improvement[J].Journal of Experimental Botany,2009,60 (10):2817-2825.

[20]Uchida N,Sakamoto T,Kurata T,et al.Identification of EMS-induced causal mutations in a non-referenceArabidopsis thalianaaccession by whole genome sequencing[J].Plant and Cell Physiology,2011,52(4):716-722.

[21]Eduardo M,Ruben C,Candela H,et al.Rapid identification ofangulata leaf mutations using next-generation sequencing[J].Planta,2014,240(5):1113-1122.

[22]Herring A,Auld D,Ethridge M,et al.Inheritance of fiber quality and lint yield in a chemically mutated population of cotton [J].Euphytica,2004,136(3):333-339.

[23]穆國俊.棉花有益突變體的創(chuàng)制及突變性狀的分子遺傳學鑒定[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2008.Mu Guojun.Creation and molecular genetical identification of the beneficial mutants in upland cotton(Gossypium hirsutumL.) [D].Baoding:Agricultural University of Hebei Province,2008.

[24]周忠麗.我國保存亞洲棉的遺傳多樣性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2011.Zhou Zhongli.Study on genetic diversity ofG.arboreumL.germplasm resources conserved in China[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultura Sciences,2011.

[25]王慧麗,張海洋,馬琴,等.芝麻EMS誘變條件優(yōu)化與突變體篩選[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2017,46(1):36-41.Wang Huili,Zhang Haiyang,Ma Qin,et al.Optimization of EMS mutagenesis condition and screening of mutants in sesame [J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2017,46(1):36-41.

[26]薛守旺,周洪生,鄧迎海,等.化學誘變及其在玉米育種上的應用[J].玉米科學,1998,6(2):10-13,17.Xue Shouwang,Zhou Hongsheng,Deng Yinghai,et al.Chemical mutagenesis and its application on maize breeding[J].Journal of Maize Sciences.1998,6(2):10-13,17.

[27]徐艷花,陳鋒,董中東,等.EMS誘變的普通小麥豫農(nóng)201突變體庫的構(gòu)建與初步分析[J].麥類作物學報,2010,30(4): 625-629.Xu Yanhua,Chen Feng,Dong Zhongdong,et al.Construction and analysis of EMS induced mutant library of hexaploid wheat cultivar Yunong 201[J].Journal of Triticeae Crops,2010,30(4): 625-629.

[28]Chen W,Yao J,Li C,et al.Genetic mapping of the nulliplex-branch gene(gb_nb1)in cotton using next-generation sequencing[J].Theoretical and Applied Genetics,2015,128(3): 539-547.

[29]Zhu Y,Mang H G,Sun Q,et al.Gene discovery using mutagen-induced polymorphisms and deep sequencing:application to plant disease resistance[J].Genetics,2012,192(1):139-146.

Optimization of EMS Mutagenesis Condition and Screening of Mutants inGossypium arboretumL.

Kong Depei1,2,Qu Lingbo1,Zhang Xueyan2,Liu Ji2,Wang Peng2,Li Fuguang2*
(1.Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology,Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Anyang,Henan455000,China)

[Objective]This research aimed to clarify the optimization of EMS concentration and treat duration on mutation ofGossypium arboretumL.and create excellent mutants library.[Method]Seeds ofGossypium arboreumline Shixiya1 were immersed in EMS solutions with volume fraction ranging from 0.4%to 1.5%by 4-8 h.Then,the seed germination index and seedling growth were analyzed and the morphological character of M1,M2,and M3generation were identified.[Result]The treatment with 0.6%EMS for 8 h was appropriate for Shixiya 1 mutagenesis.Under this treatment conditions,the seed germination index and the germination rate were 18.84 and 51%,respectively.To obtain abundant mutants,approximated 23 000 seeds of Shixiya 1were treated with 0.6%EMS for 8 h.5559 mutants were screened out from M1generation,825 and 57 from M2and M3, respectively.The mutation frequency of Shixiya 1 was 48.37%.The mutation frequency of leaf type variants,plant type variants were the highest in M2,which were 8.0%and 5.9%,respectively.The inheritable frequency of mutant characters from M2generation to M3generation was 31.30%,and the mutant frequency of M3generation was 18.26%.[Conclusion]This study have established the EMS mutagenesis system ofGossypium arboreumline Shixiya 1,and created 36 steadily inherited mutants.The mutant library we constructed will be a very useful genetic resource for functional genomics and genetic improvement in cotton.

ethyl methanesulfonate;Gossypium arboretumL.;mutant library;variation character;Shixiya 1

S562.035.2

A

1002-7807(2017)04-0336-09

10.11963/1002-7807.kdplfg.20170703

2017-03-29

孔德培（1987―），男，碩士研究生，助理研究員，kongdepei1987@163.com。*通信作者：aylifug@163.com

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（1610162016011）；國家自然科學基金聯(lián)合基金（U1303282）